Eksperimentaalne töö allogeensete keratinotsüütide siirdamise kohta kunstlikult loodud valgetele rottide armidele

Soov kasutada rakulist potentsiaali ja vajadus leida uusi tõhusaid meetodeid armide esteetilise väljanägemise parandamiseks viis ideeni proovida uurida keratinotsüütide siirdamise võimalust armide pindadele.

Keratinotsüütide kultuuri kasutamise tõenäosuse tõestamiseks armide välimuse parandamiseks viidi läbi eksperimentaalne uuring valgete laborirottidega, kellele loodi armpinnad. Roti armi mudel saadi seljale, selgroole, kunstlikult tekitatud haavade paranemise tulemusena. Rottidelt lõigati välja identsed nahatükid, suurusega 2x3 cm. 2,5 kuud pärast "armide modelleerimise" operatsiooni tehti rottidele dermabrasioon (armi ülemiste kihtide eemaldamine termokaustikumi abil) ja neile siirdati allogeensed keratinotsüüdid, mis eraldati rotipoegade nahast 2-4 päeva pärast sündi.

Rottide epidermaalsete rakkude eraldamine ja kultiveerimine viidi läbi Venemaa Teaduste Akadeemia Tsütoloogia Instituudi rakutehnoloogia laboris, kasutades järgmist tehnoloogiat.

Nahka pesti Hanki soolalahuses, mis sisaldas 200 U/ml gentamütsiini, ja lõigati väikesteks tükkideks, pindalaga 0,2–0,5 cm2 ^. Nahatükke inkubeeriti 0,5% dispaasi lahuses tasakaalustatud soola fosfaatpuhverdatud lahuses temperatuuril 37 °C 1 tund. Seejärel viidi tükid Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahusesse ja epidermis eraldati dermisest. Epidermist inkubeeriti 0,125% trüpsiini lahuses 10–15 minutit segades kiirusel 50 p/min, mille järel ensüümi toime peatati 5% loote veise seerumi lisamisega. Saadud rakkude suspensioonist kasutati ühte kolmandikku puhtal kujul armidele siirdamise üheks võimaluseks, teist kolmandikku kasvatati bioühilduvatel kodumaistel kilekatetel "Polypor" ja kolmandat Petri tassidel ilma substraadita. Saadud armide dermabrasioon rottidel koos järgneva roti epidermise rakkude siirdamisega neile viidi läbi eetrianesteesias, kasutades termilist kauteerrit.

Esimeses rottide rühmas asetati pärast dermabrasiooni armi poleeritud, füsioloogilise lahusega pestud ja kuivatatud pinnale steriilsed kambriumi tükid, millele kanti allogeensete roti epidermotsüütide loksutatud suspensioon kontsentratsiooniga 1,5 miljonit rakku 1 ml kohta (vastavalt tsütoloogia instituudi andmetele). Kambriumi tükid asetati poleeritud armile nii, et rakud asetsesid armi pinnal. Peale pandi mitmest marlikihist koosnev side, mis õmmeldi armi servade külge.

Osa saadud rakususpensioonist külvati Petri tassidesse steriilsetele Polypore kiledele, mis olid lõigatud tasside kuju järgi, teine osa - kileta Petri tassidele. Kultiveerimine viidi läbi FAD söötmes, mis koosnes DMEM ja F12 söötme segust vahekorras 3:1, lisades 10% loote veise seerumit, 5 μg/ml insuliini (Sigma), 0,5 μg/ml hüdrokortisoonhemisuktsinaati (Sigma) ja 10 μg/ml epidermaalse kasvufaktori EGF-i (RAS Tsütoloogia Instituut, Peterburi). Teist ja kolmandat rottide rühma, mõlemat 7 isendit, opereeriti 6 päeva pärast esimest. Selleks ajaks olid Petri tassidesse külvatud keratinotsüütide suspensioonist moodustunud mitmekihilised kihid, mis siirdati rottidele. Teisele rühmale siirdati epidermotsüüdid kilele, kolmandale - mitmekihiline kiht ilma substraadita. 7 päeva pärast siirdati saadud mitmekihilised allogeensed keratinotsüütide (MPALK) kihid, mis olid külvatud "Polypore" kiledele, kultuurina otse haava pinnale. Kile rebenemise vältimiseks kinnitati see mitmekihilise marlisidemega ja õmmeldi rottide nahale.

Enne keratinotsüütide siirdamist kolmandale substraadita kasvatatud rottide rühmale eraldati PAC Petri tassi põhjast, töödeldes seda dispaasiga, millel on võime selektiivselt katkestada naha ja epidermi sidemeid. Mitmekihilisele kihile toimides katkestab dispaas basaalkihi rakkude ühenduse Petri tassi põhjaga ja avaldab palju vähem mõju rakkudevahelistele ühendustele, mis võimaldab kihi täielikult "eemaldada". Mitmekihilise rakukihi eraldamine dispaasiga viidi läbi järgmiselt. Transpordikeskkond tühjendati Petri tassidest, rakukihte pesti kolm korda antibiootikume, eelkõige gentamütsiini (0,2 mg/ml), sisaldava toitekeskkonnaga. Mitmekihilised kihid täideti 0,125% dispaasi lahusega ("Sigma") ja asetati termostaati, kus neid inkubeeriti temperatuuril 37 °C 20-30 minutit. Valge ääre ilmumine kihi perifeeriast koorudes viitab selle eraldumisprotsessi algusele Petri tassi servadest ja põhjast. Mõni minut pärast eraldusprotsessi algust kurnati dispase lahus ja epiteelikihte pesti 2-3 korda söötmega. Epidermise kihi pinnale kanti topsi suuruseks lõigatud steriilse haavasideme "Lita-color" tükk, millele kleebiti dispase abil eraldatud kiht, mis oli topsi põhjast spaatliga täiendavalt maha kooritud. Silmapintsettide abil rebiti kiht koos "Lita-color" (Venemaa) salvrätiku kattega Petri tassi põhjast lahti ja kanti ettevaatlikult armi ettevalmistatud pinnale. "Lita-color" salvrätikud sisaldavad gentamütsiini ja eksoliini (kollageeniekstrakt), mis kasvukeskkonna jäänustega ja seejärel füsioloogilise lahusega niisutades paisusid ja muutusid kaasaegseks haavasidemeks, pakkudes head kaitset välise nakkuse eest ja kiiret paranemist tänu niiskust imavale struktuurile.

Polypore'i kiledele ja Lita-color salvrätikutele kanti mitmekihilised marlisidemed ning õmmeldi need rottide nahale tugevamaks fikseerimiseks. Iga rott paigutati eraldi puuri, et luua optimaalsed tingimused selle säilitamiseks ja siirdatud keratinotsüütide kinnitumiseks. Rottide sidemeid, kuhu siirdati suspensioon ja dispase'i abil eemaldatud epidermotsüütide mitmekihiline kiht, niisutati mitu korda päevas steriilse soolalahusega, et luua rakkude kinnitumiseks kõige soodsamad tingimused. Arvestades, et Polypore'i kile oli vett mitteläbilaskev, ei niisutatud teise rühma rottide sidemeid, mis oli üks eeliseid kiledeta siirdamise ees. Sidemed eemaldati 10 päeva pärast. Armide kliiniline pilt pärast rakkude siirdamist erines siirdamata armidest vähe, välja arvatud nende roosam värvus (dermabrasiooni tõttu) ja suurem koorumine. See asjaolu viitab sellele, et kohe pärast haavasidemete mahalangemist MPC-ga ei toimunud armis mingeid muutusi.

Biopsiamaterjali võtmine rottidelt.

1, 2, 5 ja 9 kuud pärast roti allogeensete keratinotsüütide siirdamist valgete rottide poleeritud armidele võeti materjali histoloogiliseks, tsütomorfoloogiliseks ja elektronmikroskoopiliseks uuringuks. Kontrolliks võeti normaalse roti naha ja rakkude siirdamata armi proovid. Rottidele manustati eeteranesteesia.

Pärast anesteesiat võeti märgistatud piirkondadest armkoe tükid, kuhu siirdati keratinotsüüdid 2 mm läbimõõduga biopsiaaugu abil, ja asetati need 2,5% glutaraldehüüdi lahusesse, et valmistada materjal ette elektronmikroskoopiliseks uuringuks. Histoloogiliseks uuringuks võetud koetükid asetati 10% neutraalsesse formaldehüüdi lahusesse, seejärel juhiti need läbi alkoholide ja sisestati parafiini, seejärel lõigati neist üliõhukesed lõigud ja vaadati neid valgusoptilises mikroskoobis.

Kontroll I. Normaalne roti nahk.

Selleks, et näha erinevust normaalse armistunud roti naha mikroskoopilise pildi ja MPC siirdamise järgselt teatud aegadel tekkinud armide vahel, on käesoleva uuringu kõigis etappides näidatud nende fotod ja kirjeldused.

Normaalse naha epidermis koosneb 7-9 rakkude kihist. Sarvkiht on mõõduka paksusega. Mõnes kohas koosneb see 6-8 sarvkestade kihist. Basaalkihti esindavad silindrilised rakud, millel on suured, heledad, korrapärase kujuga tuumad ja mitu nukleooli. Desmosomaalsed ühendused rakkude vahel ja basaalmembraaniga on selgelt väljendunud. Hästi määratletud basaalmembraani all, millel on väikesed väljakasvud subepidermaalses kihis, paiknevad sellega paralleelselt õrnad kollageeni- ja elastiinikiudude kimbud, mille hulgas on piklikud fibroblastid, väikesed veresooned. Sügavamates kihtides paiknevad kollageeni- ja elastiinikiudude kimbud erinevates suundades. Nende hulgas on palju sama kaliibriga õhukeste seintega veresooni, rakulisid elemente (fibroblastid, nuumrakud, leukotsüüdid). Suur hulk karvanääpse, rasunäärmeid.

Kontroll 2. Roti arm, 2 kuud vana.

Kliiniline pilt. Armid on kahvaturoosad, kooruvad, kohati on jäänud koorikud. Nende pindala on kollageenkiudude kokkutõmbumise tõttu vähenenud ja on umbes 3,0–3,5 cm ^. Nahamanused puuduvad.

Mikroskoopiline pilt. Epidermis koosneb 3-5 volditud rakkude kihist, mida esindavad ümarad basaalrakud, üks rida subulaate, 1-2 rida granuleeritud rakke keratohüaliiniteradega ülemises kihis, esineb rakusisese turse alasid. Sarvkiht muutub ebaühtlaselt väga õhukesest paksenemiseni. Armkoe (kokkutõmbumise) tõttu on täheldatud armkoe voltimist. Voldid tungivad papillaarseinde ja loovad papillide mulje. Epidermise ja dermise piir on sirge. Basaalmembraani pole kõikjal näha. Epidermise alaosas ja sügavamates kihtides on paksu, lõdvestunud seinaga veresooned, paljud neist on inimtühjad ja seisavad. Veresoonte ümber on kogunenud makrofaagid, fibroblastid. Makrofaagid ümbritsevad kapillaaridest vabanevaid erütrotsüüte ja fagotsüteerivad neid. Pindmiste kihtide pealiskaudsetes kihtides on väikesed kapillaarid. Epidermise all paiknevad kollageenkiud lõdvalt. Armi sügavamas kihis on jämedad kollageenkiudude kimbud, mille hulgas on palju fibroblaste.

Roti arm üks kuu pärast roti keratinotsüütide siirdamist.

Kliiniline pilt. Armid on roosad, nende pindala on vähenenud, eriti läbimõõdu poolest, ja on keskmiselt 2,5–3 cm ². Juuksed ja rasunäärmed puuduvad.

MPaLK siirdamise teel rottidelt saadud materjali mikroskoopilise uuringu andmed kilele ja substraadita MPaLK siirdamise teel on praktiliselt identsed. Puhttehniliselt on MPaLK-ga ilma substraadita töötamine aga palju keerulisem ja vaevarikkam kui MPaLK kasvatamine substraadil, seetõttu kasutasime keratinotsüütide armidele siirdamise küsimuse edasisel uurimisel kasvatamise alusena ("substraadid") mitmekihilist kambriumi.

Mikroskoopiline pilt. Täheldatakse epidermise paksenemist 15-20 kihini, peaaegu keskelt ulatuvatel keratinotsüütidel on kitsas, piklik, vertikaalne kuju ja kompaktne paigutus. Basaalrakud paiknevad ebaühtlasel joonel. Nende tuumad on heledad, suured, ümarad, ühe või kahe nukleooliga, mis näitab nende kõrget sünteetilist ja proliferatiivset aktiivsust. Epidermise ja dermise vaheline piir on sirge. Ogakiht on hästi arenenud, koosneb 3-5 ümarate rakkude kihist, on 2-nukleaarset rakku.

Vahetult basaalmembraani all paiknevad tihedalt paiknevad õhukesed kollageenkiudude kimbud, nendega paralleelselt kulgeb suur hulk kõrbenud veresooni, sügavamal asuvad kollageenkiud on jämedamad, kogunenud tihedatesse kimpudesse. Palju suuri fibroblaste, nuumrakke (vaateväljas 2-3), makrofaage, leukotsüüte ja kõrbenud veresooni, mille seinad on lõdvestunud, nende ümber paiknevad lõdvalt kollageenkiud. Mõnes veresoones esineb staas, moodustunud elementide diapedees. Veresoonte ümber on fibroblaste, üksikuid lümfotsüüte. Naha manused puuduvad.

Keratinotsüütide suspensiooni siirdamisel poleeritud armile erineb mikroskoopiline pilt eelmisest. Enamikul loomadel on epidermis õhuke ja koosneb 5-6 rakkude kihist. Alumine kiht koosneb ebakorrapärase, hulknurkse kujuga rakkudest, mille tuumad on ümara-ebakorrapärase kujuga. Epidermaalkihi seisund on sarnane selle olekuga loomade rühmas, kellel ei olnud MPALK siirdamist tehtud.

Sellisel juhul võime rääkida kas rakkude siirdamisega kaasnevate protsesside hilinemisest või suspensiooni kujul siirdatud rakkude suurest kadumisest. Seega tehti järeldus armide korrigeerimise ebaotstarbekusest keratinotsüütide siirdamise teel suspensiooni kujul.

Roti arm 2 kuud pärast roti keratinotsüütide siirdamist.

Kliiniline pilt. Arm on õhuke ja õrn. Kohati on täheldatud koorumist ja ketendavaid laike.

Mikroskoopiline pilt. Sarvkiht on paksenenud, kohati - hüperkeratoos. Epidermis on paksenenud, koosneb 12-20 rakureast. Epidermise ja dermise vaheline piir on sirge. Epidermise all asuvad õrnad kollageenikiud üsna tihedalt. Armi sügavamates kihtides on need kogunenud suurtesse jämedatesse kimpudesse. Epidermise all olevas kihis ilmuvad uued veresoonte moodustised. Armkoe alumistes kihtides on palju epidermise pinnaga paralleelselt paiknevaid mahajäetud veresooni. Suured fibroblastid on armi paksuses ühtlaselt jaotunud, seal on hiiglaslikke, mitmeharulisi, palju makrofaage.

Roti arm 5 kuud pärast roti epidermise rakkude siirdamist.

Kliiniline pilt. Arm on ühtlane, sile, ilma koorumiseta, esineb üksikuid karvu, nende tihedus on armide äärealadel suurem, mis viitab karvanääpsude marginaalsele sissekasvule armi ja uute karvanääpsude moodustumisele. Armide pindala väheneb jätkuvalt.

Mikroskoopiline pilt. Epidermis on endiselt paks (15-20 kihti, mõnes kohas kuni 30), ülemistes kihtides on see täidetud keratohüaliiniteradega. Selgelt on näha basaalmembraan. Selle all paiknevad kollageenikiud lõdvalt. Alumistes kihtides on kollageen võimsam ja tihedamalt pakitud. Kollageenikimpude hulgas on palju kapillaare. Ülemistes kihtides on hüljatud veresoonte arv vähenenud. Epidermise ja dermise ühenduskoht on kergelt laineline. Mõnes kohas on armkoes sügavaid epidermise väljakasvu. Kollageenikiudude hulgas on näha äsja moodustunud veresooni. Ilmuvad üksikud karvanääpsud ja rasunäärmed.

Roti arm 9 kuud pärast roti epidermaalsete MPA rakkude siirdamist.

Kliiniline pilt. Armid on varasemate perioodidega võrreldes oluliselt väiksemad, nende pindala on keskmiselt umbes 1,5–2,0 cm2 ^. Armid on ebaühtlaselt kaetud peene karvaga, eriti perifeerias. Järele on jäänud vähene peenike koorumine.

Mikroskoopiline pilt.

Epidermis on muutunud õhemaks, seda esindab 6-8 rakurida, struktuurilt sarnaneb normaalse roti naha epidermisega, ainult rakkude tihedus on 1 mm suurem ja need on väiksemad. Basaalkiht koosneb väikestest ümarsilindrilistest rakkudest. Basaalmembraan on hästi väljendunud, hemidesmosoomid on selgelt nähtavad. Märgitakse epidermise väljakasvude olemasolu subepidermaalses kihis. Papillaarne kiht on väljendunud kogu armi pikkuses. Need faktid näitavad, et selleks ajaks on siiratud keratinotsüütide adhesioon aluskoega palju tugevamaks muutunud. Seetõttu võib armihooldus MPALK siirdamisega inimestel 9 kuud pärast MPC siirdamist olla traditsiooniline. Epidermise all on kollageenikiud õrnemad kui sügavates kihtides. On ilmunud palju veresooni, eriti pindmisi. Suuremate veresoonte seinad on paksenenud. Juuksefolliikuleid ja rasunäärmeid on suures koguses. Mikroskoopiline pilt meenutab nahasarnast kude.

Eksperimentaalse töö tulemused ja nende arutelu.

Selle töö käigus siirdati pärast dermabrasioonkirurgiat kunstlikult loodud roti nahaarmidele erinevas vormis keratinotsüüte - haavakatetele, suspensioonina kambriumile ja mitmekihilise kihina ilma substraadita. Töö viidi läbi eesmärgiga saada morfoloogilisi andmeid siiratud allogeensete keratinotsüütide mõju kohta armidele, samuti määrata kindlaks optimaalsed siirdamisvõimalused.

Leiti, et kõik kolm siirdamismeetodit on teostatavad, kuid MPAC-i siirdamine ilma substraadita on väga töömahukas protseduur, mille käigus võib MPAC vigastada, mis mõjutab siirdamise tulemusi. Lisaks välistab see siirdamismeetod töö suurtel pindadel.

Keratinotsüütide suspensiooni siirdamine on palju kuluefektiivsem meetod, ei vaja pikaajalist rakkude kultiveerimist ja on meie pakutud versioonis lihtne, kasutades steriilseid kambriumtoorikuid, mille suurused vastavad armide suurusele. Terapeutilise efekti edasilükkumine rakususpensiooni siirdamisel umbes kuu võrra võrreldes MPC-ga haavakattele ei ole mitmekuulise ravi kestuse korral oluline punkt. On teada, et MPC siirdamisel põletuspatsientidele toimub naha struktuuri muutumine järk-järgult ja mitme aasta jooksul. Keratinotsüütide kultuuri siirdamine haavakattele on kõige mugavam ja paljutõotavam meetod, kuid ka oluliselt kallim. Lisaks nõuab see praegu otsimist täiustatud katmisvõimaluste järele, mis peaksid olema elastsed, hügroskoopsed, omama bakteriostaatilisi või bakteritsiidseid omadusi ja olema rakkude suhtes bioloogiliselt neutraalsed. Kile "Polypor" - kodumaise kilehaavakatte vaheversioon - võimaldas vaatamata mõningatele puudustele uurida katses roti keratinotsüütide siirdamist armidele ja teha järeldusi selle armiravi suuna efektiivsuse kohta.

Põletushaavadele MPC-d siirdanud autorid märkisid, et esimese nädala jooksul pärast mitmekihilise keratinotsüütide kihi siirdamist desinfitseeritud haavadele epidermis paksenes ja kihistus. Kõik epidermise kihid olid selgelt nähtavad. Huvitaval kombel oli rakukihtide arv siirdatud kudedes 10–30% suurem kui nahabiopsiates. Autorid märkisid keratohüaliini graanulite ilmumist 5. päeval pärast MPC siirdamist ning basaalmembraani ja hemidesmosoomide ilmumist juba 3. päeval.

J.Rives jt (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM jt (1998) leidsid, et MPC siirdamise varajastes staadiumides patsientidele, kellel on pärast põletusi täispaksuselised nahadefektid, on dermise ja epidermise vaheline ühendus väga nõrk ja sirgjooneline, papillaarne kiht puudub. Teise kuu lõpuks hakkavad tekkima madalad papillid ja nahamanused, dermise ja epidermise vaheline ühendus tugevneb. Kirjanduse andmed näitavad, et allogeensete keratinotsüütide siirdamine põletuspatsientide haavadele on paljutõotav meetod. Vaatamata asjaolule, et allogeensete keratinotsüütide hülgamine toimub erinevate autorite sõnul 10 päeva kuni 3 kuu jooksul, täidavad nad siiski oma rolli haavapinna paranemisel, kasvufaktorite sekreteerimisel ja defekti mehaanilisel sulgemisel. Arvatakse, et MPALC-idel on vähenenud antigeenne aktiivsus, kuna in vitro kultiveerimise käigus kaotavad nad Langerhansi rakke, mis võimaldab neil retsipiendi kehas pikka aega eksisteerida. Lisaks on noorte tervete inimeste nahalt saadud allogeensel kultuuril võrreldamatult suurem bioloogiline potentsiaal kui vigastuse järel patsientide autoloogsel kultuuril.

Meie uuringu peamine eesmärk oli välja selgitada, kas allogeensed keratinotsüüdid hakkavad armidesse kinnistuma ja millised muutused toimuvad armkoes sellise bioloogiliselt aktiivse "haavakatte" mõjul. Positiivse tulemuse korral töötada välja kõige tõhusam ja kõige vähem töömahukas tehnoloogia selle taastusravi meditsiini valdkonna jaoks.

Saadud andmed olid mitmes mõttes sarnased kirjanduses leiduvate andmetega inimese epidermises toimuvate morfoloogiliste muutuste kohta pärast allogeensete keratinotsüütide siirdamist põletushaavadele. Siiski on ka olulisi erinevusi nii morfoloogilise substraadi, millele siirdamine toimub, kui ka tehnoloogia osas. Seega toimub basaalmembraani ja dermaal-epidermaalsete ühenduste (hemidesmosoomide, papillide) moodustumise protsess hilisemas staadiumis võrreldes keratinotsüütide siirdamisega haavapindadele ilma armide muutusteta. Ilmselt on see tingitud armkoe kehvemast toitumisest võrreldes dermise või lihasfastsiaga. Arm, eriti vana, on tihe sidekude, milles on väga vähe veresooni, samas kui põletushaava põhi on veresoonterikas granulatsioonkude. Seega on ilmne, et tingimused, mille alusel keratinotsüütide siirdamine ja siirdumine toimub, on absoluutselt erinevad. Mida vaskulariseeritud on rakkude siirdamise piirkond, seda lihtsam on nende siirdamise protsess. Sellest postulaadist tuleneb järeldus, et eelistatakse töötada noorte armidega, mille sidekude on veel üsna lõtv ja veresoonterikas.

Selle eksperimentaalse töö tulemusena tõestati, et:

1. MPALK-i siirdamine armidele on võimalik.
2. Optimaalne siirdamismeetod on keratinotsüütide siirdamine haavakattele.
3. Armi pinda tuleks poleerida kirurgilise laserdermabrasiooni või Schumanni lõikuriga.
4. MPALKi mõjul toimub armi poleeritud pinna kiire epiteeliseerumine.
5. Mida paremini on armkude vaskulariseeritud, st mida noorem on arm, seda paremad on keratinotsüütide siirdamise tulemused.
6. Siirdatud keratinotsüütide mõjul muutub armkude järk-järgult naha sarnaseks (lahtisemaks armkoeks naha lisanditega).
7. Armkoe järkjärguline lõdvenemine, alustades subepidermaalsest kihist. Selle vaskularisatsioon paraneb, armi ülemises ja alumises osas asuvad kollageenikiudkimbud paigutuvad lõdvemalt kui armkoes ilma rakkude siirdamiseta. Ilmuvad juuksefolliikulid ja rasunäärmed. Epidermis, olles läbinud hüpertroofiafaasi, läheneb oma struktuurilt normaalse naha epidermisele.
8. Täheldatud muutused on seotud keratinotsüütide poolt eritatavate kasvufaktorite ja tsütokiinidega, mis armkoe trofismi parandamise kaudu soodustavad selle muundumist jämedast kiulisest koest kobedamaks koeks, mis viib armi välimuse paranemiseni.

Seega võib selle uuringu põhjal järeldada, et siirdatud keratinotsüütidel on armkoele kasulik mõju, millel võib olla praktiline mõju erinevat tüüpi armidega patsientide taastusravile.

See rottidega tehtud töö võimaldas meil formuleerida ka nõuded haavakatetele, millel keratinotsüüte kasvatatakse.

Haavasidemed peaksid olema:

• rakkudega bioühilduv,
• hingav
• omama elastset, vormivat alust,
• olema hüdrofiilne,
• kuna meditsiinilised lisandid sisaldavad antibakteriaalseid ravimeid ja antioksüdante, mis ei ole kultiveeritud rakkudele toksilised.

Armide biotehnoloogilise ravi kliinilised tulemused.

Varem leidsid N. Carver jt (1993), et oklusioonsidemed soodustavad kõige paremini haavale kinnitumist ja keratinotsüütide ellujäämist, kuid ei võimalda kihistunud (küpse) epidermise teket. Kihistunud epidermise tekkeks on vajalik õhukeskkond. Seetõttu tehti ettepanek pärast mitmekihilise kihi kinnitumist oklusioonsideme 7-10 päeva pärast eemaldada ja haavu ravida kuivade sidemete või vees lahustuvate salvidega. Võib öelda, et rakkude kasvatamise aluseks oleva "substraadi" kvaliteet ja omadused on väga oluline punkt rakulise materjali siirdamise efektiivsuse ja seega ka arstide töö tulemuste seisukohalt. Kuid tänapäeval pole ideaalset haavasidet, hoolimata pakutud võimaluste rohkusest (kunstnahk, karboksümetüültselluloosist valmistatud lausriie, fibriinkatted, poolläbilaskvad polüuretaankiled). Oluline punkt selles küsimuses on "substraatide" (spetsiaalsete haavakatete) maksumus, kuna nende kõrge hind suurendab biotehnoloogilise ravi üldkulusid.

Rakutehnoloogiate efektiivsus on tänaseni tõestatud, kuid kahjuks on need tehnoloogiad väga kallid, eriti riikides, kus rakukompositsioonide tööstuslik tootmine pole veel välja kujunenud. Siiski on sellised riigid nagu Ameerika Ühendriigid juba ammu loonud tööstusharu põletuste siirdamiseks mõeldud rakumaterjali tootmiseks. Eelkõige on ettevõte BioSurface Technology Inc. alates 1989. aastast kasvatanud 37 000 mitmekihilist keratinotsüüdi kihti, mida kasutati 240 patsiendi ravimiseks 79 riigis üle maailma (R. Odessey, 1992), samas kui 1 cm2 ^rakukultuuri maksab umbes 7-8 USA dollarit.

Erinevate nahahaiguste ja -probleemide ravimise tehnoloogial on mitmeid erinevusi, kuid igasugune rakuravi põhineb kvaliteetse rakumaterjali saamisel ja selle siirdamisel.

See protsess koosneb järgmistest sammudest:

• ohvritelt (või doonoritelt) naha võtmine
• nahaklappide transportimine biotehnoloogiakeskusesse,
• basaalkihi rakkude isoleerimine ja nende proliferatsioon,
• mitmekihiliste keratinotsüütide kihtide (MLK) kasv.
• rakukultuuri siirdamine.

Mitmekihiliste keratinotsüütkihtide siirdamisega ravi peamine probleem on elujõuliste rakkude vajadus rakkude siirdamise kõigis etappides. Autoloogsete või allogeensete rakkude eraldamiseks mõeldud nahatükid peaksid olema võimalikult õhukesed, kuna sel juhul on neid mehaaniliste ja ensümaatiliste meetoditega lihtsam eraldada ning saada kasvatamiseks elusrakkude suspensioon. Neid saab saada dermatoomiga lõigates või silmalaugude, eesnaha ja õla sisepinna naha abil. Arvestades, et rakud on tundlikud halogeenide (kloor, jood) ja vesinikperoksiidi suhtes, ei saa neid materjali kogumise ajal naha töötlemisel kasutada.

Naha siirdamisest saadavate rakkude kvantitatiivne ja kvalitatiivne saagis ning nende kultiveerimise efektiivsus sõltuvad ka doonori tervisest ja vanusest. Lisaks tuleb nahabiopsiad võimalikult kiiresti ja sobivates tingimustes (keskkond, temperatuur) toimetada selleks otstarbeks sertifitseeritud ja akrediteeritud laborisse.

Nahaklappide säilitamiseks ja transportimiseks võib kasutada Eagle'i söödet või söödet 199, millele on lisatud 10% veiseseerumit, DMEM söödet, millele on lisatud 5% veise loote seerumit, ja antibiootikume.

Tsütoloogialaboris jagatakse nahabiopsia esmalt mehaaniliselt väikesteks tükkideks, seejärel töödeldakse nahatükke ensüümide abil: trüpsiin, kollagenaas, dispaas jne.

Ensüümide toimel desmosoomid hävivad ja keratinotsüüdid vabanevad keskkonda üksikute rakkude või erinevast arvust rakkudest koosnevate agregaatide kujul. Kultiveerimiseks kasutatakse ainult basaalseid keratinotsüüte, mida kasvatatakse spetsiaalsel söötmel 5% CO2 sisaldavates termostaatides, Petri tassides või kolbides temperatuuril 37 °C. Juba 48 tunni pärast täheldatakse keratinotsüütide kolooniate moodustumist, mis järk-järgult ühinevad, moodustades monokihi. Pärast piisava arvu rakkude saamist külvatakse saadud suspensioon selleks otstarbeks ettevalmistatud haavaplaastritele ja asetatakse Petri tassidesse. Suspensioonist moodustatakse esmalt mono- ja seejärel mitmekihiline keratinotsüütide kiht. Keratinotsüütide kultiveerimisprotsessi etapid on skemaatiliselt näidatud joonisel 12 (33, 43, 54, 65).

Siirdamiseks sobiva mitmekihilise keratinotsüüdikihi moodustumine võtab tavaliselt aega 7–10 päeva. Mõnikord on see periood pikem, mis sõltub lähtematerjali kvaliteedist (doonori vanus, tervislik seisund, materjali kogumise õigsus, kasutatud söötme kvaliteet jne). Kui mitmekihiline kiht kasvab liiga palju, võivad selle pinnale ilmuda siirdamiseks sobimatud apoptoosinähtustega rakud. Petri tassid, milles on haavakatetel kasvatatud mitmekihilisi keratinotsüüdikihte (MLK), toimetatakse kliinikusse spetsiaalsetes konteinerites temperatuuril vähemalt +15 °C.

Modifitseeritud Greeni meetod MPC kasvatamiseks

Oma töös kasutasime haavakattena mitmekihilist kambriumi, loobudes "Polypor" kiledest, millega alustasime rottidega tehtud katsetes. Seega kasvatasime mitmekihilisi keratinotsüütide kihte eelnevalt rasvatustatud ja steriilsele kambriumile, kuigi see pole samuti optimaalne haavakate.

Kliinilised uuringud viidi läbi vabatahtlikega, järgides vajalikke eetikanorme: lepingu allkirjastamine ja teadlik nõusolek.

1. Kasutati patsiendi enda (autoloogsete) ja pankadesse pandud (allogeensete) keratinotsüütide kultuuri.
2. Patsientide enda keratinotsüüdid saadi nahatükist, mis oli lõigatud nende õlavarre siseküljelt.
3. Armi dermabrasioonioperatsioon viidi läbi termokauteri, pöörlevate ketaste ja erbiumlaseri abil.
4. Võeti rühmad patsientidest, kellel olid normotroofsed, hüpotroofsed ja hüpertroofilised armid.

Naha armide välimuse parandamiseks rakulise tehnoloogia rakendamise tehnoloogiline protsess koosnes järgmistest etappidest:

1. Patsiendi valik.
2. Ravi olemuse selgitused, oodatavate tulemuste saavutamise ajaraamistik, lepingu allkirjastamine ja teadlik nõusolek.
3. Määrake patsientidele 2-3 nädalat enne operatsiooni selmevit 1 tablett 3 korda päevas, zinctheral 1 tablett 3 korda päevas.
4. Autoloogsete keratinotsüütide saamiseks võetakse õla sisepinnalt, kõrgelt, peaaegu kaenlaaluse piirkonna alumises osas, 2,0 cm pikkune ja 0,7–1,0 cm laiune nahatükk.
5. Juhtudel, kui patsiendid keeldusid oma keratinotsüütide isoleerimisest õla sisepinnal oleva lineaarse armi võimaluse tõttu, võeti rakuline materjal rakupangast (allogeensed keratinotsüüdid).
6. Keratinotsüüdid isoleeriti ja kasvatati seda tüüpi tööks sertifitseeritud laboris.
7. Pärast piisava koguse MPC saamist armidele siirdamiseks määrati kliinikus operatsiooni päev, kuhu materjal toodi spetsiaalsetes Petri tassides anumates.
8. Tehti armi dermabrasioonoperatsioon, hemostaas, poleeritud pinda pesti steriilse soolalahusega, kuivatati ja seejärel siirdati MPC-d sellele steriilsetele kambrilistele "rakkudele allapoole". See tähendab, et MPC-s üleval olevad rakud osutusid alumisteks, poleeritud pinna kõrval.
9. Peale kanti steriilne kile, mis kinnitati nahale elastse sideme või elastse Omnifix plaastriga. Kile asemel võib kasutada silikooni sisaldavaid indiferentseid haavaplaastreid, näiteks Mepiteli, Mepiformi või silikoongeellehti.

5-7 päeva pärast eemaldatakse kile või silikoonkate. Selleks ajaks peaksid kõik keratinotsüüdid olema roomanud poleeritud armile ja kinnitunud selle pinnale.

10. Kile ja silikoonkatte alla tekkiv niiske keskkond aitab sellele aktiivselt kaasa. Sellest hetkest alates armile jäänud kambrit saab leotada curiosini või kitosaani geeliga. Selle tulemusel tekib teisel päeval tihe koorik, mis patsiendi mugavuse huvides on kõige parem kinnitada elastse, hingava plaastriga, näiteks Omnifixiga. Hingav koorik võimaldab moodustunud epidermisel diferentseeruda ja küpseks muutuda.

Sõltuvalt armi tüübist ja lihvimise sügavusest lükatakse side tagasi 8-10 päeva pärast. Sel ajal on epidermises 30-40% rohkem rakukihte kui normaalses nahas. Basaalmembraani ei ole moodustunud. Paksenenud epidermise keratinotsüüdid eritavad armkoesse palju bioloogiliselt aktiivseid molekule.

Biotehnoloogilise armiravi edukus sõltub suuresti hooldusmeetodist operatsioonijärgsel perioodil. Rakukultuurid on "õrn" haavakatte tüüp ja siirdamise järgselt saab IPC-sid aluskudedest kergesti eemaldada. Seetõttu soovitatakse patsientidel armi pärast operatsiooni ettevaatlikult käsitseda. 8-9 kuu jooksul ärge hõõruge ja töödelge õrnalt külma keedetud veega, et vältida õhukese, äsja tekkinud epidermise rebenemist, millel puudub tihe side aluskudedega.

Märkus.

Enne operatsiooni ja dermabrasiooni ajal on lubatud kasutada halogeenitud antiseptikume ja oksüdeerijaid (jodopüroon, suliodopüroon, jodinool, jodinaat, kloorheksidiin, vesinikperoksiid), enne rakkude siirdamist on see rangelt vastunäidustatud nende tsütotoksilise toime tõttu. Metüleensinine ja briljantroheline on samuti rakkudele mürgised.

Nakkuse vältimiseks, eriti hüpertroofiliste armidega töötamisel, võib kirurgilist välja töödelda neomütsiinsulfaadi, polümüksiiniga või gentamütsiiniga. Neil ei ole tsütotoksilist toimet keratinotsüütidele.

Sellise ravi tulemusena saavutatakse kolmekordne efekt.

1. Armi pinna tasandamine.
2. Selle peale tekib uue normaalse paksusega epidermise kiht.
3. Armkoe muutumine nahasarnaseks koeks siirdatud rakkude poolt sekreteeritavate tsütokiinide, kasvufaktorite ja teiste bioloogiliselt aktiivsete molekulide (keratinotsüütide, fibroblastide ja makrofaagide) toimel, mida need stimuleerivad.

Arm muutub vähem märgatavaks, elastsemaks, sinna ilmuvad poorid ja velluskarvad ning pigmentatsioon saab taastuda tänu melanotsüütide olemasolule IPC-s.

Kuid kõik need armi positiivsed küljed ei ilmne kohe. Sellega seoses on vaja patsiente hoiatada, et armkoe muutumine nahakoeks toimub aeglaselt ja sellise ravi optimaalset tulemust võib oodata mitte varem kui 10–14 kuu pärast. Vahetult pärast sidemete eemaldamist on poleeritud pindadel väljendunud polükroomia, mida heledam, seda sügavam poleerimine teostati. Kõige vähem kahjustatakse nahka normotroofsete armide poleerimisel erbiumlaseriga. Armide ja ümbritseva naha värvus taastus 3–8 nädala jooksul. Vaatamata sellistele ettevaatusabinõudele tekib mõnikord operatsioonijärgne hüperpigmentatsioon, mis võib mõne kuu jooksul iseenesest kaduda.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]