Mitteviiruslik geeniteraapia pakub lootust kroonilise alaseljavalu puhul

Hiljutises ajakirjas Biomaterials avaldatud uuringus töötasid teadlased välja uudse mitteviirusliku geeniteraapia diskogeense seljavalu (DBP) raviks, viies transkriptsioonifaktori Forkhead Box F1 (FOXF1) in vivo degeneratiivsetesse lülivaheketastesse (IVD) konstrueeritud rakuväliste vesiikulite (eEV) abil.

Krooniline alaseljavalu on vananeva rahvastiku ja süvenevate opioidiprobleemide tõttu üha kasvav ülemaailmne probleem. Praegused ravimeetodid hõlmavad lühiajalist leevendust või kulukaid operatsioone, mis rõhutab vajadust mittesõltuvust tekitavate ja vähem invasiivsete ravimeetodite järele.

Praegused bioloogilised lähenemisviisid, sealhulgas kasvufaktorite manustamine, rakuteraapia ja viirusgeeniteraapia, võivad vähendada degeneratsiooni nii loomade kui ka inimeste mudelites. Siiski võivad sellised probleemid nagu lühiajalised mõjud, halb pikaajaline efektiivsus ning tarbetu immunogeensus ja onkogeensus takistada nende lähenemisviiside otsest rakendamist.

Selles uuringus lõid teadlased FOXF1-eEV abil mitteviirusliku geeniteraapia lülivaheketta degeneratsiooni (IVD) raviks.

Teadlased transfekteerisid primaarseid hiire embrüonaalseid fibroblaste (PMEF) kontrollina FOXF1 või pCMV6 sisaldavate plasmiididega ja iseloomustasid eEV proove nanoosakeste jälgimisanalüüsi (NTA) abil.

Nad hindasid molekulaarse lasti efektiivset laadimist eEV-desse, kasutades kvantitatiivset pöördtranskriptsiooni-polümeraas-ahelreaktsiooni (qRT-PCR) ja tavapärast PCR-i. Western blot analüüs tuvastas FOXF1 ja EV-spetsiifilised valgud eEV moodustistes. Meeskond kasutas plasmiide, mis võimendavad ülemist ja alumist polülinkerpiirkonda, et määrata FOXF1 plasmiid-DNA olemasolu doonorrakkudes ja genereerida eEV-sid.

Nad uurisid eEV-des ja doonorrakkudes plasmiid-DNA-st toodetud täispikka mRNA-d.

Teadlased lõid DBP loommudelis koefunktsiooni taastamiseks ja valureaktsioonide muutmiseks transkriptsioonifaktoritega rakuvälised vesiikulid.

Nad identifitseerisid diskogeense seljavalu hiiremudelis EV-sid FOXF1 transportimiseks ja jaotamiseks kahjustatud lülidevahelistesse ketastesse, et määrata FOXF1 eEV pärssivat toimet lülidevaheliste ketaste degeneratsioonile.

Meeskond ühendas hiire lülivaheketaste biomehaanilise testimise pildistamise, rakuvälise maatriksi (ECM) muutuste ja 12 nädala pärast hinnatud valuvastustega, et kinnitada terapeutilise sekkumise põhjustatud muutusi struktuuris ja funktsioonis, samuti valu.

Preoperatiivsed ja postoperatiivsed valu hindamised hõlmasid mikrokompuutertomograafiat (mikro-KT), magnetresonantstomograafiat (MRI), mehaanilist testimist, Alcian sinise (AB) ja pikrosiiriuspunase (PSR) värvimist, dimetüülmetüleensinise testi ja immunohistokeemiat (IHC).

Uuring hõlmas kirurgilist tehnikat, mille käigus manustati hiirtele subkutaanselt buprenorfiini ER-i, et kontrollida operatsioonijärgset valu.

Meeskond viis enne operatsiooni ja iga kahe nädala tagant neli kuni 12 nädalat pärast operatsiooni läbi käitumuslikke hindamisi, kasutades mitmesuguseid meetodeid, sealhulgas avatud välja testi, külmplaati, saba riputamist ja traat riputamist.

Avatud välja testis hinnati hiirte spontaanset aktiivsust; külmaplaadi testides mõõdeti termilist hüperalgeesiat; saba riputamise testides mõõdeti aksiaalset valu; ja traat riputamise testides mõõdeti tugevust.

Kaksteist nädalat pärast operatsiooni dissekteerisid meeskonnad loomade nimmelülid reieluu närvide ja arterite jälgimise abil, et tuvastada lülivahekettad L4 ja L5, L5 ja L6 ning L6 ja S1 IVD vahel. Nad kasutasid L5/L6 IVD-d histoloogia hindamiseks ja glükosaminoglükaani (GAG) sisalduse määramiseks.

FOXF1 eEV-d vähendasid oluliselt valureaktsioone, taastades samal ajal IVD struktuuri ja funktsiooni, sealhulgas parandades ketta kõrgust, kudede hüdratsiooni, proteoglükaani sisaldust ja mehaanilisi omadusi.

Uuring keskendus FOXF1-laaditud eEV-de vabanemisele transkriptsioonifaktoriga FOXF1 transfekteeritud primaarsetest fibroblastidest. Kvantitatiivne RT PCR näitas FOXF1 mRNA transkripti taseme ja täispikkuses transkribeeritud FOXF1 mRNA taseme olulist suurenemist võrreldes pCMV6-transfekteeritud rakkudega.

FOXF1 eEV-ravi võib hiirtel nimmelülide ketta punktsioonimudelis valu vähendada kuni 12 nädala jooksul. Emastel hiirtel oli FOXF1-ga ravitud rühmas pikem krambihooaeg kui vigastatud rühmas, mis kestis vähemalt 12 nädalat pärast ravi.

FOXF1 eEV-ravi parandas vigastatud ja degeneratiivsetel loomadel in vivo IVD-koe hüdratsiooni ja kõrgust, säilitades samal ajal hüdratsioonitaseme ja IVD-ketta T2-kaalutud pildi intensiivsuse.

Siiski täheldas meeskond vigastatud loomadel ja pCMV6 eEV-ga ravitud loomadel ketta kõrguse vähenemist. FOXF1 eEV-ga ravitud hiirtel ei olnud ketta kõrguse vähenemist 12 nädalat pärast ravi. Sugu ei mõjutanud funktsionaalseid tulemusi.

FOXF1 eEV-d taastasid kahjustatud ja degenereerunud IVD-de mehaanilise funktsiooni in vivo. Aksiaalse pinge all näitasid FOXF1 eEV-dega töödeldud IVD-d kahjustatud IVD-dega võrreldes suuremat normaliseeritud NZ jäikust.

Roomamistingimustes näitasid kahjustatud IVD-d suurenenud normaliseeritud roome nihkeid, mis näitab normaliseeritud roome elastse jäikuse vähenemist.

Tulemused näitavad, et GAG-i sisalduse vähendamine kahjustatud IVD-des suurendab mehaanilist paindlikkust, kuid eEV-ravi hoiab ära glükosaminoglükaanide kadu ja järgnevad mehaanilise funktsiooni muutused.

FOXF1 eEV-d indutseerisid IVD-s struktuurilisi ja funktsionaalseid muutusi, suurendades proteoglükaani ja GAG taset.

Uuringu tulemused näitasid, et arenguga seotud transkriptsioonifaktoritega laetud eEV-d suudavad ravida valulikke liigesehaigusi, näiteks diastoolset hüperpigmenti (DBP), viies neid transkriptsioonifaktoreid degeneratiivsetesse ja valulikesse liigestesse IVD abil.

See strateegia võib aidata vähendada haigusest tingitud struktuurilisi ja funktsionaalseid kõrvalekaldeid ning reguleerida valureaktsioone soospetsiifiliselt.

Teadlased soovitasid degeneratiivsete NP-rakkude in vivo pro-anaboolsesse olekusse viimiseks kasutada ka arenguga seotud transkriptsioonifaktoreid, näiteks FOXF1. Selle terapeutilise efektiivsuse kindlakstegemiseks on vaja täiendavaid uuringuid.