Eksperimentaalne töö allogeensete keratinotsüütide siirdamiseks valgete rottide kunstlikult loodud armidele

Soov kasutada raku potentsiaali ja vajadus otsida uusi efektiivseid meetodeid, et parandada armide esteetilist väljanägemist, viis idee proovida uurida keratinotsüütide siirdamise võimalust võõrkehade pindadele.

Selleks, et tõestada võimalust kasutades keratinotsüüdi kultuuri parandada armide eksperimentaalse töö on tehtud valgele laboris rottidel, mis loodi armi pinda. Armistumist mudelrottidel valmistati kunstlikult tervendav haavad seljal piki selgroogu. Rotid lõigatud tükki sama nahk, suurus 2x3 cm. Pärast 2,5 kuud pärast operatsiooni "simulatsiooni armistumist" Rottidel viidi läbi dermabrasion kirurgia (eemaldamist ülemiste kihtide kaudu ignioperation vatsa) ja siirdatud allogeense keratinotsüütidele isoleeritud nahalt noorte rottide 2-4 päeva pärast sünnitust.

Roti epidermo-tsütide eraldamine ja kasvamine viidi läbi järgneva tehnoloogia tsütoloogia teaduskonna instituudi rakutehnoloogia laboris.

Naha pesti Hanki soolalahust, mis sisaldab 200 ühikut / ml gentamütsiin, lõigati väikesteks tükkideks, mille pindala on 0,2-0,5 cm ². Nahkuubikuid inkubeeriti 0,5% disaspaasi lahuses tasakaalustatud soolalahusega fosfaatpuhverdatud lahuses temperatuuril 37 ° C tund aega. Seejärel viidi tükid Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahusesse ja epidermis eraldati dermisest. Epidermis inkubeeriti 0,125% Trüpsiinilahusel 10-15 minutit segades kiirusega 50 p / min, mille järel ensüümi peatati 5% veise loote seerumit. Üks kolmandik saadud rakususpensioonist kasutada puhtal kujul, mis sobib üks valikutest siirdamist armid, teine kolmas kasvatati kodumaise biosobivat kilekate "Polipor", kolmas - iga Petri tassi ilma substraati. Operatsioon dermabrasion saadud armistumist rottidel millele järgneb ülekanne neile epidermotsitov roti eeteranesteesia all viidi läbi cautery.

Esimene rühm rottidel pärast dermabrasion poleeritud, pestakse soolveega ja kuivatati pinna steriilse vatsa ülestikku tükki muru, mis deponeeriti segipaisatud allogeense roti epidermotsitov läga kontsentratsioonis 1,5 miljonit rakku 1 ml (vastavalt Institute of tsütoloogial). Batist tükki laotud lihvitud armi et rakkude pinnal tekkinud armi. Sidemega peal mitu kihti marlit, mis on õmmeldud servad armi.

Osa saadud rakususpensioonist pandi Petri tassidesse steriilsetes Polypore kiledes, mis on lõigatud tasside kujul, teine osa ilma filmita Petri tassideks. Kasvatamine viidi läbi FAD-söötmes, mis sisaldas DMEM ja F12 segu suhtega 3: 1. Täiendatud 10% veise loote seerumit, 5 ug / ml insuliini (Sigma), 0,5mkg / ml hüdrokortisooni hemisuksinaat (Sigma). 10 ug / ml epidermaalse kasvuteguri EGF (tsütoloogia teaduskond, RAS, Peterburi). Rottide teine ja kolmas rühm koos 7 indiviidiga käitus 6 päeva pärast esimest. Selle aja jooksul moodustasid külvatud keratinotsüütide suspensioonist petri tassidesse, mis külvatakse rottidele, mitmekihilised kihid. Teist rühma siirdati kilel epidermisega, kolmas rühma - ilma substraadita mitmekihiline kiht. 7 päeva pärast saadud mitmekihiline kihid allogichnyh keratinotsüüdid (MPAlK) külvatud "Polipor" filmide siirdatud kultuuri otse haava pinnale. Ülaltoodu kohaselt fikseeriti kile, et vältida selle rippimist, mitmekihilise marli kastmega ja õmmeldud rotile nahale.

Enne siirdades keratinotsüüdid kolmas grupp rotte, kasvatatud ilma substraati, tekitades eraldamine PAC alt Petri tassis dispaas ravi, millel on võime selektiivselt murda dermo-epidermaalse side. Toimel mitmekihiline reservuaari dispaas hävitab ühendamist basaalrakuliseks kihina Petri tassis ning vähemal määral mõjutab see rakkudevahelise kommunikatsiooni, mis teeb võimalikuks "eemaldamine" kogu kiht. Mitmekihiliste rakuliste kihtide eraldumine käitlemisega viidi läbi järgmiselt. Alates Petri tassidesse segatud transportimissöötmega raku lehed pesti kolm korda sisaldava söötmega antibiootikume, eelkõige - gentamütsiin (0,2 mg / ml). Mitmekihiline kihid valati 0125% dispaas lahusega ( «Sigma») ja paigutati inkubaatorisse, kus nad inkubeeriti temperatuuril t = 37 ° C juures 20-30 minutit. Välimus valgest õiekroonist, koorimine ümber perifeeria reservuaarist - näitajana alguses protsessi eraldades selle servi ja Petri tassi. Mõni minut pärast algust eraldus protsessi dispaas Lahus tühjendatakse 2-3 korda epiteeli kihid pesti keskmise. Pinnale epidermaalse kiht kanti peale, mõõtu topsi tükis steriilse haavamähisega "Leithis-värv, mis lõhustatakse eraldati dispaas moodustumine, mis lisaks kihistumist topsi põhjas spaatliga. Kasutades oftalmiline pintsettide kiht koos katte salvrätik" Leithis-värv "(Vene ) lahku alt Petri tassis ja hoolikalt üle töödeldud pind armi. Mähkmed "Lita-värv" sisaldab oma koostiselt ja gentamütsiin eksolin (kollageeni ekstrakti), mis märjana keskkonnas jääb idanemist tulevikus Seemi soolalahusega paisutatud ja sai kaasaegse haava kate, mis tagab hea kaitse väliste infektsiooni ja kiire paranemise tõttu algav niiskuse struktuurile.

Polüprop-kiled ja Lita-värvi salvrätikud olid kihilised marli sidemetega, mis oli õmmeldud rotidesse nahale, et tagada vastupidavam fikseerimine. Iga rott oli istutatud eraldi puuris, et luua optimaalsed tingimused siirdatud keratinotsüütide hooldamiseks ja siirdamiseks. Sidemed rotid, kes siirdatud peatamine ja mitmekihiline reservuaari epidermotsitov löök dispaas, iga päev mitu korda päevas, niisutatud steriilse füsioloogilise luua kõige soodsamad tingimused rakkudega siirdamine. Arvestades, et film "Polypor" oli veega läbilaskev, ei saanud teise rühma rottidest niisutada, mis oli üks eeliseid filmideta siirdamise suhtes. 10 päeva möödudes eemaldati sidemed. Rakkude siirdamise järel tekkinud armide kliiniline pilt ei erinenud siirdamist mittesisaldavatest armidest, välja arvatud roosakasvatus (dermabrasiooni tõttu) ja suurem koorimine. See asjaolu osutab sellele. Et kohe pärast IPC-ga saadud haavakatete kadumist ei toimunud valge suudme muutusi.

Biopsia materjali võtmine rottidel.

Pärast 1, 2, 5 ja 9 kuud pärast siirdamist keratinotsüüdikihte roti allogichnyh jahvatatud armid valge rotid, võttes toodetud materjal histoloogilise, cytomorphological ja elektronide mikroskoopilise uuringu. Tavaliste roti naha ja armide kontrollproovid võeti ilma rakkude siirdamiseta. Rottide anesteesia teostati eeteranesteesiaga.

Pärast anesteesia tähistatud osad, milleks siirdatud keratinotsüüdid biopsiastantsi diameetriga 2 mm. Armkoe viiludeks võeti ja pandi 2,5% glutaaraldehüüdiga lahuse valmistamiseks materjali elektroonseks mikroskoopuurimine. Koeosakesed võetud histoloogilise uuringu pandi 10% neutraalseks formaldehüüdi lahusega, millele järgnes läbivjuhtmestiku alkoholid ja täideti parafiini järgneb lõikamine õhukesi sektsioonid ja nende vaatamist valguses-mikroskoobis.

Kontroll I. Normaalne roti nahk.

Et näha vahe mikroskoopiline pilt normaalse armi muuta rottide naha ja armistumist pärast teatud aja jooksul pärast siirdamist IPC, fotod kirjeldused on näidatud, et neil kõigil etappidel uuringust.

Normaalse naha epidermis moodustavad 7-9 kihti rakud. Hornikas mõõduka paksusega kiht. Kohtades koosneb ta 6-8 kihistest sarvjaskaaludest. Basaalkihti esindavad silindrilise kujuga rakud, millel on suur valgus, regulaarne tuum ja mitmed nukleolid. Rakkude ja basaalmembraani vahel olevad desmosoomilised ühendused on selgelt väljendunud. Täpselt määratletud basaalmembraani millel on peene mügarad in subepidermaalse kihti valet paralleelne õrna kimpude kollageeni ja elastiini kiud, sealhulgas pikliku fibroblastid, väikeste veresoonte. Sügavamates kihtides on kollageeni ja elastiini kiudude kimbud eri suundades. Nende seast on palju laevu, millel on sama kaliibriga õhukesed seinad, rakulised elemendid (fibroblastid, nuumrakud, leukotsüüdid). Paljudes juuksefolliikutes on rasvapõletik.

Ravi 2-kuuline rott.

Kliiniline pilt. Harjad on kahvaturoosa, koorimine, kohtades, kus koorid jäävad. Nende ala on vähenenud kontraktsiooni kollageeni kiud ja saada umbes 3,0-3,5 cm ^:. Naha manused puuduvad.

Mikroskoopiline pilt. Epidermis koosneb 3-5 rakukihid, volditud, esindajad ümardatud basaalrakkudest, ühes reas subulate, 1-2 rida keratohyalin graanuli teradest ülemises kihis on portsjonid rakusisese turse. Sarvkesta kiht muutub heterogeenselt väga õhukeseks paksemaks. Sarvkoe (kokkutõmbumise) tõttu on luulenurk kokkuklapitavad. Voldid tungivad papillaarkihini ja panevad mulje papillidest. Epidermise ja dermise vaheline piir on sirge joon. Basaalmembraani ei saa kõikjal jälgida. Subepidermaalsete ja sügavamate kihtide alumises osas - paksu, lahti seintega lahtrid, paljusid kõrvale jäänud, staase nähtustega. Laevade ümbruses - makrofaagide klastrid, fibroblastid. Makrofaagid ümbritsevad kapillaaridest tekkivaid erütrotsüüte ja fagotsüteerivad neid. Veel pinnapealsetes kihtides - väikesed kapillaarid. Epidermise all on kollageenkiud lahtised. Sigade sügavam kiht - kollageenikiudude jämedad kimpud, mille hulgas on palju fibroblaste.

Rottide armistumine kuu pärast MPAl roti roti keratinotsüütide siirdamist.

Kliiniline pilt. Armid roosa, nende pindala väheneb, eriti läbimõõduga keskmiselt 2,5-3 cm ². Juuksed ja rasvapõksud ei ole olemas.

Need mikroskoopilisel uurimisel saadud materjal rottide ülekande MPAlK MPAlK kilele ja substraat ilma praktiliselt identne. Kuid tehniliselt, töö MPAlK toetamata palju raskem ja töömahukas kui kasvatamine MPAlK substraadile, nii edasi uurida küsimust siirdamise kertainotsitov armid me aluseks kasvatamiseks ( "substraati") kihiline muru.

Mikroskoopiline pilt. Epidermise paksenduseks on 15-20 kihti, mille keratinotsüüdid on peaaegu keskel kitsad, piklikud, vertikaalsed ja kompaktsed. Basaalrakud paiknevad ebaühtlaselt. Nende tuumad on kerged, suured, ümmargused, millel on üks või kaks nukleoli, mis näitab nende suurt sünteetilist ja proliferatiivset aktiivsust. Epidermise ja dermise vaheline piir on sirge joon. Terav kiht on hästi arenenud, koosneb kolmest kihist ümmarguse kujuga rakkudest, seal on 2 nukleoolirakku.

Vahetult basaalmembraani all - tihedalt asetsevad kollageenkiudude õhukesed kimpud, paralleelselt nendega suur arv tühjadele anumadele, sügavamad kollageenkiud on jämedamad, kogutud tihedate kimpude kaupa. Paljud suured fibroblastid, nuumrakud (2-3 nägemispiirkonnas), makrofaagid, leukotsüüdid ja tühjad ained, mille seinad on lahti võetud, on nende ümbruses lahtiselt asetsevad kollageenkiud. Mõnes laevas - staasi, ühtse elemendi diapedes. Alas mahutite all - fibroblastid, üksik lümfotsüüdid. Naha manused puuduvad.

Kui keratinotsüütide suspensiooni siirdatakse poleeritud harule, on mikroskoopiline pilt varasemast erinev. Enamikus loomades - epidermius on õhuke, koosneb 5-6 kihti rakkudest. Alumine kiht koosneb ebakorrapärase, hulknurkse kujuga rakkudest, millel on ümardatud ebakorrapärase kujuga tuumad. Subepidermaalse kihi seisund on sarnane siirdamist vajavate loomade rühma seisundiga.

Sellisel juhul võib rääkida rakkude siirdamisega kaasnevate protsesside viivitamisest või suspensiooni kujul transplanteeritud rakkude suured kadudest. Seega tehti järeldus, et keratinotsüütide siirdamise teel suspensiooni kujul olevate armistumiste korrigeerimine ei sobi.

Rottide armistumine 2 kuud pärast MPAl roti roti keratinotsüütide siirdamist.

Kliiniline pilt. Rand näeb välja õhuke, pehme. Kohati on pilt, kaalud.

Mikroskoopilised pildid. Sarvkesta pakseneb, kohtades - hüperkeratoos. Epidermise pakseneb, see koosneb 12-20 rida rakke. Epidermise ja dermise vaheline piir on sirge joon. Õrnad kollageenkiud epidermise all asuvad üsna tihedalt. Suuremates kihtides valmikus kogutakse need jämedates suurtes kimpudes. Subepidermilises kihis ilmub uus laevade moodustumine. Alamkihtidena armekoes - paljud tühjad ained, mis paiknevad paralleelselt epidermise pinnaga. Suured fibroblastid jaotuvad valkude paksusest ühtlaselt, on hiiglaslikud, mitmetahulised, paljud makrofaagid.

Rottide armistumine 5 kuu jooksul pärast roti sperma-tsütopaudide siirdamist.

Kliiniline pilt. Armi välja sile, sile, ilma koorimine on juuksekarv nende suurema tihedusega perifeerias armi, mis näitab serva sissekasvanud karvanääpse vatsa ja kasvaja karvanääpsude. Armide pindala väheneb jätkuvalt.

Mikroskoopiline pilt. Epidermis on endiselt paks (15-20 kihti, mõnikord kuni 30) ülemiste kihtidega täidetud keratogialiini teradena. Basaalmembraan on selgelt nähtav. Tema kollageenikiudude alla jäävad lahti. Alumised kihid - kollageen on võimsam ja tihedamalt pakitud. Kollageeni talade hulgas on palju kapillaare .. Ülemiste kihtide arv vähenes tühjade laevade arvuga. Epiderm ja dermis on veidi lained. Armide kudedes on sügavad epidermaalsed väljakäigud. Kollageenikiudude seas on nähtavad äsja moodustatud anumad. Esitage üksikud juuksefolliikulisid ja rasvade näärmeid.

Rottide armistumine 9 kuu jooksul pärast IPA roti roti epidermo-tsütide siirdamist.

Kliiniline pilt. Armid muutusid palju väiksemaks võrreldes varasemate terminitega, nende pindala keskmiselt umbes 1,5-2,0 cm ². Armid on ebaühtlaselt kaetud õhukeste juuksedtega, eriti ümbruse ümber. Väike väikeste plaatide skaleerimine jääb kehtima.

Mikroskoopiline pilt.

Epidermiks sai õhem, kujutatud 6-8 rida rakke, mis meenutab normaalse naha rottide epidermaalset struktuuri, ainult rakkude tihedus on 1 mm. Suurem ja need on väiksemad. Aluskiht koosneb ümmarguste silindrikujuliste kujutiste väikestest rakkudest. Basaalmembraan on hästi määratletud, hemidesmoosid on selgelt nähtavad. Märgitakse epidermaalse väljakasvu olemasolu epidermaalses kihis. Papillaarkiht on väljendatud kogu haru pikkuses. Need faktid näitavad, et sellel ajaperioodil on siirdatud keratinotsüütide haardumine omandanud suhteliselt vastupidavamad ja vastsündinud kudesid. Sellest tulenevalt võib 9 kuu jooksul pärast IPK siirdamist inimesi, kes on MALC transplantatsiooniga, armastada, olla traditsiooniline. Epidermise all on tundlikumad kollageenkiud kui sügavates kihtides. Seal oli palju laevu, eriti pinnapealselt aset leidnud. Suuremates anumates on seinad paksud. Juuste folliikuleid ja rasvade näärmeid suures koguses. Mikroskoopiline muster sarnaneb naha koega.

Katse töö tulemused ja nende arutelu.

Selle töö käigus kunstlike naha armidega rottidel pärast operatsiooni dermabrasion, siirdatud keratinotsüüdid erinevates formah- haava pinnad, suspensioonina Batisti ja kihiline moodustumist ilma substraati. Töö tehti morfoloogiliste andmete saamiseks transplanteeritud allogeensete keratinotsüütide mõju kohta armidele, samuti optimaalsete siirdamisvariantide määramisele.

Selgus, et kõik kolm meetodit ümberistutamiseks reaalne, kuid ilma siirdamise Mpaka substraat - väga töömahukas protseduur, mille käigus Mpaka võib vigastada, kajastub tulemuste siirdamisega. Peale selle ei hõlma see siirdamismeetod suurelt pinnalt tööd.

Siirdamine keratinotsüüdi vedrustus - oluliselt säästlikum meetod ei nõua pikka kultiveerimist ja lihtsad käesoleval teostuses kontakt steriilsete Batisti toorikute, mille mõõtmed vastavad väärtus löövet. Mahajäämust ravitoime kui siirdades rakususpensiooni umbes kuu aega, võrreldes IPC haavale sidemega - ei kujuta endast märkimisväärset hetkeni, mil ravi kestus ulatub mitu kuud. On teada, et IPC siirdamisel patsientide põletamiseks toimus naha struktuuri seisundi muutus järk-järgult ja mitme aasta jooksul. Keratinotsüütide kultiveerimine haava katteks on kõige mugavam ja paljutõotav meetod, kuid see on ka palju kallim. Lisaks nõuavad otsingu tänase parendatud variandid katteid, mis peaks olema elastseks hügroskoopne bakteriostaatiline või bakteritsiidset toimet ning olla bioloogiliselt neutraalne rakkudes. Film "Polipor" - vahepealne versioon kodumaiste film haava katvuse, vaatamata mõningatele puudustele on võimaldanud meil õppida katseliselt keratinotsüüdi siirdamise rottidel armid ja teha järeldusi tõhususe selles suunas atraktsioon löövet.

Autorid, kes teostas siirdamisoperatsiooni IPC haavad põletatud märkida, et esimese nädala jooksul pärast siirdamist mitmekihilise reservuaari keratinotsüüdid haavas steriilseks epidermis pakseneb ja kihistunud. Kõik epidermise kihid olid hästi määratletud. Huvitav on see, et siirdatavate rakuliste kihtide arv on 10-30% suurem kui nahavigastuste biopsiates. Autorid märkidavälimus keratohyalin graanulid 5. Päeval pärast siirdamist MEC, basaalmembraani ja poludesmosom - juba 3. Päev.

J.Rives jt (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov jt. (1998) leidsid, et esimestel perioodidel transplantatsiooni järgselt BMD patsientidel polnosloynymi nahadefektide pärast põletused, suhtlemine pärisnahka ja epidermis on väga nõrk ja on sirgjoon, papillaarseid kiht puudub. Aasta lõpuks 2. Kuu algab moodustamine madalas edukaltja ja naha derivaadid, kommunikatsioon dermis ja epidermis muutub tugevamaks. Kirjanduse andmed govoryato siirdamist allogeense keratinotsüüdid haava põles patsientide kui paljutõotav meetod. Vaatamata sellele, et tagasilükkamise allogeense keratinotsüüdid esineb esitatud erinevate autorite ajavahemikul 10 päeva kuni 3 kuud, aga neil on oma roll paranemise haava pinnale, vabastades kasvufaktorid ja mehaaniliselt sulgemise defekti. Arvatakse, et MPAlK on vähendatud antigeense aktiivsuse, sest kui in vitro kultiveeritud kaotada Langerhansi rakke, mis võimaldab neil olemas pikka aega organismis saaja. Lisaks allogeense kultuuri saadud naha tervetel noortel inimestel on palju suurem bioloogiline potentsiaali kui autoloogse kultuuri patsientidel pärast traumat.

Meie uuringu põhieesmärk oli selgitada välja, kas allogeensed keratinotsüüdid säilivad armidel ja millised muutuvad sellises bioloogiliselt aktiivses "haava kattes" armekoes. Positiivse tulemuse korral tehke selles rehabilitatsioonimeditsiinis kõige tõhusamaid ja kõige vähem töömahukaid tehnoloogiaid.

Meie poolt saadud andmed olid paljudel juhtudel sarnased kirjanduse andmetele inimese epidermis esinevate morfoloogiliste muutuste kohta pärast allogeensete keratinotsüütide ülekandmist haavade põletamiseks. Kuid seal on märkimisväärseid erinevusi nii siirdatava morfoloogilise substraadi kui ka tehnoloogia osas. Nii basaalmembraani ja dermo-epidermaalsete ühenduste (hemitsesemosoomid, papillid) moodustumise protsess toimub hilisemal kuupäeval kui keratinotsüütide siirdamine haavapindadele, kus ei esine armi muutusi. See näib olevat tingitud valulikkuskudede kehvast toitumisest võrreldes dermaalse või lihaskestaga. Arm, eriti vana, on tihe sidekoe, millel on väga väike arv veresooni, põletushaavade põhi on veresoonte rikas granulaatkoos. Seega on ilmne, et keratinotsüütide siirdamise ja haaramise tingimused on täiesti erinevad. Mida rohkem vaskulariseeritakse rakkude siirdamise ala, seda lihtsam on neid töödelda. Selle postuaali põhjal on järeldus noorte armidega töötamise eelistamise kohta, kus sidekoe on endiselt piisavalt lahti ja veresoonte rikas.

Selle katseprotokolli tulemusena on tõestatud, et:

1. MALKi siirdamine armidele on võimalik. 
2. Siirdamise optimaalne meetod on keratinotsüütide siirdamine haava kaanel.
3. Sarma pind peab olema maandatud, kasutades Schumanni laseril või lõikuril operatiivset dermabrasiooni.
4. MPALK-i mõju all esineb piimapinna maapinna kiire epiteel.
5. Parem vaskulariseeritud armide kude, st noorem on arm, seda parem on keratinotsüütide siirdamise tulemused.
6. Siirdatud keratinotsüütide mõju söömiskarkass muutub järk-järgult ja muutub naha-sarnaseks (naha kujunevateks randmeteks kudedeks).
7. Sarvkoe järkjärguline lahtitugevus algab epidermaalse kihiga. Parandab vaskulariseerumist, on kõhupiirkonna kollageenikiudude kimbud vatserakkude ülemistel ja alumistele osadele rohumadamad kui rakukudedes ilma rakkude siirdamiseta. Seal on juuksefolliikuleid ja rasunäärmeid. Epidermis oma struktuuris, pärast hüpertroofia faasi möödumist, läheneb normaalse naha epidermile.
8. Vaadeldud muudatused on seotud keratinotsüütide eritatud kasvufaktoreid, tsütokiine, mis parandades trofism armkoe kaasa selle ümberkujundamine jäik sidekude leebema, mis toob kaasa parema armi.

Seega on selle uuringu põhjal võime järeldada kasulik mõju Keratinotsüütides siirdatud armkude, mis võib olla otstarbekas taastusravi erinevate armid.

See rottidel tehtud töö lubas ka nõudeid sõnastada. Haavakateteks, milles kasvatatakse keratinotsüüte.

Haavapadjad peaksid olema:

• bioakumuleeruvad rakkudega,
• hingav
• omama elastset, vormivarustust,
• olla hüdrofiilne,
• kuna ravimite lisandid sisaldavad antibakteriaalseid ravimeid ja antioksüdante ei ole kultiveeritud rakkude jaoks toksiline.

Armide biotehnoloogilise ravi kliinilised tulemused.

Varem oli N. Carver jt. (1993) leidsid, et oklusioonsidemete on parimad soodustab kinnituskohta haava ning ellujäämise keratinotsüüdikihte, kuid ei võimalda moodustada kihistunud (küpse) epidermis. Kihistunud epidermise moodustamiseks on vaja õhukeskkonda. Seega, pärast kinnitamist mitmekihiline reservuaari ummistusega haava kate on 7-10 eemaldada ja hoida haavasidemete kuival või vees lahustuva salvid. Me ei saa öelda, et kvaliteet ja omadused "substraati", mille rakud kasvatatakse on väga tähtis hetk tõhusust siirdamise rakulise materjali ja seega ka töö tulemustele arstid. Aga ideaalne haavamähisega täna ei ole, vaatamata arvukus pakutud variantide (kunstnahk, mitte-riidest-tselluloosi, fibriin katted, poolläbilaskva polüuretaankilest). Selles küsimuses ei ole mitte tähtsusetu aeg "substraatide" (spetsiaalsete haavakatete) hind, kuna nende kõrged kulud suurendavad biotehnoloogilise töötlemise kogukulu.

Tänapäeval on tõestatud mobiilsidetehnoloogiate tõhusus, kuid kahjuks on need tehnoloogiad väga kulukad, eriti riikides, kus raku kompositsioonide tööstuslik tootmine ei ole kindlaks tehtud. Sellegipoolest on sellised riigid nagu Ameerika Ühendriigid pikaajaliselt loonud põletatud siirdamiseks kasutatava rakumaterjali tootmise tööstuse. Eelkõige firma BioSurface Technology Inc, alates 1989. Aastast, tõstis 37,000 lamineeritud kihid keratinotsüüdikihte, mida on kasutatud raviks 240 patsienti 79 riigis üle maailma (R.Odessey, 1992) 1 cm ² rakukultuuris maksab umbes 7-8 $ US

Erinevate haiguste ja nahaprobleemide ravimise tehnoloogial on mitmeid erinevusi, kuid rakkude igasuguse ravi keskmes on kvaliteetse rakumaterjali tootmine ja selle siirdamine.

See protsess koosneb järgmistest etappidest:

• kahjustatud naha (või doonorite) naha valimine;
• nahaplaatide transportimine biotehnoloogia keskusesse
• basaalkihi rakkude eraldamine ja nende paljunemine
• keratinotsüütide mitmekihiliste kihtide (IPC) kogunemine.
• rakukultuuride transplantatsioon.

Peamine probleem mitmekihiliste keratinotsüütide kihtide siirdamisega on vajadus elujõuliste rakkude järele rakkude siirdamise kõigil etappidel. Autoloogsete või allogeensete rakkude eraldamiseks mõeldud nahatükid peaksid olema võimalikult õhukesed, kuna sel juhul on neid mehhaaniliste ja ensümaatiliste meetodite abil lihtsam eraldada ja elusrakkude suspensiooni saamiseks kasvu jaoks saada. Neid võib saada, eemaldades dermatoomi või kasutades silmalaugude nahka, eesnaha, õlavarde sisepinda. Arvestades, et rakud on halogeenide (kloor, jood) ja vesinikperoksiidi suhtes tundlikud, ei saa neid materjali võtmise ajal naha raviks kasutada.

Naha siirdatud rakkude kvantitatiivne ja kvalitatiivne saagikus ja nende kasvatamise efektiivsus sõltuvad ka doonori tervislikust seisundist ja vanusest. Lisaks sellele tuleb naha biopsiatükid laborisse tarnida võimalikult kiiresti ja sobivates tingimustes (keskkond, temperatuur) sertifitseeritud ja akrediteeritud laborisse.

Kotka sööde või keskmine 199, lisades 10% veise seerumit, DMEM-söödet, millele on lisatud 5% veise loote seerumit, ja antibiootikume saab kasutada nahaplaatide säilitamiseks ja transportimiseks.

Tsütoloogilises laboris jagatakse naha biopsia kõigepealt mehaaniliselt väikesteks tükkideks, seejärel viiakse naha fragmentide töötlemine läbi ensüümide abil: trüpsiin, kollagenaas, düspaas jne.

Ensüümide toimel toimub hävitamine desmosoomidega ja keratinotsüüdid vabanevad söötmesse kui eraldi rakud või agregaadid, mis koosnevad erinevast rakkude arvust. Kultuuri jaoks kasutatakse ainult basaalseid keratinotsüüte, mida kasvatatakse spetsiaalses keskkonnas inkubaatorites, mis sisaldavad 5% CO, Petri tassides või viaalides temperatuuril t = 37 ° C. 48 tunni jooksul täheldatakse keratinotsüütide kolooniate moodustumist, mis läheneb järk-järgult monokihiks. Pärast piisava arvu rakkude saamist levib saadud suspensioon sellel eesmärgil valmistatud haavakattest ja asetatakse Petri tassidesse. Suspensioonist moodustatakse esmalt monokiht ja seejärel mitmekihiline keratinotsüütide kiht. Skeemiliselt on keratinotsüütide kasvuprotsessi etappid näidatud joonisel fig. 12 (33.43.54.65).

Siirdamiseks sobiv mitmekihilise keratinotsüütide moodustumine võtab tavaliselt 7-10 päeva. Mõnikord on see periood pikem, mis sõltub lähtematerjali kvaliteedist (vanus, doonori tervis, materjali õigsus, kasutatud kandja kvaliteet jne). Kui mitmekihiline kiht overgrows, siis võib selle pinnal olla rakud, mille apoptoosi nähtus ei sobi siirdamiseks. Petri tassid, mis on kasvanud neelatud keratinotsüütide mitmekihiliste kihtide (IPC) haavakattega, viiakse kliinikusse spetsiaalsetes konteinerites temperatuuril, mis on madalam kui +15 ° C.

Modifitseeritud Rohelise meetod IPC kasvatamiseks

Meie töös haavakatena kasutasime mitmekihilist kambrikust, loobudes polüpooni kiletest, millega hakkasime töötama rottide katses. Seega kasvatasid meie mitmekihilised keratinotsüütide kihid eelsegu ja steriilses batistis, kuigi see ei ole ka optimaalne haavakate.

Kliinilised uuringud viidi läbi vabatahtlikega, järgides vajalikke eetilisi norme: lepingu allkirjastamine ja informeeritud nõusolek.

1. Rakendati oma (autoloogne) ja pankrakkude (allogeensete) keratinotsüütide poolt saadud kultuuri.
2. Oma keratinotsüüdid saadi patsiendi õla sisemusest lõigatud nahaosast.
3. Armide dermabrasiooni kasutamine viidi läbi termopaaride, pöörleva ketaste ja erbium-laseriga.
4. Võeti patsiente, kellel olid normotroofsed, hüpotroofsed ja hüpertroofsed armid.

Rakuritehnoloogia rakendus tehnoloogias nahararmide tüübi parandamiseks koosnes järgmistest etappidest:

1. Patsientide valik.
2. Ravi olemuse selgitamine, oodatavate tulemuste saavutamise ajastamine, lepingu allkirjastamine ja informeeritud nõusolek.
3. Patsientide määramine 2-3 nädalat enne operatsiooni selmevit 1t võrra. 3 korda päevas, zinkteraal 1t juures. 3 korda päevas.
4. Autoloogsete keratinotsüütide saamiseks võtab naha tükk 2,0 cm pikkune ja 0,7-1,0 cm laiune õlarihma sisepinnast, kõrge, peaaegu aksilla piirkonna põhjas.
5. Rikke korral patsientide oma valiku keratinotsüüdikihte tõttu võimalust saada lineaarne armi sisepind õla, rakumaterjali võeti pangast rakkude (allogeense keratinotsüüdid).
6. Keratinotsüüdid isoleeriti ja kasvatati seda tüüpi laboratooriumi jaoks kinnitatud laboratooriumi tingimustes.
7. Pärast transplantatsioonile piisava IPC saamist manustati operatsioonipäeva kliinikusse armidesse, kus materjal pannakse Petri tassi spetsiaalsesse konteinerisse.
8. Valutati dermabrasiooni operatsioon, hemostaas, pinnas pesti steriilse soolalahusega, kuivatati, pärast seda siirdati IPC steriilsetesse batisti "rakkudesse". See tähendab, et rakud, mis olid MIC-s ülemises osas, olid madalamad, kõrvuti poleeritud pinnaga.
9. Peal asetati steriilne kile, mis kinnitati nahale elastse sidemega või Omnifixi elastse riba abil. Filmi asemel võib kasutada ka ükskõik milliseid silikooni sisaldavaid haavakatte, näiteks Mepiteli, Mepiformi, silikoongeeliplaate.

5-7 päeva pärast eemaldatakse kile või silikoonkate. Selleks ajaks peavad kõik keratinotsüüdid rullima lihvitud armule ja kinnituma selle pinnale.

10. Klaasi ja silikoonkatte põhjal loodud niiske keskkond aitab seda aktiivselt kaasa. Sellelt punktilt jälle aset leidnud baptistist saab impregneerida tsüroosi või kitosaani geeliga. Selle tulemusena tekib teisel päeval tihe koorik, mis patsiendi mugavuse huvides on parem kinnitada elastse õhk läbilaskva kipsiga, näiteks Omnifix. Hingav koor võimaldab uuendatud epidermil eristada ja muuta küpseks.

Sõltuvalt armuliigist ja lihvimissügavusest jäetakse kastmed tagasi 8-10 päeva pärast. Sel ajal on epidermis 30-40% rohkem rakulisi kihte kui tavalisel nahal. Basaalmembraan ei ole moodustatud. Paksenenud epidermise keratinotsüüdid vabastavad luude kudedesse bioloogiliselt aktiivsete molekulide massi.

Armide biotehnoloogilise ravi edukus sõltub suurel määral sellest, kuidas neid pärast operatsiooniperioodi hooldatakse. Rakukultuurid on "pakkuva" tüüpi haavakate ja varajastel perioodidel pärast siirdamist, võib BMD kergesti eemalduda aluseks olevatest kudedest. Seetõttu on patsientidel soovitatav hoolitseda arsti pärast operatsiooni. 8-9 kuu jooksul ärge hõõruge ja hõlpsasti külma keedetud veega töödelda, et vältida õhukese, äsja loodud epidermise, mis ei lase kudedel kergelt haarduda, rippimist.

Märkus:

Enne operatsiooni ajal dermabrasion kasutamine halogeenitud oksüdeerijad ja säilitusained (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, kloorheksidiini, vesinikperoksiid) kasutamine on lubatud enne siirdades kletok- absoluutselt vastunäidustatud, kuna nende tsütotoksilisi toimeid. Mürgised rakud on ka metüleensinine. Hiilgav roheline.

Nakkuse vältimiseks, eriti töötades hüpertroofiliste armidega, on võimalik ravida toimeainet neomütsiinsulfaadi, polümüksiini või gentamütsiini abil. Nad ei avalda tsütotoksilist toimet keratinotsüütidele.

Selle töötlemise tulemusena saavutatakse kolmekordne efekt.

1. Valvurite pinna tasandamine.
2. Uue epidermise, tavalise paksusega mustri peal asetsev kiht tuleb luua.
3. Konversioon armkude dermopodobnuyu toimel tsütokiinid, kasvufaktorid ja teiste bioaktiivsete molekulide poolt eritatav siiratud rakud ja keratinotsüüdid stimuleeritud neid, fibroblastid ja makrofaagid.

Rand muutub vähem märgatavaks, elastsemaks, neis ilmuvad poorid, juuksepikendused, melanotsüütide olemasolu MPC-s võib taastada pigmentatsiooni.

Kuid kõik need positiivsed momendid rütmihoogudes ei tule kohe. Sellega seoses on patsiente vaja hoiatada. Et armarakkude transformeerimine dermisse on aeglane ja selle ravi optimaalset tulemust ei saa oodata varem kui 10-14 kuud. Kohe pärast kastme tagasilükkamist on poleeritud pinnad ilmekas polükromaatsed, heledam on lihvimisprotsess. Vähem kahjustus nahale tekib normotroofsete armide peenestamisel erbium-laseriga. Armide ja ümbritseva naha värvus taastati perioodil 3 kuni 8 nädalat. Hoolimata sellistest ettevaatusabinõudest on mõnikord postoperatiivne hüperpigmentatsioon, mis võib kesta mitu kuud sõltumatult.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]