Üks viaal, kaks sihtmärki: kaasaskantav CRISPR-põhine tuberkuloosi diagnoosimine 100% tundlikkusega

Ajakirjas Science Advances avaldati artikkel kaasaskantava tuberkuloositesti kohta, mida saab teha otse rögast ilma keerukate seadmeteta. Isotermiline DNA amplifikatsioon ja CRISPR-i lugemine kombineeritakse ühes katseklaasis; korraga testitakse kahte konservatiivset M. tuberculosis'e insertsiooni (IS6110 ja IS1081) ning sisemise proovikontrollina kasutatakse inimese geeni. Väikeses kliiniliste proovide "pimetestis" andis test 100% tundlikkuse (6/6) ja 100% spetsiifilisuse (7/7) võrreldes kultuuriga; avastamispiir on simuleeritud rögas ~69–81 CFU/ml. Tulemust saab näha pabertestribal ja reagendid on lüofiliseeritud (säilitamine ilma "külmaahelata").

Taust

WHO andmetel tapab tuberkuloos 2023. aastal umbes 1,25 miljonit inimest; tuberkuloosist on taas saanud peamine nakkushaigustest tingitud surmapõhjus, mille hinnanguline arv on 10,8 miljonit. See muudab ligipääsetava ja kiire diagnostika kriitilise tähtsusega, eriti ressurssidega piiratud keskkondades.

• Praegused testid on kompromiss täpsuse, kiiruse ja hinna vahel. „Kuldstandardiks“ peetav kultuur on väga täpne, kuid aeglane; mikroskoopia on kiire, kuid tundetu; PCR-platvormid nagu Xpert MTB/RIF Ultra on oluliselt tundlikumad (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), kuid vajavad kallist varustust ja kassette, mis piirab testide ulatust.
• Miks isotermiline ja CRISPR. Isotermiline RPA amplifikatsioon toimib temperatuuril 37–42 °C ega vaja termotsüklereid – mugav „välitingimustes“. CRISPR-i lugemine (Cas12/13) lisab liigispetsiifilisust ja võimaldab visuaalset külgvoolu („ribastamist“) ilma keeruka optikata. Kokkuvõttes on see tee kaasaskantavate ja odavate PVR-testideni.
• Miks kaks MBT sihtmärki korraga (IS6110 + IS1081). IS6110 onM. tuberculosis kompleksi mitmekoopialine insert, kuid mõnel liinil on vähe koopiaid ja ainult IS6110 testid võivad "mööda lüüa". Teise IS1081 inserdi lisamine vähendab vale-negatiivsete tulemuste riski.
• Miks on vaja inimese sisemist kontrolli? Hingamisproovid võivad sisaldada inhibiitoreid ja "halbu" proove. Endogeenne inimese kontroll (nt RNase P/genoomne DNA) kinnitab, et materjal on piisav ja reaktsioon ei ole alla surutud – vastasel juhul ei saa tulemust negatiivseks pidada.
• Ühepoti formaat on iseenesest oluline. See vähendab samme, vähendab saastumisohtu ja hõlbustab tööd väljaspool laborit. Sellised tuberkuloosi lähenemisviisid on juba näidanud elujõulisust; uus töö laiendab ideed kahe sihtmärgiga formaadile koos sisemiste kontrollidega ning demonstreerib reagentide lüofiliseerimist ja ribalugejat.
• Mis on käesoleva artikli väärtus? Autorid demonstreerisid otsest tuvastamist rögast pärast kõige lihtsamat proovi ettevalmistamist, tuvastamispiiri ~70–80 CFU/ml simuleeritud rögas ja 100% tundlikkust/spetsiifilisust väikese pimekatse kliiniliste proovide komplekti puhul – hea „tehnoloogiline demo“ edasisteks mitmekeskuselisteks valideerimisteks.

Kuidas see toimib

• Teadlased kombineerisid RPA-d (geneetilise materjali kiire isotermiline amplifikatsioon temperatuuril 37 °C) "lõikavate" ensüümidega Cas13a/Cas12a. Pärast juht-RNA-de valimist konfigureerisid nad süsteemi nii, et see sihtis samaaegselt kahte MBT sihtmärki ja paralleelselt inimese DNA-ga (kontrollides, et proovis oleks üldse materjali ja reaktsioon poleks "seisma jäänud").
• Kogu keemiline analüüs läheb ühte katseklaasi; pärast inkubeerimist loetakse tulemus kas fluorimeetriga või külgvooluribalt – sisuliselt nagu kiirtesti puhul.
• Röga töötlemist on lihtsustatud kuumutamise ja lühikese tsentrifuugimiseni – ilma nukleiinhapete ekstraktoriteta. Kõige piiratud tingimustel arutavad autorid isegi tsentrifuugi käsitsi alternatiive.

Mida testid näitasid

• Avastamispiir: 69,0 CFU/ml (tüvi H37Rv) ja 80,5 CFU/ml (BCG) "teravas" rögas. Ristreaktsiooni teiste bakterite/seentega ei tuvastatud.
• Kliiniline olukord (pimeproovid): 13 reaalsest praktikast võetud proovi puhul oli tundlikkus 100% (6/6) ja spetsiifilisus 100% (7/7) külvi suhtes. Võrdluseks, samal komplektil näitas GeneXpert Ultra vastavalt 100%/86%.
• Tehnilised nüansid: kahest lugemisvõimalusest toimis Cas13a paremini ("ühepotilise" formaadi puhul on see tundlikum kui Cas12a). Lisaks vähendab kahe Mtb sihtmärgi paralleelne testimine valede tulemuste ohtu.

Miks see vajalik on?

Tänapäeva testid on kompromiss täpsuse, kiiruse ja kättesaadavuse vahel: kultiveerimine on väga täpne, kuid aeglane; tampoonid on kiired, kuid ebatäpsed; PCR-süsteemid, näiteks GeneXpert, on täpsed ja kiired, kuid vajavad kalleid instrumente ja kassette. Uus CRISPR-lähenemisviis püüab seda lünka täita: välidiagnostika, mis toimib temperatuuril 37 °C, millel on paberiribade näidud ja võimalus säilitada reagente ilma jahutamiseta.

Piirangud ja mis edasi saab

See on varajane demonstratsioon väikesel kliinilisel komplektil – vaja on suuri, mitmekeskuselisi teste (sh HIV-koinfektsioon lastel, vähebakteriaalsete vormide ja erinevate MBT-liinidega). Autorid märgivad eraldi, et "väliversiooni" puhul tuleb lauatsentrifuug asendada täismanuaalse lahendusega. Kuid arhitektuur ise – "kaks sihtmärki + sisemine kontroll" ühes katseklaasis – on oma toimivust juba tõestanud ja pakub selge tee masskasutuseks täiustamiseks.

Allikas: Alexandra G. Bell jt. CRISPR-põhine lihtsustatud test tuberkuloosi avastamiseks otse rögast, Science Advances, veebis 6. august 2025 (11. köide, 32. väljaanne). DOI: 10.1126/sciadv.adx206