Sisseehitatud "geneetilise kilbiga" sääsed peatavad malaaria - nakatumise määr langeb 93%

Insektitsiidiresistentsuse ületamine: kuidas sääskede ühe geeni modifikatsioon ise põlvkondade vältel levib, kõrvaldades praktiliselt malaaria leviku ilma ellujäämist ohustamata.

Hiljuti ajakirjas Nature avaldatud uuringus uuris teadlaste meeskond, kas fibrinogeeniga seotud valgu 1 (FREP1) glutamiin 224 (Q224) alleel muudab Anopheles stephensi sääsed Plasmodium-nakkuse suhtes resistentseks, hindas selle alleeliga seotud ellujäämiskulusid ja testis alleelse geeni ajamisüsteemi selle kaitsva mutatsiooni levitamiseks populatsioonide vahel.

Eeltingimused

2023. aastal suri malaariasse umbes 600 000 inimest, kellest enamik olid lapsed Sahara-taguses Aafrikas ja Lõuna-Aasias. Traditsioonilised tõrjemeetodid – sääsevõrgud, insektitsiidid, malaariavastased ravimid – kaotavad oma tõhusust sääskede ja parasiitide resistentsuse tõttu. Geenitehnoloogiad, mis levitavad kasulikke alleele sääskede populatsioonide kaudu, pakuvad paljulubavat ja jätkusuutlikku lahendust.

FREP1 valk aitab parasiitidel sääse kesksoolest läbi pääseda, kuid looduslik variant Q224 suudab nakkust ennetada ilma sääse bioloogiat kahjustamata. Eesmärk oli testida, kas sellist endogeenset alleeli saab ohutult levitada, et vähendada malaaria levikut, säilitades samal ajal sääse elujõulisuse.

Uuringust

CRISPR/Cas9 abil loodi kaks Anopheles stephensi tüve, mis erinesid ainult FREP1 valgu 224. aminohappe poolest: metsiktüüp leutsiiniga (L224) ja potentsiaalselt kaitsev tüvi glutamiiniga (Q224). Juht-RNA sihtis introni piirkonda 126 bp ülesvoolu koodonist, võimaldades homoloogset rekombinatsiooni fluorestseeruva märgise (GFP või RFP) sisestamisega.

Sobivust hinnati tiiva pikkuse, viljakuse, munade koorumise, poegimise, täiskasvanute tekkimise ja eluea järgi (Kaplan-Meieri ellujäämisanalüüs).

Vektori pädevust määrati Plasmodium falciparum (inimene) ja Plasmodium berghei (näriline) parasiitide standardse membraansöötmise abil, kusjuures süljenäärmetes loendati ootsüsti ja sporosoidi.

Alleeli ajamisüsteem sisaldas kassetti, mis sisaldas L224 ja Cas9 vastast gRNA-d vasa promootori kontrolli all. Alleeli sagedusi jälgiti fluorestsentsmärgiste abil mitmetsüklilistes katsetes (10 põlvkonda). Genotüüpimine viidi läbi PCR-i, Sangeri sekveneerimise ja NGS-i abil. Bayesi modelleerimine hindas alleeli konversiooni, sobivuskulusid ja dünaamikat laboris vaba paaritumise ajal.

Tulemused

FREP1Q224 alleel ei põhjustanud ellujäämise olulisi kaotusi: tiibade pikkus, viljakus, koorumine, nukkumine ja täiskasvanutena ilmumine olid identsed FREP1L224 kontrollrühmaga. Väikesed erinevused isaste suuruses ja eluea pikkuses ei mõjutanud konkurentsivõimet. Neitssed FREP1Q224 emased elasid sama kaua kui kontrollrühmad ning verega toitmise järgselt täheldati emaste eluea vaid väikest lühenemist.

Väljakutsekatsed näitasid homosügootidel märkimisväärset kaitset.

• P. falciparum gametotsüütide madala kontsentratsiooni korral (0,08%):
  • Nakatumise määr langes FREP1Q224-s 80%-lt ~30%-le;
  • Ootsüstide keskmine arv: 3 kuni 0;
  • Süljenäärmetes olevad sporosoidid: >4000 kuni 0.
• Kõrgema gametotsüteemia korral (0,15%):
  • Ootsüstide keskmine arv: ~32 kuni
  • Ka sporosoidide arv vähenes dramaatiliselt.
• P. berghei puhul:
  • Ootsüstide keskmine arv: 43 kuni 25;
  • Sporozoiite: ~19 000 kuni 11 000.
• Heterosügootid (FREP1L224/Q224) ei olnud kaitstud.

Geeniajami efektiivsus

• Paaris ristamistes konverteeris Cas9 + gRNA L224 50–86% FREP1L224 alleelidest FREP1Q224 alleelideks;
• Ema Cas9 puhul oli sagedus suurem;
• Teises põlvkonnas ulatus kaitsva alleeli sagedus 93%-ni;
• NHEJ parandusraja vea esinemissagedus oli madal (0–12%) ja põhjustas tavaliselt kahjustusi.
• Rakupopulatsioonides, kus doonori ja retsipiendi suhe oli 1:3, suurenes FREP1Q224 sagedus 10 põlvkonna jooksul 25%-lt >90%-ni;
• NHEJ alleelide esinemissagedus langes 5,4%-lt

Bayesi modelleerimine toetas hüpoteesi kõrge konversiooni, stabiilsete mutatsioonide madala sageduse ja letaalse steriilse mosaiiksuse efekti kohta, kus emapoolse Cas9 genotüübiga WT homosügootidel esines somaatilisi mutatsioone ja vähenenud ellujäämist.

Hilisemad põlvkonnad näitasid P. falciparumi ootsüstide peaaegu täielikku supressiooni (mediaan 0 kuni 5,5), mis kinnitas, et populatsioon oli muutunud parasiitide ülekande suhtes suures osas resistentseks.

Kaitseval alleelil polnud varjatud eeliseid ega kõrvalmõjusid ning see levis ajendi teel.

Järeldused

Uuring näitas, et ühe aminohappe asendamine FREP1 valgus ja selle pärilikkuse muutmine geeni abil võib muuta Anopheles stephensi praktiliselt immuunseks malaaria – nii inimeste kui ka näriliste – suhtes, ilma et see kahjustaks sääskede elujõulisust.

See lähenemisviis täiendab olemasolevaid meetmeid (võrgud, insektitsiidid, ravimid), mille tõhusust resistentsus vähendab. Sellist süsteemi saab kasutada ka insektitsiidide suhtes tundlikkuse taastamiseks või muude kaitsvate alleelide sissetoomiseks.

Enne tehnoloogia rakendamist on vaja rangeid keskkonna-, eetika- ja juhtimisraamistikke ning levitamise kontrollimise süsteeme.