Mitteviiruslik geeniteraapia pakub lootust kroonilise alaseljavalu korral

Ajakirjas ajakirjas Biomaterials avaldatud hiljutises uuringus töötasid teadlased välja uudse mitteviirusliku geeniteraapia, et ravida diskogeenset seljavalu (DBP), kasutades transkriptsioonifaktorit Forkhead. Box F1 (FOXF1), kasutades in vivo rakuväliseid vesiikuleid (eEV-sid) degeneratiivseteks lülidevahelisteks ketasteks (IVD).

Krooniline alaseljavalu (LBP) on elanikkonna vananemise ja süvenevate opioidprobleemide tõttu kasvav ülemaailmne probleem. Praegused ravimeetodid hõlmavad lühiajalist leevendust või kalleid operatsioone, mis rõhutavad sõltuvust mittetekitavate ja vähem invasiivsete ravimeetodite vajadust.

Praegused bioloogilised ravimeetodid, sealhulgas kasvufaktori manustamine, rakuteraapia ja viiruse geeniteraapiad, võivad vähendada loom- ja inimmudelite degeneratsiooni. Sellised mured nagu lühiajalised mõjud, halb pikaajaline tõhusus ning tarbetu immunogeensus ja tuumorigeensus võivad aga takistada nende meetodite otsest rakendamist.

Selles uuringus lõid teadlased mitteviirusliku geeniteraapia lülidevahelise diski degeneratsiooni (IVD) jaoks, kasutades FOXF1-eEV-d.

Teadlased transfekteerisid primaarseid hiire embrüonaalseid fibroblaste (PMEF-id) plasmiidiga, mis sisaldas kontrollina FOXF1 või pCMV6, ja iseloomustasid eEV proove nanoosakeste jälgimise analüüsi (NTA) abil.

Nad hindasid molekulaarse lasti tõhusat laadimist eEV-desse, kasutades kvantitatiivset pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) ja tavapärast PCR-i. Western blot analüüs tuvastas eEV koosseisudes FOXF1 ja spetsiifilised EV valgud. Töörühm kasutas plasmiide, mis suurendavad üles- ja allavoolu polülinkeri piirkondi, et määrata FOXF1 plasmiidse DNA olemasolu doonorrakkudes ja genereeritud eEV-sid.

Nad uurisid eEV-des ja doonorrakkudes plasmiidsest DNA-st toodetud täispikka mRNA-d.

Teadlased lõid transkriptsioonifaktoritega rakuvälised vesiikulid, et taastada koefunktsioon ja muuta valureaktsioone DBP loommudelis.

Nad tuvastasid EV-d, mis transpordivad ja jaotavad FOXF1 kahjustatud lülidevahelistesse ketastesse diskogeense seljavalu hiiremudelis, et teha kindlaks FOXF1 eEV lülidevahelise ketaste degeneratsiooni pärssimine.

Tiim ühendas hiire intervertebraalsete ketaste biomehaanilise testimise pildistamise, ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) muutuste ja 12 nädala pärast hinnatud valuvastustega, et kinnitada struktuuri ja funktsiooni muutusi, samuti terapeutilise sekkumise põhjustatud valu.

Preoperatiivsed ja ravijärgsed valuhinnangud hõlmasid mikrokompuutertomograafiat (mikro-CT), magnetresonantstomograafiat (MRI), mehaanilisi teste, Alcian sinise (AB) ja pikrosiiruse punase (PSR) värvimist, dimetüülmetüleensinise testi ja immunohistokeemiat (IHC). )).

Uuring hõlmas kirurgilist tehnikat, mille käigus teadlased süstisid hiirtele subkutaanselt Buprenorphine ER-i, et kontrollida operatsioonijärgset valu.

Tiim hindas käitumist enne operatsiooni ja iga kahe nädala järel nelja kuni kaheteistkümne nädala jooksul pärast operatsiooni, kasutades erinevaid tehnikaid, nagu avatud välitest, külmplaat, sabavedrustus ja traatvedrustus.

Avamaa testiga hinnati hiirte spontaanset aktiivsust; külmaplaadi testid mõõdeti termilist hüperalgeesiat; Saba vedrustuse testid mõõtsid aksiaalset valu; ja traatvedrustuse katsed mõõdeti tugevust.

Kaksteist nädalat pärast operatsiooni tükeldas töörühm loomade nimmepiirkonnad, kasutades reieluu närvi ja arterite jälgimist, et tuvastada L4 ja L5, L5 ja L6 ning L6 ja S1 IVD vahelised lülidevahelised kettad. Nad kasutasid L5/L6 IVD-d histoloogia hindamiseks ja glükoosaminoglükaani (GAG) sisalduse määramiseks.

FOXF1 eEV-d vähendasid märkimisväärselt valu vastust, taastades samal ajal IVD struktuuri ja funktsiooni, sealhulgas parandasid ketta kõrgust, kudede hüdratatsiooni, proteoglükaani sisaldust ja mehaanilisi omadusi.

Uuring keskendus FOXF1-ga laetud eEV-de vabanemisele FOXF1 transkriptsioonifaktoriga transfekteeritud primaarsetest fibroblastidest. Kvantitatiivne RT PCR näitas FOXF1 mRNA transkriptsiooni taseme ja täispika transkribeeritud FOXF1 mRNA taseme olulist tõusu võrreldes pCMV6-ga transfekteeritud rakkudega.

FOXF1 eEV-ravi võib vähendada valuvastust nimmeketta punktsiooniga hiiremudelis kuni 12 nädala jooksul. Emastel hiirtel oli FOXF1-ga ravitud rühmas pikem kogumisaeg kui kahjustatud rühmas, mis kestis pärast ravi vähemalt 12 nädalat.

FOXF1 eEV-ravi parandas vigastatud ja degeneratiivsete loomade hüdratatsiooni ja IVD koe pikkust in vivo, säilitades samal ajal hüdratatsioonitaseme ja T2-kaalutud IVD kujutise intensiivsuse.

Siiski täheldas töörühm haavatud loomadel ja pCMV6 eEV-ga ravitud loomadel ketta kõrguse vähenemist. FOXF1 eEV-ga ravitud hiirtel ei vähenenud ketta kõrgus 12 nädalat pärast ravi. Sugu ei mõjutanud funktsionaalseid tulemusi.

FOXF1 eEV-d taastasid kahjustatud ja degenereerunud IVD-de mehaanilise funktsiooni in vivo. Aksiaalse pinge all näitasid FOXF1 eEV-ga töödeldud IVD-d suuremat normaliseeritud NZ-jäikust võrreldes kahjustatud IVD-dega.

Rohketingimustes näitasid kahjustatud IVD-d normaliseeritud roomamisnihete suurenemist, mis viitab normaliseeritud roomamise elastse jäikuse vähenemisele.

Tulemused näitavad, et kahjustatud IVD-de GAG-i sisalduse vähendamine suurendab mehaanilist paindlikkust, kuid eEV-ravi takistab glükoosaminoglükaani kadu ja sellele järgnevaid muutusi mehaanilistes funktsioonides.

FOXF1 eEV-d põhjustasid IVD-s struktuurseid ja funktsionaalseid muutusi, suurendades proteoglükaanide ja GAG-de taset.

Uuringu tulemused näitasid, et arenguga seotud transkriptsioonifaktoritega koormatud eEV-d võivad ravida valulikke liigesehaigusi, nagu DBP, toimetades need transkriptsioonifaktorid degeneratiivsetesse ja valulikesse IVD liigestesse.

See strateegia võib aidata vähendada haigusest põhjustatud struktuurseid ja funktsionaalseid kõrvalekaldeid ning reguleerida soospetsiifilisi valureaktsioone.

Teadlased on soovitanud kasutada ka arengulisi transkriptsioonifaktoreid, nagu FOXF1, et muuta degeneratiivsed NP-rakud in vivo anaboolseks olekuks. Selle terapeutilise efektiivsuse kindlakstegemiseks on vaja täiendavaid uuringuid.