Mesenhüümilised tüvirakud

Regionaalsete tüvirakkude seas on eriline koht mesenhümaalsetel tüvirakkudel (MSC-del), mille derivaadid moodustavad inimkeha kõigi organite ja kudede stroomamaatriksi. MSC-de uurimise prioriteet kuulub Venemaa bioloogiateaduse esindajatele.

Eelmise sajandi keskel isoleeriti A. Friedensteini laboris esmakordselt luuüdi multipotentsete strooma tüvirakkude homogeenne kultuur. Substraadile kinnitunud mesenhümaalsed tüvirakud säilitasid pikka aega kõrge proliferatsiooni intensiivsuse ning substraadile fikseerimise järel madala külvitihedusega kultuurides moodustasid nad fibroblastitaoliste rakkude kloone, millel puudus fagotsüütiline aktiivsus. MSC proliferatsiooni lakkamine lõppes nende spontaanse diferentseerumisega in vitro luu-, rasva-, kõhre-, lihas- või sidekoe rakkudeks. Edasised uuringud võimaldasid kindlaks teha erinevate imetajaliikide luuüdi strooma fibroblastitaoliste rakkude osteogeenset potentsiaali ja nende kolooniaid moodustavat aktiivsust. In vivo katsed on näidanud, et nii hetero- kui ka ortotoopiline kolooniaid moodustavate fibroblastitaoliste rakkude siirdamine põhjustab luu-, kõhre-, kiulise ja rasvkoe moodustumist. Kuna luuüdi strooma tüvirakke iseloomustab suur eneseuuendusvõime ja mitmetahuline diferentseerumine ühe rakuliini piires, nimetatakse neid multipotentseteks mesenhümaalseteks eellasrakkudeks.

Tuleb märkida, et mesenhümaalsete tüvirakkude fundamentaaluuringute 45 aasta jooksul on loodud reaalsed tingimused nende derivaatide kasutamiseks kliinilises praktikas.

Tänapäeval pole kahtlustki, et kõik inimkeha koed moodustuvad proliferatsiooni, migratsiooni, diferentseerumise ja küpsemise protsesside tulemusena erinevate rakuliinide tüvirakkudest. Kuni viimase ajani arvati aga, et täiskasvanud organismi tüvirakud on koespetsiifilised, st võimelised tootma spetsialiseerunud rakkude liine ainult nendest kudedest, milles nad asuvad. Selle kontseptuaalse seisukoha lükkasid ümber faktid hematopoeetiliste tüvirakkude transformatsioonist mitte ainult perifeerse vere rakulisteks elementideks, vaid ka maksa ovaalseteks rakkudeks. Lisaks osutusid närvitüvirakud võimeliseks tootma nii neuroneid kui ka gliaalelemente, samuti varajasi hematopoeetiliste eellasrakkude liine. Mesenhümaalsed tüvirakud, mis tavaliselt toodavad luu, kõhre ja rasvkoe rakulisi elemente, on omakorda võimelised transformeeruma närvitüvirakkudeks. Eeldatakse, et kasvu, füsioloogilise ja reparatiivse koeregeneratsiooni käigus tekivad koe-mittespetsiifilistest tüvirakkude reservidest mittesiduvad eellasrakud. Näiteks lihaskoe taastumine võib toimuda mesenhümaalsete tüvirakkude migratsiooni tõttu luuüdist skeletilihastesse.

Kuigi tüvirakkude sellist ristvahetatavust ei tunnista kõik teadlased, ei vaidlusta enam keegi mesenhümaalsete tüvirakkude kliinilise kasutamise võimalust rakkude siirdamise allikana ja geneetilise teabe rakulise vektorina, nagu ka luuüdi strooma tüvirakkude multipotentsust, mida saab suhteliselt lihtsalt isoleerida ja in vitro kultuuris laiendada. Samal ajal ilmuvad teaduskirjanduses jätkuvalt teateid luuüdi strooma tüvirakkude potentsiaalse pluripotentsuse kohta. Tõendina tuuakse uurimisprotokolle, milles spetsiifiliste transdiferentseerumise indutseerijate mõjul transformeeritakse MSC-d närvirakkudeks, kardiomüotsüütideks ja hepatotsüütideks. Mõnedel teadlastel on aga tõsiseid kahtlusi geenide korduva aktiveerimise ja ekspressiooni võimalikkuses varase embrüogeneesi perioodist alates. Samal ajal mõistavad kõik, et kui leitakse tingimused mesenhümaalsete tüvirakkude multipotentsuse laiendamiseks ESC-de pluripotentsusele, lahenevad paljud regeneratiivse plastilise meditsiini eetilised, moraalsed, religioossed ja juriidilised probleemid automaatselt. Lisaks, kuna antud juhul saavad regeneratiivse tüvirakkude potentsiaali allikaks patsiendi autoloogsed stroomarakud, lahendatakse ka rakkude siirdamise immuunsüsteemi hülgamise probleem. Lähitulevik näitab, kui realistlikud need väljavaated on.

[ 1 ], [ 2 ]

Mesenhümaalsete tüvirakkude kasutamine meditsiinis

Kliinikus seostatakse mesenhümaalsete tüvirakkude derivaatide kasutamist peamiselt ulatuslike ja sügavate termiliste nahakahjustuste korral esinevate koedefektide taastamisega. Prekliinilises etapis viidi läbi eksperimentaalne hinnang allogeensete fibroblastitaoliste mesenhümaalsete tüvirakkude kasutamise teostatavuse kohta sügavate põletuste raviks. On näidatud, et luuüdi fibroblastitaolised mesenhümaalsed tüvirakud moodustavad kultuuris monokihi, mis võimaldab neid siirdada sügavate põletushaavade regeneratsiooniprotsesside optimeerimiseks. Autorid märgivad, et embrüonaalsetel fibroblastidel on sarnane omadus, kuid nende kliinilist kasutamist piiravad olemasolevad eetilised ja juriidilised probleemid. Wistari rottidel modelleeriti sügavat termilist põletust, mis kahjustas kõiki nahakihte. Põletusala oli 18-20% kogu nahapinnast. Esimesse katserühma kuulusid sügava termilise põletusega rotid, kellele siirdati allogeenseid fibroblastitaolisi mesenhümaalseid tüvirakke. Teise rühma kuulusid sügava termilise põletusega loomad, kellele siirdati allogeenseid embrüonaalseid fibroblaste. Kolmandat rühma esindasid sügava termilise põletusega kontrollrotid, kellele ei tehtud rakuteraapiat. Põletushaava pinnale kanti pipeti abil fibroblastitaoliste mesenhümaalsete tüvirakkude ja embrüonaalsete fibroblastide suspensioon koguses 2 x 104 ^.rakud teisel päeval pärast põletuse modelleerimist ja tekkinud nekrootilise kärna eemaldamist. Pärast rakkude siirdamist kaeti põletuspind marli salvrätikuga, mis oli niisutatud isotoonilise naatriumkloriidi lahusega ja gentamütsiiniga. MSC-de saamiseks koguti luuüdirakud ja seejärel indutseeriti need täiskasvanud Wistari rottide reieluudest fibroblastilaadsete mesenhümaalsete tüvirakkude liini. Embrüonaalsed fibroblastid saadi 14–17 päeva vanuste embrüote kopsudest. MSC-de saamiseks mõeldud embrüonaalseid fibroblaste ja luuüdirakke kultiveeriti eelnevalt Petri tassides temperatuuril 37 °C CO2 inkubaatoris, 5% CO2 atmosfääris ja 95% niiskuses. Embrüonaalseid fibroblaste kultiveeriti 4–6 päeva, samas kui MSC-de monokihi moodustumine võttis aega 14–17 päeva. Seejärel krüosäilitati MSC-sid fibroblastilaadsete mesenhümaalsete tüvirakkude lähtematerjalina, mis saadi MSC-de sulatamise ja 4-päevase kultiveerimise teel. Moodustunud fibroblastitaoliste mesenhümaalsete tüvirakkude arv oli enam kui 3 korda suurem kui samal kultiveerimisperioodil moodustunud embrüonaalsete fibroblastide arv. Siirdatud rakkude tuvastamiseks põletushaavades kultiveerimisfaasis märgistati nende genoom viirusliku süstikvektori abil, mis põhineb rekombinantsel V tüüpi adenoviirusel, mis kannab E. coli ß-galaktosidaasi kodeerivat 1ac-2 geeni. Elusrakud tuvastati erinevatel aegadel pärast siirdamist immunohistokeemiliselt krüosektsioonidel, millele oli lisatud X-Gal substraati, mis annab iseloomuliku sinakasrohelise värvuse. Põletushaava seisundi dünaamilise visuaalse, planimeetrilise ja histoloogilise hindamise tulemusena tehti kindlaks, et juba 3. päeval pärast rakkude siirdamist ilmnesid valitud rühmades haavaprotsessi kulgemises olulised erinevused. See erinevus muutus eriti selgeks 7. päeval pärast rakkude siirdamist. Esimese rühma loomadel, kellele siirdati fibroblastitaolisi mesenhümaalseid tüvirakke, omandas haav ühtlaselt intensiivse roosa värvuse, granulatsioonkude kasvas kogu oma pinnal epidermise tasemeni ja põletuspind vähenes oluliselt. Haavapinnale tekkinud kollageenkile muutus mõnevõrra õhemaks, kuid kattis jätkuvalt kogu põletusala. Teise rühma loomadel, kellele siirdati embrüonaalsed fibroblastid, tõusis granulatsioonkude haavaservade epidermise tasemele, kuid ainult kohati, samas kui haavast tulenev plasmorröa oli intensiivsem kui esimeses rühmas ja algselt moodustunud kollageenkile praktiliselt kadus. Loomadel, kes ei saanud rakuteraapiat, oli 7. päeval põletushaav kahvatu, lohukestega, nekrootilise koega, mis oli kaetud fibriiniga. Plasmorea täheldati kogu põletuspinnal. Histoloogiliselt näitasid esimese ja teise rühma loomad rakkude infiltratsiooni vähenemist ja veresoonte võrgustiku arengut.ja need algava regeneratiivse protsessi tunnused olid 1. rühma rottidel rohkem väljendunud. Kontrollrühmas täheldati haava rakulise infiltratsiooni märke, äsja moodustunud veresoonte histoloogiline muster puudus. 15.–30. vaatluspäeval oli 1. rühma loomadel põletuspinna pindala oluliselt väiksem kui teiste rühmade rottidel ja granulatsioonipind oli rohkem arenenud. 2. rühma loomadel vähenes põletuspinna pindala samuti võrreldes kontrollrühma rottide põletushaavade suurusega, mis tekkisid marginaalse epitelisatsiooni tõttu. Kontrollrühmas jäi põletuspind kohati kahvatuks haruldaste granulatsioonidega, sellele tekkisid vaskulaarsed tärnid, esinesid fibriinse naastu saarekesed, mõõdukas plasmorröa jätkus kogu põletuspinnal ja mõnes kohas oli alles raskesti eraldatav kärn. Üldiselt vähenes ka 3. rühma loomadel haava suurus, kuid haava servad jäid õõnestatuks.

Seega, haavade paranemise kiiruse võrdleva uuringu käigus, milles kasutati fibroblastitaolisi mesenhümaalseid tüvirakke ja embrüonaalseid fibroblaste, aga ka ilma rakuteraapiata, täheldati põletuspinna paranemise kiiruse kiirenemist fibroblastitaoliste mesenhümaalsete tüvirakkude ja embrüonaalsete fibroblastide siirdamise tulemusena. Allogeensete fibroblastitaoliste mesenhümaalsete tüvirakkude kasutamisel oli haavade paranemise kiirus aga suurem kui embrüonaalsete fibroblastide siirdamisel. See avaldus regeneratiivse protsessi faaside muutuse kiirenemises - rakkude infiltratsiooni aeg lühenes, veresoonte võrgustiku kasvukiirus suurenes ja granulatsioonkoe moodustumine suurenes.

Dünaamilise planimeetria tulemused näitavad, et põletushaava spontaanse paranemise kiirus (ilma rakuteraapiat kasutamata) oli madalaim. 15. ja 30. päeval pärast allogeensete fibroblastilaadsete mesenhümaalsete tüvirakkude siirdamist oli haavade paranemise kiirus suurem kui embrüonaalsete fibroblastide siirdamisel. Histokeemiline meetod beeta-galaktosidaasi tuvastamiseks näitas, et pärast fibroblastilaadsete mesenhümaalsete tüvirakkude ja embrüonaalsete fibroblastide siirdamist jäävad siirdatud rakud elujõulisteks nii regenereeruvate haavade pinnal kui ka sügavuses kogu vaatlusperioodi vältel. Autorid usuvad, et põletushaavade suurem taastumise kiirus fibroblastilaadsete mesenhümaalsete tüvirakkude kasutamisel on tingitud bioloogiliselt aktiivsete kasvustimuleerivate faktorite vabanemisest nende rakkude poolt küpsemisprotsessi käigus.

Kliinilises praktikas on põletushaavade raviks kasutatud ka auto- või allogeensete keratinotsüütide ja allogeensete fibroblastide siirdamist. Tuleb märkida, et ulatuslike sügavate põletustega laste kirurgiline ravi on keeruline ülesanne, kuna see on väga traumaatiline ja esineb mitmeid kirurgilisi sekkumisi, märkimisväärset verekaotust ja mitmesuguseid reaktsioone kasutatavale infusioonikeskkonnale. Peamised raskused ulatuslike sügavate põletuste, mille pindala ületab 40% kehapinnast, nahaplastiliste operatsioonide tegemisel tulenevad kannatanute seisundi raskusest ja doonornaha ressursside puudumisest. Suure perforatsioonikoefitsiendiga võrktransplantaatide kasutamine probleemi ei lahenda, kuna perforatsiooni järel moodustunud rakud epiteeliseeruvad väga aeglaselt ja nahaklapid ise sageli lüüsuvad või kuivavad ära. Sellised põletushaavade katted nagu ksenoskin, kaaver-allograftid, sünteetilised kilekatted ei ole alati piisavalt tõhusad, seetõttu töötatakse välja uusi meetodeid põletuspindade katmiseks kultiveeritud keratinotsüütide ja fibroblastide kihtidega. Eelkõige on välja pakutud meetod põletuspindade katmiseks kultiveeritud allofibroblastide abil, millel siirdamisel on väljendunud stimuleeriv toime piiripealsete põletuste haavas säilinud epidermotsüütide, samuti võrgusilma siirdamise vaheseintes olevate keratinotsüütide proliferatsioonile. L. Budkevichi ja kaasautorite töö (2000) esitab selle meetodi kasutamise tulemused laste põletuste ravis. Uuringus osales 31 termilise traumaga last vanuses 1 aasta kuni 14 aastat. Kolmel lapsel oli IIIA-B - IV astme põletushaavade kogupindala 40%, 25 lapsel 50-70% ja veel kolmel 71-85% kehapinnast. Varajane kirurgiline nekrektoomia kombineeriti kultiveeritud allofibroblastide siirdamise ja autodermoplastiaga. Ravi esimene etapp hõlmas nekrootiliste kudede ekstsisiooni, teine etapp hõlmas kultiveeritud allofibroblastide siirdamist kandekiledele ja kolmas etapp (48 tundi pärast kultiveeritud allofibroblastide siirdamist) hõlmas maatriksi eemaldamist ja autodermoplastiat nahaklappidega perforatsioonisuhtega 1:4. Kolmele raske põletushaigusega kliinikusse vastuvõetud patsiendile siirdati kultiveeritud allofibroblastid granuleerivatele haavadele. Kultiveeritud allofibroblastide siirdamine viidi läbi üks kord 18 lapsel, kaks korda 11 lapsel ja kolm korda kahel patsiendil. Rakukultuuriga kaetud haavapinna pindala oli vahemikus 30 kuni 3500 cm2. Kultiveeritud allofibroblastide efektiivsust hinnati nahasiirde kinnitumise üldise protsendi, põletuste paranemisaja ja raske termilise trauma tagajärjel suremuste arvu järgi. Transplantaadi kinnitumine oli täielik 86% patsientidest. Nahasiirde osalist mittesiirdumist täheldati 14% juhtudest. Vaatamata ravile suri kuus (19,3%) last. Nahakahjustuse kogupindala neil oli 40–70% kehapinnast.Kultiveeritud allofibroblastide siirdamine ei olnud seotud ühegi patsiendi põletuskahjustuse suremusega.

Ravi tulemusi analüüsides märgivad autorid, et varem sügavat termilist nahakahjustust, mis kattis 35–40% kehapinnast, peeti eluga kokkusobimatuks (nooremate laste – kuni 3-aastaste laste – puhul on kriitilised sügavad põletused, mis katavad 30% kehapinnast, vanemate laste puhul üle 40% kehapinnast). Kirurgilise nekrektoomia teostamisel koos kultiveeritud allofibroblastide siirdamisega ja sellele järgneva autodermoplastikaga kõrge perforatsioonikoefitsiendiga nahaklappidega jäävad IIIB–IV astme põletused kriitiliseks, kuid praegu on paljudel juhtudel väljavaated isegi selliste ohvrite elu päästmiseks. Kirurgiline nekrektoomia koos kultiveeritud allofibroblastide siirdamise ja autodermoplastikaga sügavate põletustega lastel on osutunud eriti efektiivseks laialt levinud nahakahjustustega patsientidel, kellel on doonorkohtade puudus. Aktiivne kirurgiline taktika ja kultiveeritud allofibroblastide siirdamine aitavad kaasa selliste patsientide üldise seisundi kiirele stabiliseerumisele, põletushaiguse nakkuslike tüsistuste arvu vähenemisele, soodsate tingimuste loomisele siirdamise kinnistumiseks, kaotatud naha taastumise aja ja statsionaarse ravi kestuse lühendamisele ning ulatuslike põletustega ohvrite surmaga lõppevate tulemuste sageduse vähenemisele. Seega võimaldab kultiveeritud allofibroblastide siirdamine koos järgneva autodermoplastiaga nahaklappidega taastuda raskete põletustega lastel, keda varem peeti hukule määratud.

Üldiselt arvatakse, et põletushaiguste ravi peamine eesmärk on kahjustatud naha võimalikult täielik ja kiire taastamine, et vältida toksilisi toimeid, nakkuslikke tüsistusi ja dehüdratsiooni. Kultiveeritud rakkude kasutamise tulemused sõltuvad suuresti põletushaava enda valmisolekust siirdamiseks. Kultiveeritud keratinotsüütide siirdamisel haava pinnale pärast kirurgilist nekrektoomiat siirdub keskmiselt 55% (pindala järgi) siirdatud rakkudest, samas kui granuleerivate haavade korral väheneb siirdumise määr 15%-ni. Seetõttu nõuab ulatuslike sügavate nahapõletuste edukas ravi ennekõike aktiivset kirurgilist taktikat. IIIB-IV astme põletushaavade korral vabastatakse põletuspind koheselt nekrootilisest koest, et vähendada joovet ja põletushaiguse tüsistuste arvu. Sellise taktika kasutamine on võtmetähtsusega, et vähendada aega põletuse saamisest kuni haavade sulgumiseni ja ulatuslike põletustega patsientide haiglas viibimise aega ning vähendab oluliselt ka surmaga lõppevate tulemuste arvu.

Esimesed teated kultiveeritud keratinotsüütide edukast kasutamisest põletuspindade katmiseks ilmusid 1980. aastate alguses. Seejärel viidi see manipuleerimine läbi kultiveeritud keratinotsüütide kihtide abil, mis saadi enamasti autorakkudest, palju harvemini allokeratinotsüütidest. Autokeratinotsütoplastika tehnoloogia ei võimalda aga rakupanga loomist ning piisava pindalaga keratinotsüütide siirdamiseks kuluv aeg on pikk ja ulatub 3-4 nädalani. Sel perioodil suureneb järsult põletushaiguse nakkuslike ja muude tüsistuste tekkimise oht, mis pikendab oluliselt patsientide haiglas viibimise aega. Lisaks ei juurdu autokeratinotsüüdid granuleerivatele põletushaavadele siirdamisel praktiliselt ning spetsiaalsete kasvukeskkondade ja keratinotsüütide kasvu bioloogiliselt aktiivsete stimulaatorite kõrge hind piirab oluliselt nende kliinilist kasutamist. Muud biotehnoloogilised meetodid, nagu kollageenplastika, krüokonserveeritud ksenoskini siirdamine ja erinevate biopolümeerkatete kasutamine, suurendavad ulatuslike pindmiste, kuid mitte sügavate põletuste ravi efektiivsust. Haavapinna katmise meetod kultiveeritud fibroblastidega on põhimõtteliselt erinev selle poolest, et kultiveeritud rakukihi põhikomponendina kasutatakse fibroblaste, mitte keratinotsüüte.

Meetodi väljatöötamise eelduseks olid andmed, et väikeseid veresooni ümbritsevad peritsüüdid on mesenhümaalsed eellasrakud, mis on võimelised transformeeruma fibroblastideks, mis toodavad paljusid kasvufaktoreid ja tagavad haavade paranemise tänu tugevale stimuleerivale toimele keratinotsüütide proliferatsioonile ja adhesioonile. Kultiveeritud fibroblastide kasutamine haavapindade sulgemiseks näitas koheselt selle meetodi mitmeid olulisi eeliseid võrreldes kultiveeritud keratinotsüütide kasutamisega. Eelkõige ei nõua fibroblastide saamine kultuuris spetsiaalsete toitainekeskkondade ja kasvustimulaatorite kasutamist, mis vähendab siirdamise maksumust enam kui 10 korda võrreldes keratinotsüütide saamise maksumusega. Fibroblastid passiveeruvad kergesti, mille käigus kaotavad nad osaliselt pinna histosobivusantigeenid, mis omakorda avab võimaluse kasutada allogeenseid rakke siirde valmistamiseks ja nende pankade loomiseks. Kliinikus kasutamiseks valmis siirde saamiseks kuluv aeg lüheneb 3 nädalalt (keratinotsüütide puhul) 1-2 päevani (fibroblastide puhul). Primaarset fibroblastikultuuri saab saada autodermoplastia käigus võetud nahafragmentidelt rakkude kultiveerimise teel ning inimese fibroblastide subkultuuride saamiseks on rakkude külvitihedus vaid 20 x 103 ¹ cm2 ^kohta.

Fibroblastide ja nende regulatoorsete valkude mõju uurimiseks keratinotsüütide proliferatsioonile ja diferentseerumisele viidi läbi keratinotsüütide morfoloogia ja proliferatsiooni võrdlev analüüs I ja III tüüpi kollageeni substraatidel, samuti fibronektiinil ühiskultuuris inimese fibroblastidega. Inimese keratinotsüüdid eraldati põletustega patsientide nahafragmentidest, mis võeti autodermoplastia ajal. Keratinotsüütide külvitihedus oli 50 x 103 rakku 1 cm2 kohta. Kultiveeritud fibroblastide siirdamise kliinilist efektiivsust hinnati 517 patsiendil. Kõik patsiendid jagati kahte rühma: 1. rühm - täiskasvanud patsiendid IIA, B-IV astme põletustega; 2. rühm - lapsed IIIB-IV astme sügavate põletustega. Ühekihiliste fibroblastide kultuuri struktuurilise ja funktsionaalse korralduse dünaamika hindamine, võttes arvesse glükosaminoglükaanide, fibronektiini ja kollageeni rolli regeneratsiooniprotsessides, võimaldas autoritel määrata 3. päeva fibroblastide kultuuride siirdamiseks kõige soodsamaks perioodiks. Uuring fibroblastide mõjust keratinotsüütide proliferatsioonile ja diferentseerumisele näitas, et in vitro fibroblastidel on väljendunud stimuleeriv toime, peamiselt keratinotsüütide adhesiooniprotsessidele, suurendades kinnitunud rakkude arvu ja nende fikseerimise kiirust enam kui 2 korda. Adhesiooniprotsesside stimuleerimisega kaasneb DNA sünteesi intensiivsuse ja keratinotsüütide proliferatsiooni taseme suurenemine. Lisaks selgus, et fibroblastide ja nende moodustunud rakuvälise maatriksi olemasolu on vajalik tingimus keratinotsüütide tonofibrillaarse aparaadi moodustumiseks, rakkudevahelisteks ühendusteks ja lõpuks keratinotsüütide diferentseerumiseks ja basaalmembraani moodustumiseks. Sügavate põletustega laste ravis on kindlaks tehtud allofibroblastikultuuri siirdamise kõrge kliiniline efektiivsus, eriti patsientide rühmas, kellel on ulatuslikud nahakahjustused doonorkoha puudulikkuse tingimustes. Põhjalik morfofunktsionaalne uuring on näidanud, et siirdatud fibroblastidele on iseloomulik DNA, samuti kollageeni, fibronektiini ja glükosaminoglükaanide aktiivne süntees, mis on osa rakkude moodustatud rakuvälisest maatriksist. Autorid osutavad siirdatud fibroblastide kõrgele sigimise protsendile (kuni 96%), nende saabumise aja järsule lühenemisele (24–48 tunni jooksul keratinotsüütide kasutamise korral 2–3 nädala asemel), põletuspinna epiteeliseerumise olulisele kiirenemisele, samuti fibroblastidest siiriku kasvatamise tehnoloogia maksumuse olulisele vähenemisele (10 korda) võrreldes keratinotsüütide siirdamisega. Kultiveeritud allofibroblastide siirdamise kasutamine võimaldab päästa kriitiliste põletustega laste elu – termiline kahjustus enam kui 50% kehapinnast.mida varem peeti eluga kokkusobimatuks. Tuleb märkida, et allogeensete embrüonaalsete fibroblastide siirdamisega on veenvalt tõestatud mitte ainult kiirem haavade taastumine ja erineva raskusastme ja pindalaga põletustega patsientide tervenemine, vaid ka nende suremuse märkimisväärne vähenemine.

Autoloogseid fibroblaste kasutatakse ka sellises keerulises plastilise kirurgia valdkonnas nagu häälepaelte vigastuste rekonstruktiivne korrektsioon. Selleks kasutatakse tavaliselt veise kollageeni, mille toime kestust piirab selle immunogeensus. Võõrvalguna on veise kollageen tundlik retsipiendi kollagenaasi suhtes ja võib põhjustada immuunreaktsioone, mille riski vähendamiseks töötati välja tehnoloogiad glutaraldehüüdiga ristseotud kollageenipreparaatide saamiseks. Nende eeliseks on suurem stabiilsus ja madalam immunogeensus, mis on leidnud praktilist rakendust häälepaelte defektide ja atroofia kõrvaldamisel. Autoloogse kollageeni süstimist kasutati esmakordselt 1995. aastal. See tehnika tagas autoloogsete kollageenikiudude primaarstruktuuri, sealhulgas molekulisiseste ensümaatiliselt katalüüsitud ristsidemete säilimise. Fakt on see, et looduslikud kollageenikiud on proteaaside poolt hävitamise suhtes vastupidavamad kui taastatud kollageen, milles telopeptiidid on lõigatud. Telopeptiidide terviklikkus on oluline kollageenikiudude kvaternaarse struktuuri ja külgnevate kollageenimolekulide vaheliste ristsidemete moodustumise jaoks. Erinevalt veise kollageeni preparaatidest ei põhjusta autoloogne kollageen retsipiendil immuunreaktsioone, kuid see ei ole piisavalt efektiivne taastava ainena. Stabiilse korrektsiooni saab saavutada lokaalse kollageeni tootmise kaudu autoloogsete fibroblastide siirdamise teel. Autoloogse fibroblastide siirdamise efektiivsuse uurimisel kliinilises praktikas tuvastati aga teatud raskusi. Varasel perioodil pärast fibroblastide siirdamist oli kliiniline efekt nõrgem võrreldes veise kollageeni sisseviimise järgse ajaga. Autoloogsete fibroblastide kultiveerimisel ei saa välistada normaalsete fibroblastide transformeerumist patoloogilisteks, nn müofibroblastideks, mis vastutavad fibroosi ja armide tekke eest, mida tõendab kollageenigeeli kokkutõmbumine, mis on põhjustatud fibroblastide ja kollageenifibrillide spetsiifilisest interaktsioonist. Lisaks kaotavad fibroblastid pärast järjestikust in vitro passaaži võime sünteesida rakuvälise maatriksi valke.

Siiski on nüüd eksperimentaalselt välja töötatud meetod autoloogsete inimese fibroblastide kultiveerimiseks, mis kõrvaldab eespool nimetatud puudused ega põhjusta normaalsete fibroblastide onkogeenset transformatsiooni. Selle meetodi abil saadud autoloogseid fibroblaste kasutatakse pehmete näokudede defektide taastamiseks. G. Keller jt (2000) uuringus raviti 20 patsienti vanuses 37–61 aastat, kellel olid kortsud ja atroofilised armid. Retroaurikulaarsest piirkonnast võetud nahabiopsiad (4 mm) transporditi laborisse steriilsetes katseklaasides, mis sisaldasid 10 ml kultuurikeskkonda (Eagle'i sööde antibiootikumi, mükoseptiku, püruvaadi ja vasikaloote seerumiga). Materjal pandi 3–5 60 mm läbimõõduga kultuurinõusse ja inkubeeriti termostaadis 5% CO2 sisaldava atmosfääriga. 1 nädala pärast eemaldati rakud nõudest trüpsiniseerimise teel ja pandi 25 cm2 viaalidesse. Rakke süstiti patsientidele koguses 4 x 107. Märkimisväärset ja püsivat kliinilist efekti täheldati patsientidel nasolabiaalsete voltide korrigeerimise ajal, samuti armidega patsientidel 7 ja 12 kuud pärast autoloogsete fibroblastide kolmandat siirdamist. Voolutsütomeetria kohaselt tootsid kultiveeritud fibroblastid suures koguses I tüüpi kollageeni. In vitro uuringud on näidanud süstitud fibroblastide normaalset kontraktiilsust. Kaks kuud pärast kultiveeritud fibroblastide subkutaanset manustamist annuses 4 x 107 rakku ei tuvastatud karvututel hiirtel kasvajaid. Süstitud fibroblastid ei põhjustanud patsientidel armistumist ega difuusset fibroosi. Autori sõnul on siirdatud autoloogsed fibroblastid võimelised pidevalt tootma kollageeni, mis annab kosmeetilise noorendava efekti. Samal ajal, kuna diferentseerunud rakkude eluiga on piiratud, on noorelt patsiendilt võetud fibroblastid efektiivsemad kui eakatelt inimestelt saadud fibroblastid. Tulevikus eeldatakse, et noorelt doonorilt võetud fibroblastide kultuuri on võimalik krüokonserveerida, et hiljem tema enda noored rakud eakale patsiendile siirdada. Kokkuvõtteks võib öelda, et pole täiesti õige järeldada, et autoloogsed fibroblastid, eeldusel, et need on funktsionaalselt säilinud, on ideaalne vahend näo pehmete kudede defektide korrigeerimiseks. Samal ajal märgib autor ise, et uuringu käigus tekkisid mõned autoloogse fibroblast-kollageensüsteemi kasutamisega seotud problemaatilised olukorrad. Kliiniline efekt oli sageli nõrgem kui veisekollageeni kasutamisel, mis põhjustas patsientidel pettumust.

Üldiselt näevad kirjanduse andmed mesenhümaalsete tüvirakkude kliinilise kasutamise väljavaadete kohta üsna optimistlikud väljavaated. Autoloogseid luuüdi multipotentseid mesenhümaalseid eellasrakke püütakse kasutada degeneratiivsete liigesekahjustuste raviks. Käimas on esimesed kliinilised uuringud kultiveeritud mesenhümaalsete eellasrakkude kasutamise kohta keeruliste luumurdude ravis. Auto- ja allogeenseid mesenhümaalseid luuüdi stroomarakke kasutatakse kõhrkoe loomiseks siirdamiseks trauma või autoimmuunsete kahjustuste tagajärjel tekkinud liigesekõhre defektide korrigeerimisel. Töötatakse välja meetodeid multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude kliiniliseks kasutamiseks luudefektide kõrvaldamiseks lastel, kellel on I tüüpi kollageeni geeni mutatsioonide põhjustatud raske mittetäielik osteogenees. Pärast müeloablatsiooni siirdatakse retsipientlastele HLA-ühilduvate tervete doonorite luuüdi, kuna fraktsioneerimata luuüdi võib sisaldada piisavas koguses mesenhümaalseid tüvirakke raske luudefekti kompenseerimiseks. Pärast allogeense luuüdi siirdamist on sellistel lastel täheldatud positiivseid histoloogilisi muutusi trabekulaarsetes luudes, kasvukiiruse suurenemist ja luumurdude esinemissageduse vähenemist. Mõnel juhul saavutatakse positiivne kliiniline tulemus lähedaste allogeensete luuüdi ja osteoblastide siirdamise teel. MSC siirdamist kasutatakse ka kaasasündinud luuhapruse raviks, mis on põhjustatud osteoblastide ja osteoklastide tasakaalustamatusest luukoes. Sellisel juhul saavutatakse luukoe moodustumise taastamine patsientide luukoes olevate tüvi- ja eellasrakkude stromaalrakkude kogumi kimäriseerimise teel.

Jätkatakse doonori mesenhümaalsete tüvirakkude geneetilise modifitseerimise meetodite täiustamist strooma kudede geneetiliste defektide korrigeerimise eesmärgil. Eeldatakse, et lähitulevikus hakatakse mesenhümaalseid eellasrakke neuroloogias kasutama ajurakkude sihipäraseks kimäriseerimiseks ja tervete rakkude kogumi loomiseks, mis on võimelised tootma haiguse kliiniliste ilmingute eest vastutavat puudulikku ensüümi või faktorit. Mesenhümaalsete tüvirakkude siirdamist saab kasutada luuüdi strooma taastamiseks vähihaigetel pärast kiiritus- ja keemiaravi ning kombinatsioonis luuüdirakkudega vereloome taastamiseks. Asendusravi väljatöötamist, mille eesmärk on kõrvaldada lihasluukonna defektid MSC-de abil, soodustavad inseneriteaduse arengud mesenhümaalsete tüvirakkude järglastest koosnevaid raame moodustavate maatriksbiomaterjalide või biomimeetikumide disaini valdkonnas.

Mesenhümaalsete tüvirakkude allikad

Mesenhümaalsete tüvirakkude peamine allikas on luuüdi, mille hematopoeetilised tüvirakud imetajate kehas diferentseeruvad pidevalt vere- ja immuunsüsteemi rakkudeks, samas kui mesenhümaalseid tüvirakke esindab väike populatsioon luuüdi strooma fibroblastitaolisi rakke ja need aitavad kaasa hematopoeetiliste tüvirakkude diferentseerumata seisundi säilimisele. Teatud tingimustel diferentseeruvad mesenhümaalsed tüvirakud kõhre- ja luukoe rakkudeks. Madala tihedusega külvitingimustes kultuurikeskkonnale külvates moodustavad luuüdi mononukleaarsed stroomarakud adhesiivrakkude kolooniaid, mis on tegelikult fibroblastitaolised multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud. Mõned autorid usuvad, et luuüdisse ladestuvad mittesiduvad mesenhümaalsed tüvirakud, mis oma võime tõttu ise uueneda ja kõrge diferentseerumispotentsiaali tõttu varustavad kõiki keha kudesid stromaalsete elementide mesenhümaalsete eellasrakkudega kogu imetaja organismi eluea jooksul.

Luuüdis moodustavad strooma rakulised elemendid võrgustiku, mis täidab ruumi sinusoidide ja luukoe vahel. Täiskasvanu luuüdis uinunud MSC-de sisaldus on võrreldav hematopoeetiliste tüvirakkude hulgaga ega ületa 0,01–0,001%. Luuüdist eraldatud ja kultiveerimata mesenhümaalsed tüvirakud on adhesioonimolekulidest vabad. Sellised MSC-d ei ekspresseeri CD34, ICAM, VCAM, I ja III tüüpi kollageeni, CD44 ja CD29. Seega ei kinnitu in vitro kultuurisubstraadile mitte mesenhümaalsed tüvirakud, vaid mesenhümaalsete tüvirakkude arenenumad eellasderivaadid, mis on juba moodustanud tsütoskeleti ja rakkude adhesioonimolekulide retseptoraparaadi komponendid. CD34 fenotüübiga stroomarakke leidub isegi perifeerses veres, kuigi luuüdis on neid oluliselt vähem kui CD34-positiivseid mononukleaarseid rakke. Verest eraldatud ja kultuuri üle kantud CD34 rakud kinnituvad substraadile ja moodustavad fibroblastitaoliste rakkude kolooniaid.

On teada, et embrüonaalsel perioodil tekib kõigi imetajate ja inimeste organite ja kudede strooma alus ühisest mesenhümaalsete tüvirakkude kogumist enne organogeneesi ja selle staadiumis. Seetõttu arvatakse, et küpses organismis peaks suurem osa mesenhümaalseid tüvirakke asuma side- ja luukoes. On kindlaks tehtud, et lahtise side- ja luukoe strooma rakuliste elementide põhiosa esindavad pühendunud eellasrakud, mis aga säilitavad võime in vitro prolifereeruda ja kloone moodustada. Kui sellised rakud viiakse üldvereringesse, implanteeritakse üle 20% mesenhümaalsetest eellasrakkudest vereloomekoe ja parenhüümsete organite strooma elementide hulka.

Mesenhümaalsete tüvirakkude potentsiaalne allikas on rasvkude, mille tüvirakkude hulgas on tuvastatud erineval määral pühendunud adipotsüütide eellasrakke. Rasvkoe kõige vähem küpsed eellasrakud on strooma-vaskulaarsed rakud, mis sarnaselt luuüdi multipotentsele mesenhümaalsele eellasrakule on võimelised glükokortikoidide, insuliinilaadse kasvufaktori ja insuliini mõjul diferentseeruma adipotsüütideks. Kultuuris diferentseeruvad strooma-vaskulaarsed rakud adipotsüütideks ja kondrotsüütideks ning luuüdi päritolu rasvkoes leidub rakke, mis moodustavad adipotsüüte ja osteoblaste.

Strooma tüvirakke on leitud ka lihastest. Inimese skeletilihastest eraldatud rakkude primaarkultuuris tuvastatakse stellaatrakke ja mitmetuumalisi müotuube. Hobuse seerumi juuresolekul prolifereeruvad stellaatrakud in vitro ilma tsütodiferentseerumise tunnusteta ning pärast deksametasooni lisamist toitekeskkonda iseloomustab nende diferentseerumist skeleti- ja silelihasrakkude, luu, kõhre ja rasvkoe fenotüübiga rakuliste elementide ilmumine. Seetõttu esinevad inimese lihaskoes nii pühendunud kui ka mittesiduvad multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud. On näidatud, et skeletilihastes esinevate eellasrakkude populatsioon pärineb luuüdi mittesidutud multipotentsetest mesenhümaalsetest eellasrakkudest ja erineb müogeensetest satelliitrakkudest.

Vastsündinud rottide müokardis leiti ka adhesiivseid stellaatrakke, mis vastavad diferentseerumispotentsiaaliga multipotentsetele mesenhümaalsetele eellasrakkudele, kuna deksametasooni mõjul diferentseeruvad nad adipotsüütideks, osteoblastideks, kondrotsüütideks, silelihasrakkudeks, skeletilihaste müotuubuliteks ja kardiomüotsüütideks. On näidatud, et veresoonte silelihasrakud (peritsüüdid) on diferentseerumata perivaskulaarsete multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude derivaadid. Kultuuris ekspresseerivad perivaskulaarsed mesenhümaalsed tüvirakud silelihaste α-aktiini ja trombotsüütidest pärinevat kasvufaktori retseptorit ning on võimelised diferentseeruma vähemalt silelihasrakkudeks.

Tüvevarude seisukohast on eriline koht kõhrkoel, mille äärmiselt madal reparatiivne potentsiaal arvatakse olevat tingitud multipotentsete mesenhümaalsete eelrakkude või diferentseerumis- ja kasvufaktorite puudusest. Eeldatakse, et kondro- ja osteogeneesile eelnevalt pühendunud multipotentsed mesenhümaalsed eelrakud sisenevad kõhrkoesse teistest kudedest.

Mesenhümaalsete eellasrakkude koe päritolu ja kinnitumistingimused kõõlustes ei ole samuti kindlaks tehtud. Eksperimentaalsed vaatlused näitavad, et varases postnataalses perioodis säilitavad küüliku Achilleuse kõõluse rakud primaarkultuurides ja esimesel passaažil I tüüpi kollageeni ja dekoriini ekspressiooni, kuid edasise kultiveerimise käigus kaotavad nad tenotsüütide diferentseerumismarkerid.

Tuleb märkida, et vastust küsimusele, kas erinevates kudedes lokaliseeritud multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud on tegelikult pidevalt oma stroomas olemas või kas mesenhümaalsete tüvirakkude koevaru täieneb luuüdi strooma tüvirakkude migratsiooni teel, pole veel saadud.

Lisaks täiskasvanud organismi luuüdile ja teistele mesenhümaalsetele koetsoonidele võib nabaväädiveri olla veel üks MSC-de allikas. On näidatud, et nabaväädi veeniveri sisaldab rakke, millel on sarnased morfoloogilised ja antigeensed omadused multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkudega, mis on võimelised adhesiooniks ja ei ole diferentseerumispotentsiaalilt halvemad kui luuüdist pärinevad multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud. Nabaväädivere mesenhümaalsete tüvirakkude kultuurides leiti 5–10% mittesiduvaid multipotentseid mesenhümaalseid eellasrakke. Selgus, et nende arv nabaväädiveres on pöördvõrdeline gestatsiooniajaga, mis kaudselt näitab multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude migratsiooni erinevatesse kudedesse loote arengu ajal. Ilmus esimene teave nabaväädiverest eraldatud mesenhümaalsete tüvirakkude, samuti embrüonaalsest biomaterjalist saadud tüvirakkude kliinilise kasutamise kohta, mis põhineb loote tüvirakkude teadaoleval võimel integreeruda, siirduda ja toimida täiskasvanud retsipientide organites ja koesüsteemides.

Uute mesenhümaalsete tüvirakkude allikate otsimine

Embrüonaalse päritoluga mesenhümaalsete tüvirakkude, aga ka teiste looterakkude kasutamine tekitab hulga eetilisi, õiguslikke, kohtulikke ja seadusandlikke probleeme. Seetõttu jätkub ekstraembrüonaalse doonorrakkude materjali otsing. Inimese naha fibroblastide kliinilise kasutamise katse ebaõnnestus, mida määras mitte ainult tehnoloogia kõrge finantsvõimsus, vaid ka fibroblastide kiire diferentseerumine fibrotsüütideks, millel on oluliselt madalam proliferatsioonipotentsiaal ja mis toodavad piiratud arvu kasvufaktoreid. Edasine areng MSC-de ja luuüdi multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude bioloogia uurimisel võimaldas meil välja töötada strateegia autoloogsete mesenhümaalsete tüvirakkude kliiniliseks kasutamiseks. Nende eraldamise, kultiveerimise, ex vivo paljundamise ja sihipärase diferentseerimise tehnoloogia nõudis ennekõike MSC-de molekulaarsete markerite spektri uurimist. Nende analüüs näitas, et inimese luukoe primaarsed kultuurid sisaldavad mitut tüüpi multipotentseid mesenhümaalseid eellasrakke. Proosteoblastide fenotüüp tuvastati rakkudes, mis ekspresseerivad strooma eellasrakkude markerit STRO-1, kuid ei kanna osteoblastide markerit - aluselist fosfataasi. Selliseid rakke iseloomustab madal võime moodustada mineraliseerunud luumaatriksit, samuti osteopontüni ja paratüreoidhormooni retseptori ekspressiooni puudumine. STRO-1-positiivsete rakkude derivaate, mis ei ekspresseeri aluselist fosfataasi, esindavad vahepealse ja täielikult diferentseerunud osteoblastid. Leiti, et STRO-1-positiivsete inimese trabekulaarsete luurakkude kloonitud liinide rakulised elemendid on võimelised diferentseeruma küpseteks osteotsüütideks ja adipotsüütideks. Nende rakkude diferentseerumise suund sõltub polüküllastumata rasvhapete, põletikku soodustavate tsütokiinide - IL-1b ja tuumorinekroosifaktor a (TNF-a), samuti põletikuvastase ja immunosupressiivse TGF-b toimest.

Hiljem leiti, et multipotentsetel mesenhümaalsetel eellasrakkudel puudub neile omane spetsiifiline fenotüüp, kuid nad ekspresseerivad mesenhümaalsetele, endoteeli-, epiteeli- ja lihasrakkudele iseloomulike markerite kompleksi hematopoeetiliste rakkude immunofenotüübiliste antigeenide - CD45, CD34 ja CD14 - ekspressiooni puudumisel. Lisaks toodavad mesenhümaalsed tüvirakud konstitutiivselt ja indutseeritavalt hematopoeetilisi ja mittehematopoeetilisi kasvufaktoreid, interleukiine ja kemokiine ning multipotentsetel mesenhümaalsetel eellasrakkudel ekspresseeritakse mõnede tsütokiinide ja kasvufaktorite retseptoreid. Inimkeha strooma maatriksi rakkude hulgast on leitud uinunud ehk puhkeolekus rakke, mille immunofenotüüp on peaaegu identne 5-fluorouratsiiliga töötlemata multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude antigeeniprofiiliga - mõlemad rakud ekspresseerivad CD117, mis tähistab "täiskasvanud" tüvirakke.

Seega ei ole mesenhümaalsetele tüvirakkudele ainuomast rakumarkerit veel tuvastatud. Eeldatakse, et puhkeolekus rakud esindavad mittesiduvate multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude populatsiooni, kuna need ei ekspresseeri osteo- (Cbfa-1) või adipogeneesile (PPAR-y-2) pühendunud rakkude markereid. Aeglaselt prolifereeruvate puhkeolekus rakkude pikaajaline kokkupuude loote veise seerumiga viib terminaalselt diferentseeruvate pühendunud eellasrakkude moodustumiseni, mida iseloomustab kiire kasv. Selliste mesenhümaalsete tüvirakkude klonaalset laienemist toetab FGF2. Näib, et strooma tüvirakkude genoom on üsna tihedalt "suletud". On teateid spontaanse diferentseerumise puudumisest MSC-des - ilma spetsiaalsete pühendumistingimusteta ei transformeeru nad isegi mesenhümaalse liini rakkudeks.

Mesenhümaalsete tüvirakkude derivaatide populatsioonistruktuuri uurimiseks otsitakse diferentseerumise markervalke strooma rakuliinides ja primaarkultuurides. Luuüdi kolooniaid moodustavate rakkude in vitro klonaalne analüüs on näidanud, et EGF suurendab primaarkultuuridele rakendamisel koloonia keskmist suurust ja vähendab aluselise fosfataasi klonaalset ekspressiooni, samas kui hüdrokortisooni lisamine aktiveerib aluselise fosfataasi ekspressiooni, mis on MSC diferentseerumise osteogeense suuna marker. STRO-1 vastased monoklonaalsed antikehad võimaldasid eraldada ja uurida STRO-1-positiivsete adhesiivrakkude populatsiooni Dexteri kultuuride heterogeenses süsteemis. On kindlaks määratud tsütokiinide spekter, mis reguleerib mitte ainult hematopoeetiliste ja lümfoidsete rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumist, vaid osaleb ka skeleti kudede moodustumisel, moodustumisel ja resorptsioonil para-, auto- ja endokriinsete mehhanismide kaudu. Selliste sekundaarsete virgatsainete nagu cAMP, diatsüülglütserooli, inositooltrifosfaadi ja Ca2+ retseptori vahendatud vabanemist kasutatakse ka vastavaid retseptoreid ekspresseerivate strooma kudede rakkude erinevate kategooriate markeranalüüsiks. Monoklonaalsete antikehade kasutamine markeritena võimaldas kindlaks teha lümfoidsete organite strooma retikulaarsete rakkude kuuluvuse T- ja B-sõltuvatesse tsoonidesse.

Mõnda aega jätkusid teaduslikud vaidlused MSC-de võimalikkuse üle vereloome tüvirakkudest. Tõepoolest, kui luuüdi rakkude suspensioone siirdada monokihikultuuridesse, kasvavad neis eraldiseisvad fibroblastide kolooniad. Siiski näidati, et fibroblastide kolooniate eellasrakkude ja vereloomekoe diferentseerumise mitmesuguste võrsete olemasolu luuüdis ei tõenda nende ühist päritolu vereloome tüvirakkudest. Luuüdi tüvirakkude diskriminantanalüüsi abil tehti kindlaks, et heterotoopse luuüdi siirdamise ajal tekkivat mikrokeskkonda vereloome rakud ei kanna üle, mis tõestab MSC-de populatsiooni olemasolu luuüdis, mis on histogeneetiliselt vereloome rakkudest sõltumatu.

Lisaks võimaldas selektiivne kloonimismeetod tuvastada luuüdi rakkude ühekihilistes kultuurides uut tüüpi strooma eellasrakke, määrata nende arvu ning uurida nende omadusi, proliferatsiooni- ja diferentseerumispotentsiaali. Selgus, et strooma fibroblastilaadsed rakud prolifereeruvad in vitro ja moodustavad diploidseid kolooniaid, mis kehasse tagasi siirdamisel tagavad uute vereloomeorganite moodustumise. Üksikute kloonide uuringu tulemused näitavad, et strooma eellasrakkude hulgas on rakkude populatsioon, mis oma proliferatsiooni- ja diferentseerumispotentsiaali poolest võib väita, et need on stroomakoe tüvirakud, mis on histogeneetiliselt vereloome tüvirakkudest sõltumatud. Selle populatsiooni rakke iseloomustab isetasanduv kasv ja nad diferentseeruvad luuüdi luu, kõhre ja retikulaarse koe eellasrakkude elementideks.

Väga huvipakkuvad on R. Chailakhyani ja kaasautorite (1997–2001) uuringute tulemused, milles kultiveeriti küülikute, merisigade ja hiirte luuüdi stromaalseid eellasrakke a-MEM söötmel, millele oli lisatud vasikaloote seerumit. Autorid viisid läbi eksplantatsiooni algtihedusega 2–4 x 103 luuüdi rakku 1 cm2 kohta. Homoloogseid või heteroloogseid kiirgusega inaktiveeritud luuüdirakke kasutati söötjana annuses, mis säilitas söötja efekti, kuid blokeeris täielikult nende proliferatsiooni. Kahe nädala vanuseid fibroblastide primaarseid eraldiseisvaid kolooniaid trüpsiniseeriti, et saada monoklonaalseid tüvesid. Kolooniate klonaalse päritolu kohta saadi tõendid kromosomaalse markeri abil isaste ja emaste merisigade segatud luuüdi kultuurides, eluskultuuride aeglustatud pildistamisel ning CBA ja CBAT6T6 hiirte süngeense luuüdi segakultuurides. Värskelt isoleeritud luuüdirakkude või in vitro kasvatatud stroomafibroblastide suspensiooni siirdamine neerukapsli alla viidi läbi ivaloni või želatiinist poorsetesse karkassidesse, samuti inaktiveeritud küüliku käsnjasse luumaatriksisse. Kloonide siirdamiseks luuümbrisesse puhastati merisea reieluud pehmetest kudedest ja luuümbrisest, epifüüsid kärbiti ja luuüdi pesti põhjalikult välja. Luu lõigati fragmentideks (3-5 mm), kuivatati ja kiiritati annusega 60 Gy. Üksikud fibroblastide kolooniad paigutati luuümbristesse ja implanteeriti intramuskulaarselt. In vitro kasvatatud stroomafibroblastide intraperitoneaalseks siirdamiseks kasutati A-tüüpi (V = 0,015 cm3, h = 0,1 mm) ja O-tüüpi (V = 0,15 cm3, h = 2 mm) difusioonikambreid.

Kloonsete tüvede kasvudünaamikat uurides leidsid R. Chailakhyan jt (2001), et nii fibroblastide kolooniaid moodustavatel üksikutel rakkudel kui ka nende järglastel on tohutu proliferatiivne potentsiaal. 10. passaažiks oli mõnes tüves fibroblastide arv 1,2–7,2 x 109 ^rakku. Oma arengu käigus tegid nad kuni 31–34 rakkude kahekordistumist. Sellisel juhul viis mitmekümne klooni strooma eellasrakkudest moodustunud luuüdist pärinevate tüvede heterotoopne siirdamine luuüdi mikrokeskkonna ülekandeni ja uue hematopoeetilise organi moodustumiseni siirdamisvööndis. Autorid esitasid küsimuse, kas üksikud kloonid on võimelised üle kandma stroomarakkude luuüdi mikrokeskkonda või on selleks vaja mitme erineva klonogeense strooma eellasrakkude koostööd? Ja kui üksikud kloonid on võimelised mikrokeskkonda üle kandma, kas see on täielik kõigi kolme hematopoeetilise võrse jaoks või tagavad erinevad kloonid mikrokeskkonna moodustumise erinevatele hematopoeetilistele võrsetele? Nende probleemide lahendamiseks töötati välja tehnoloogia strooma eellasrakkude kultiveerimiseks kollageengeelil, mis võimaldab kasvanud fibroblastide kolooniaid pinnalt eemaldada järgnevaks heterotoopseks siirdamiseks. CBA hiirte ja merisigade luuüdi rakkudest kasvatatud strooma fibroblastide individuaalsed kloonid lõigati koos geelkatte fragmendiga välja ja siirdati heterotoopselt - süngeensete hiirte neerukapsli alla või autoloogsete merisigade kõhulihasesse. Lihasesse siirdamisel paigutati geelil olevad kolooniad luuümbristesse.

Autorid leidsid, et 50–90 päeva pärast luuüdi fibroblastide kolooniate siirdamist täheldati 20%-l juhtudest siirdamistsoonis luu või luu- ja vereloomekoe arengut. 5%-l retsipientloomadest sisaldasid moodustunud luukoe fookused luuüdiga täidetud õõnsust. Luusilindrite sees olid sellised fookused ümara kujuga ja neil oli luukoest ehitatud kapsel osteotsüütide ja hästi arenenud osteoblastilise kihiga. Luuüdi õõnsus sisaldas retikulaarset kude müeloidsete ja erütroidsete rakkudega, mille proportsionaalne suhe ei erinenud normaalsest luuüdist. Neeru puhul oli siirdatud tüüpiline luuüdi organ, mis moodustus natiivse luuüdi siirdamise käigus, kusjuures luukapsel kattis luuüdi õõnsust ainult neerukapsli küljelt. Vereloomekoe sisaldas müeloidseid, erütroidseid ja megakarüotsüütilisi elemente. Luuüdi õõnsuse stroomal oli hästi arenenud siinussüsteem ja see sisaldas tüüpilisi rasvarakke. Samal ajal leiti mõnede kolooniate siirdamistsoonis neerukapsli all luukude ilma vereloome tunnusteta. Individuaalsete kloonide proliferatiivse ja diferentseerumispotentsiaali uurimist jätkati küülikute monoklonaalsete luuüditüvedega, mille rakud resuspendeeriti toitekeskkonnas ja eraldi ivalon käsnas massiga 1-2 mg siirdati küüliku luuüdidoonori neerukapsli alla. Sellisele autotransplantatsioonile allutati 21 monoklonaalse tüve rakud. Tulemused võeti arvesse 2-3 kuu pärast. Autorid leidsid, et 14% juhtudest moodustasid siirdatud monoklonaalsed tüved luuüdi organi, mis koosnes luukoest ja hematopoeetiliste rakkudega täidetud luuüdiõõnsusest. 33% juhtudest moodustasid siirdatud tüved erineva suurusega kompaktse luu, mille õõnsustesse olid imbunud osteotsüüdid ja arenenud osteoblastiline kiht. Mõnel juhul arenes siirdatud kloonidega käsnades retikulaarne kude ilma luu või hematopoeetiliste elementideta. Mõnikord moodustus retikulaarne stroom hästi arenenud sinusoidide võrgustikuga, kuid mitte hematopoeetiliste rakkudega. Seega olid saadud tulemused sarnased kollageengeelil kloonisiirdamise käigus saadud andmetega. Kui aga substraadil kasvatatud kloonide siirdamine viis luuüdi koe moodustumiseni 5% juhtudest, luukoe moodustumiseni 15% juhtudest ja retikulaarse koe moodustumiseni 80% juhtudest, siis monoklonaalsete tüvede siirdamisel täheldati luuüdi elementide moodustumist 14% juhtudest, luukoe moodustumiseni 53% juhtudest ja retikulaarse koe moodustumiseni 53% juhtudest. Autorite sõnul näitab see, et stroomaalsete fibroblastide proliferatiivse ja diferentseerumispotentsiaali rakendamise tingimused siirdamisel poorsetele karkassidele olid optimaalsemad kui nende siirdamisel luuümbristesse ja kollageensubstraadile.On võimalik, et kloonide kultiveerimise ja pöördsiirdamise keerukamate meetodite kasutamine võib parandada kloonide diferentseerumispotentsiaali realiseerimise tingimusi ja muuta neid suhteid. Ühel või teisel viisil, kuid läbiviidud uuringute peamine tähtsus seisneb selles, et mõned stroomarakkude kloonid on võimelised moodustama luukoe ja samaaegselt pakkuma strooma hematopoeetilist mikrokeskkonda korraga kolmele luuüdi vereloome võrsele: erütroidsele, müeloidsele ja megakarüotsüütilisele, luues üsna suured hematopoeetilise koe ja osa luumassi platvormid.

Seejärel käsitlesid autorid küsimust üksikute klonogeensete strooma eellasrakkude võimest läbida seda tüüpi rakkude diferentseerumist suletud difusioonikambrite süsteemis. Lisaks oli vaja kindlaks teha, kas üksikutel kloonidel on polüpotentsus või kas diferentseerumispotentsiaali avaldumine nõuab mitme fikseeritud tsütodiferentseerumistunnusega klooni koostööd, mille erinevad suhted määravad luu-, retikulaarse või kõhrekoe eelistatud moodustumise. Kahe metodoloogilise lähenemisviisi kombineerimisel - luuüdi strooma eellasrakkude monoklonaalsete tüvede saamisel ja nende siirdamisel difusioonikambritesse - saavutasid R. Chailakhyan ja kaasautorid (2001) tulemusi, mis võimaldasid neil lähemale jõuda luuüdi strooma struktuurilise korralduse mõistmisele. Strooma eellasrakkude monoklonaalsete tüvede siirdamine O-tüüpi kambritesse viis nii luu- kui ka kõhrekoe moodustumiseni, mis näitab ühe strooma kolooniat moodustava raku järeltulijate võimet moodustada samaaegselt luu- ja kõhrekoe. Eeldust, et luu- ja kõhrekoe pärinevad ühisest strooma eellasrakust, on korduvalt esitatud. Sellel hüpoteesil polnud aga õiget eksperimentaalset kinnitust. Luu ja kõhre moodustumine difusioonikambrites oli vajalik tõend nende kahe koetüübi ühise eellasraku olemasolu kohta luuüdi strooma tüvirakkude hulgas.

Seejärel paigutati küüliku luuüdi primaarkultuuridest saadud teise ja kolmanda passaaži 29 klonaalset tüve difusioonikambritesse ja implanteeriti intraperitoneaalselt homoloogsetele loomadele. Uuringud näitasid, et 45%-l luuüdi monoklonaalsetest tüvedest on osteogeenne potentsiaal. Üheksa kambrit sisaldasid ainult retikulaarset kude, kuid see esines koos luu- ja kõhrkoega veel 13 kambris, mis moodustasid 76% kõigist tüvedest. O-tüüpi kambrites, kus oli võimalik nii luu- kui ka kõhrkoe diferentseerumine, uuriti 16 tüve. Neljas kambris (25%) moodustus nii luu- kui ka kõhrkoe. Tuleb veel kord märkida, et R. Chailakhyani jt (2001) uuringutes läbisid üksikud eellasrakud rakutüve piires 31 kuni 34 kahekordistumist ja nende järglased koosnesid 0,9–2,0 x 109 ^rakust. Polüklonaalsete tüvede eellasrakkude läbitud mitooside arv oli praktiliselt identne monoklonaalsete tüvede omaga. Polüklonaalsete tüvede arengukiirus, eriti nende moodustumise esimeses faasis, sõltus olulisel määral tüvede initsieerimiseks kasutatud kolooniate arvust. Inimese embrüonaalsete fibroblastide (WI-38) diploidsed tüved moodustasid 12.-15. kahekordistumisastmel uuesti kloonimisel samuti kolooniaid, mis erinesid läbimõõdu ja rakkude sisalduse poolest. Suured kolooniad, mis sisaldasid üle 103 raku, moodustasid vaid 5-10%. Jagunemiste arvu suurenemisega vähenes suurte kolooniate osakaal. Luuüdi strooma fibroblastide mono- ja polüklonaalsed tüved säilitasid diploidse kromosoomikomplekti ka pärast 20 või enamat kahekordistumist ning nende arengu tendents oli võrreldav embrüonaalsete fibroblastide diploidsete tüvede arengudünaamikaga. Üksikute luuüdi strooma eellasrakkude diferentseerumispotentsiaali analüüs, mis viidi läbi monoklonaalsete tüvede siirdamise teel difusioonikambritesse, näitas, et pooled neist olid osteogeensed. Suured kolooniad moodustasid 10% nende koguarvust. Järelikult vastas osteogeensete kolooniat moodustavate rakkude arv ligikaudu 5%-le nende kogupopulatsioonist. Autorite poolt tuvastatud osteogeensete eellasrakkude kogumass hõlmas rakke, mis on võimelised samaaegselt moodustama nii luu- kui ka kõhrekude. Lisaks tehti esmakordselt kindlaks, et neil kahel koetüübil täiskasvanud organismis on ühine eellasrakk: 25% testitud kloonidest olid loodud selliste rakkude poolt ja nende arv eellasrakkude kogupopulatsioonis oli vähemalt 2,5%.

Seega on luuüdi fibroblastide üksikute kloonide heterotoopne siirdamine paljastanud mesenhümaalsete eellasrakkude populatsiooni struktuurilise korralduse uusi aspekte. On leitud strooma eellasrakke, mis on võimelised korraga üle kandma spetsiifilist mikrokeskkonda kõigile hematopoeetilistele võrsetele, mille arv erinevates mudelites uuritud suurte kloonide hulgas on vahemikus 5 kuni 15% (0,5-1,5% tuvastatud eellasrakkude koguarvust). Lisaks kloonidele, mis kannavad üle kogu luuüdi mikrokeskkonna, on olemas ainult osteogeneesile määratud eellasrakud, mis avatud süsteemis ülekandmisel moodustavad luukoe, mis ei toeta vereloome arengut. Nende arv eellasrakkude koguarvust on 1,5-3%. Mõned neist rakkudest on võimelised moodustama luukoe piiratud isehooldusperioodiga. Järelikult on strooma eellasrakkude populatsioon oma diferentseerumispotentsiaalilt heterogeenne. Nende hulgas on rakkude kategooria, mis väidavad end olevat strooma tüvirakud, mis on võimelised diferentseeruma kõigis kolmes luuüdi stroomakoele iseloomulikus suunas, moodustades luu-, kõhre- ja retikulaarkude. Esitatud andmed lubavad loota, et erinevate rakumarkerite abil on võimalik määrata iga stroomarakkude tüübi panust konkreetse mikrokeskkonna organiseerimisse ja vereloome toetamisse Dexteri kultuurides.

Mesenhümaalsete tüvirakkude omadused

Viimastel aastatel on kindlaks tehtud, et statsionaarsetes luuüdi kultuurides esindavad multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud piiratud arvu väikeseid agranulaarseid rakke (RS-1 rakke), mida iseloomustab madal kolooniate moodustamise võime ja prolifereeruvatele rakkudele spetsiifilise Ki-67 antigeeni ekspressiooni puudumine. Uinunud RS-1 rakkude antigeensed parameetrid erinevad kiiresti prolifereeruvate pühendunud stromaalsete eellasrakkude antigeenide spektrist. On kindlaks tehtud, et pühendunud eellasrakkude kõrge proliferatsioonikiirus on täheldatud ainult RS-1 rakkude juuresolekul. Omakorda suurendavad RS-1 rakud oma kasvukiirust multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude kõige küpsemate derivaatide poolt sekreteeritavate faktorite mõjul. Näib, et RS-1 rakud on taaskasutatavate mittesiduvate MSC-de alamklass. In vitro iseloomustab 5-fluorouratsiili suhtes resistentseid luuüdi stromaalseid eellasrakke madal RNA sisaldus ja ornitiindekarboksülaasi geeni, mis on mitteprolifereeruvate rakkude marker, kõrge ekspressioon.

Stromaalsete eellasrakkude intensiivne proliferatsioon algab pärast nende kinnitumist substraadile. Sel juhul ekspresseeruvad halvasti diferentseerunud rakkude markerprofiil: SH2 (TGF-(3) retseptor), SH3 (signaalvalgu domeen), I ja III tüüpi kollageen, fibronektiin, adhesiooniretseptorid VCAM-1 (CD106) ja ICAM (CD54), kadheriin-11, CD44, CD71 (transferriini retseptor), CD90, CD120a ja CD124, kuid ilma hematopoeetiliste tüvirakkude iseloomulike markerite (CD34, CD14, CD45) ekspressioonita. Klonaalne kasv võimaldab mesenhümaalsete tüvirakkude korduvat passaaži, mille käigus moodustuvad kultuuris arvukalt geneetiliselt homogeenseid stromaalseid eellasrakke pluripotentsetes vormides. Pärast 2-3 passaaži ulatub nende arv 50-300 miljonini. Piisava tihedusega kultuuris diferentseeruvad stromaalsed eellasrakud pärast proliferatsiooni peatumist, erinevalt hematopoeetiliste kudede fibroblastidest, adipotsüütideks, müotsüütideks, kõhre- ja luurakkudeks. Kolme regulatiivse diferentseerumissignaali kombinatsioon, sealhulgas 1-metüülisobutüülksantiin (rakusisese cAMP moodustumise indutseerija), deksametasoon (fosfolipaaside A ja C inhibiitor) ja indometatsiin (tsüklooksügenaasi inhibiitor, mis vähendab ka tromboksaansüntaasi aktiivsust), muundab kuni 95% mesenhümaalsetest eelrakkudest adipotsüütideks. Adipotsüütide moodustumist ebaküpsetest strooma elementidest kinnitab lipoproteiini lipaasi geeni ekspressioon, apolipoproteiinide ja peroksisomaalsete retseptorite histokeemiline tuvastamine. Sama klooni rakud moodustavad TGF-β mõjul seerumivabas keskkonnas homogeense kondrotsüütide populatsiooni. Selle kõhrekoe mitmekihilist rakukultuuri iseloomustab arenenud rakkudevaheline maatriks, mis koosneb proteoglükaanist ja II tüüpi kollageenist. Toitekeskkonnas, mis sisaldab 10% β-glütserofosfaadist (anorgaaniline fosfaadidoonor), askorbiinhappest ja deksametasoonist koosneva diferentseerumissignaali kompleksi mõju samas strooma eellasrakkude kultuuris viib rakuliste agregaatide moodustumiseni. Sellistes rakkudes täheldatakse aluselise fosfataasi aktiivsuse ja osteopontüni taseme järkjärgulist suurenemist, mis näitab luukoe moodustumist, mille rakkude mineraliseerumist kinnitab rakusisese kaltsiumisisalduse järkjärguline suurenemine.

Mõnede andmete kohaselt on mesenhümaalsete tüvirakkude võime piiramatult jaguneda ja paljuneda erinevat tüüpi mesenhümaalse diferentseerumisliini rakke ühendatud kõrge plastilisusega. Aju vatsakestesse või valgeainesse sisestamisel migreeruvad mesenhümaalsed tüvirakud närvikoe parenhüümi ja diferentseeruvad gliaalse või neuronaalse rakuliini derivaatideks. Lisaks on teavet MSC-de transdifferentseerumise kohta hematopoeetilisteks tüvirakkudeks nii in vitro kui ka in vivo. Põhjalikum analüüs mõnedes uuringutes on kindlaks teinud MSC-de erakordselt kõrge plastilisuse, mis avaldub nende võimes diferentseeruda astrotsüütideks, oligodendrotsüütideks, neuroniteks, kardiomüotsüütideks, silelihasrakkudeks ja skeletilihasrakkudeks. Mitmed uuringud MSC-de transdifferentseerumispotentsiaali kohta in vitro ja in vivo on kindlaks teinud, et luuüdist pärinevad multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud diferentseeruvad terminaalselt rakuliinideks, mis moodustavad luu-, kõhre-, lihas-, närvi- ja rasvkoe, samuti kõõluseid ja stroomat, mis toetavad vereloomet.

Teised uuringud ei suutnud aga tuvastada mesenhümaalsete tüvirakkude genoomi ja stroomarakkude eellaspopulatsioonide pluripotentsuse piiramise märke, kuigi stroomarakkude võimaliku pluripotentsuse testimiseks uuriti üle 200 ühest primaarkultuurist eraldatud MSC klooni. Valdav enamus in vitro kloonidest säilitas võime diferentseeruda osteogeenses, kondrogeenses ja adipogeenses suunas. Kui välistada retsipientrakkude migratsiooni tõenäosus mesenhümaalsete tüvirakkude siirdamise teel neerukapsli alla või difusioonikambritesse, selgus, et strooma eellasrakud in situ säilitavad heterogeense fenotüübi, mis näitab kas restriktsioonifaktorite puudumist siirdamisvööndis või MSC pluripotentsuse puudumist kui sellist. Samal ajal on lubatud haruldase somaatiliste pluripotentsete tüvirakkude tüübi olemasolu, mis on kõigi täiskasvanud tüvirakkude tavalised eellasrakud.

Tõeliste mesenhümaalsete tüvirakkude multipotentsus, mis moodustavad luuüdi rakkudest väga väikese osa ning on teatud tingimustes võimelised in vitro kultiveerimise ajal diferentseerumata prolifereeruma, ilmneb nende indutseeritud sidumisest luu-, kõhre-, rasv- ja lihaskoe rakkudesse, samuti tenotsüütidesse ja stromaalsetesse elementidesse, mis toetavad vereloomet. Reeglina kutsub pikaajaline kokkupuude vasikaloote seerumiga kultuurikeskkonnaga esile MSC-de vabanemise pühendunud stromaalsetesse eellasrakkudesse, mille järglased läbivad spontaanse terminaalse diferentseerumise. In vitro on võimalik saavutada osteoblastide sihipärane moodustumine, lisades konditsioneerimiskeskkonda deksametasooni, ß-glütserofosfaati ja askorbiinhapet, samas kui deksametasooni ja insuliini diferentseerumissignaalide kombinatsioon indutseerib adipotsüütide moodustumist.

On kindlaks tehtud, et enne terminaalse diferentseerumise staadiumisse sisenemist diferentseeruvad luuüdi MSC-d teatud kultuuritingimustes esialgu fibroblastilaadseteks mesenhümaalseteks tüvirakkudeks. Nende rakkude derivaadid osalevad in vivo luude, kõhre, kõõluste, rasv- ja lihaskoe, samuti vereloomet toetava strooma moodustumisel. Paljud autorid mõistavad terminit "multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud" nii MSC-de endi kui ka luuüdi ja mesenhümaalsete kudede pühendunud strooma eellasrakkudena. Luuüdi päritolu multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude kloonanalüüs näitas, et veidi üle kolmandiku kõigist kloonidest diferentseerub osteo-, kondro- ja adipotsüütideks, samas kui ülejäänud kloonide rakkudel on ainult osteogeenne potentsiaal ja need moodustavad ainult kondro- ja osteotsüüte. Multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude kloon, näiteks BMC-9, diferentseerub sobivates mikrokeskkonnatingimustes rakkudeks, millel on mitte ainult osteoblastide, kondrotsüütide ja adipotsüütide, vaid ka vereloomet toetavate stroomarakkude fenotüüp ja funktsionaalsed omadused. Roti loote luuüdist eraldatud RCJ3.1 rakkude kloon diferentseerub erinevate fenotüüpidega mesenhümaalseteks rakkudeks. Askorbiinhappe, b-glütserofosfaadi ja deksametasooni koostoimel moodustavad selle klooni rakulised elemendid esmalt multinukleaarseid müotsüüte ning seejärel järjestikku adipotsüüte, kondrotsüüte ja mineraliseerunud luukoe saarekesi. Roti loodete luuümbrise granuleeritud rakkude populatsioon vastab mittesiduvatele multipotentsetele mesenhümaalsetele eellasrakkudele, kuna seda iseloomustab madal proliferatsioonikiirus, see ei ekspresseeri diferentseerumismarkereid ja kultiveerimistingimustes diferentseerub kondro-, osteo- ja adipotsüütideks, samuti silelihasrakkudeks.

Seega tuleb tunnistada, et mesenhümaalsete tüvirakkude genoomi pluri- või multipotentsuse küsimus jääb lahtiseks, mis vastavalt mõjutab ka ideid strooma eellasrakkude diferentseerumispotentsiaali kohta, mida samuti pole lõplikult kindlaks tehtud.

Mesenhümaalsete tüvirakkude eksperimentaalselt tõestatud ja oluline omadus on nende võime lahkuda koenišist ja ringleda üldises vereringes. Geneetilise diferentseerumise programmi aktiveerimiseks peavad sellised ringlevad tüvirakud sisenema sobivasse mikrokeskkonda. On näidatud, et MSC-de süstemaatilisel viimisel retsipientloomade vereringesse implanteeritakse ebaküpsed rakud erinevatesse organitesse ja kudedesse, mis seejärel diferentseeruvad vererakkudeks, müotsüütideks, adipotsüütideks, kondrotsüütideks ja fibroblastideks. Järelikult toimuvad lokaalsetes koetsoonides signaal-regulatiivsed interaktsioonid nii pühendunud ja pühendunud strooma eellasrakkude vahel kui ka nende ja ümbritsevate küpsete rakkude vahel. Eeldatakse, et diferentseerumist indutseerivad mesenhümaalse ja mitte-mesenhümaalse päritoluga parakriinsed regulatiivsed faktorid (kasvufaktorid, eikosanoidid, rakuvälise maatriksi molekulid), mis pakuvad ruumilisi ja ajalisi seoseid multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude mikrokeskkonnas. Seetõttu peaks mesenhümaalse koe lokaalne kahjustus viima multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude mikrokeskkonna tsoonide moodustumiseni, mis erinevad kvalitatiivselt tervete kudede regulatiivsete signaalide kompleksist, kus toimuvad füsioloogilised, mitte reparatiivsed regeneratsiooniprotsessid. See erinevus on äärmiselt oluline rakulise fenotüübi spetsialiseerumise seisukohast normaalses ja kahjustustest tingitud mikrokeskkonnas.

Kontseptsioonide kohaselt on just siin kinnistunud kahe teadaoleva protsessi - füsioloogilise regeneratsiooni ja põletikulise proliferatsiooni - vahelise põhimõttelise erinevuse mehhanismid. Esimene neist lõpeb koe spetsialiseerunud rakulise koostise ja selle funktsiooni taastamisega, samas kui proliferatsiooniprotsessi rakendamise tulemuseks on küpsete sidekoe elementide moodustumine ja kahjustatud koetsooni funktsiooni kadumine. Seega on regeneratiiv-plastilises meditsiinis multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude kasutamise optimaalsete programmide väljatöötamiseks vaja põhjalikult uurida mikrokeskkonnategurite mõju MSC-de diferentseerumisele.

Tüvirakkude sektsiooni struktuuri sõltuvus rakulistest para- ja autokriinsetest regulaatoritest, mille ekspressiooni moduleerivad välised signaalid, on vaieldamatu. Regulatiivsete tegurite funktsioonidest on kõige olulisemad MSC-de asümmeetrilise jagunemise kontroll ja geenide ekspressioon, mis määravad pühendumise etapid ja rakkude jagunemiste arvu. Välised signaalid, millest sõltub MSC-de edasine areng, saadakse nende mikrokeskkonnast. Ebaküpses olekus prolifereeruvad MSC-d pikka aega, säilitades samal ajal võime diferentseeruda adipotsüütide, müofibroblastide, hematogeense koe strooma, kõhre- ja luurakkude liinideks. On kindlaks tehtud, et piiratud hulk veres ringlevaid CD34-negatiivseid strooma rakulisi elemente naaseb üldisest vereringest luuüdi stroomasse, kus see transformeeritakse CD34-positiivsete hematopoeetiliste tüvirakkude liinideks. Need tähelepanekud viitavad sellele, et mesenhümaalsete eellasrakkude retsirkulatsioon vereringes säilitab strooma tüvirakkude koetasakaalu erinevates organites, mobiliseerides luuüdi ebaküpsete strooma elementide ühist kogumit. MSC-de diferentseerumine mitme mesenhümaalse fenotüübiga rakkudeks ja nende osalemine luu, kõhre, rasvkoe ja kõõluste regenereerimises või parandamises in vivo on tõestatud katseloomadel adoptiivse ülekande mudelite abil. Teiste autorite sõnul on MSC-de kaugmigratsioon mööda veresoonkonda kombineeritud multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude lühikese vahemaa või lokaalse liikumisega koes kõhre parandamise, lihaste regenereerimise ja muude taastavate protsesside ajal.

Strooma koebaasi lokaalsed tüvireservid toimivad rakkude allikana füsioloogilise koeregeneratsiooni protsessides ning neid täiendavad MSC-de kaugtransport stroomakoe tüviressursside tarbimisel. Reparatiivse rakulise potentsiaali erakorralise mobiliseerimise vajaduse korral, näiteks polütrauma korral, osaleb reparatiivse regeneratsiooni protsessides kogu MSC-de ešelon ning luuüdi mesenhümaalsed eellasrakud värvatakse perifeeriasse üldise vereringe kaudu.

Mesenhümaalsete tüvirakkude siirdamine

Füsioloogilise koeregeneratsiooni protsesside ja nende moodustumise vahel emakasisese arengu ajal on võimalik leida teatud paralleele. Inimese ja imetajate embrüogeneesis toimub erinevat tüüpi spetsialiseerunud rakkude moodustumine idukihtide ekto-, meso- ja endodermaalsest kogumist, kuid mesenhüümi kohustusliku osalusega. Embrüonaalse mesenhüümi koe lahtine rakuvõrgustik täidab arvukalt regulatiivseid, metaboolseid, raamistiku ja morfogeneetilisi funktsioone. Ajutiste organite ladestumine toimub alles pärast mesenhüümi kondenseerumist tänu eellasrakkude klonogeensele kasvule, mis genereerivad organogeneesi primaarseid morfogeneetilisi signaale. Embrüonaalse mesenhüümi strooma derivaadid loovad ajutiste organite rakulise raamistiku ja moodustavad aluse nende edasiseks energia-plastiliseks varustamiseks primaarsete vere- ja lümfisoonte kasvu tõttu. Teisisõnu, looteorganite mikrotsirkulatsiooniüksuse strooma elemendid tekivad enne nende struktuuriliste ja funktsionaalsete üksuste moodustumist. Lisaks tagab mesenhümaalsete rakkude aktiivne migratsioon organogeneesi ajal arenevate organite ruumilise orientatsiooni, märkides nende mahupiirid homeootiliste Hox-tüüpide piiramise kaudu. Strooma raamistik on ka parenhümatoossete organite struktuuriliste ja funktsionaalsete üksuste kokkupaneku aluseks, mis sageli hõlmavad morfogeneetiliselt ja funktsionaalselt täiesti erinevaid rakke. Järelikult on mesenhüümi funktsioonid embrüogeneesi ajal primaarsed ja realiseeruvad regulatiivsete signaalide genereerimise kaudu, mis aktiveerivad epiteeli eelrakkude regionaalset proliferatsiooni ja diferentseerumist. Embrüonaalsed mesenhüümirakud toodavad kasvufaktoreid nagu HGF-b, HGF-b, CSF, mille jaoks parenhüümi eelrakkudel on vastavad retseptorid. Täiskasvanud organismi diferentseerunud küpses koes genereerib strooma rakkude võrgustik signaale ka mitte-mesenhümaalse päritoluga eelrakkude elujõulisuse ja proliferatsiooni säilitamiseks. Postnataalses ontogeneesis on strooma regulatiivsete signaalide spekter aga erinev (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF jne) ja selle eesmärk on tagada kahjustatud koetsoonide füsioloogiline regeneratsioon või parandamine. Lisaks on strooma regulatiivsete faktorite spektraalsed omadused igas koetüübis ja isegi ühe organi sees erinevad. Eelkõige hematopoeesi ja lümfopoeesi koos hematopoeetiliste ja immunokompetentsete rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumisega toimub ainult teatud organites, mille piirides toimib strooma mikrokeskkond, pakkudes tingimusi hematopoeetiliste ja lümfoidsete rakkude küpsemiseks. Hematopoeetiliste ja lümfoidsete rakkude võime antud organit taasasustada, prolifereeruda ja küpseda selle mikrostruktuurilistes niššides sõltub mikrokeskkonna regulatiivsetest faktoritest.

Multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud toodavad rakuvälise maatriksi komponente, millest erituvad fibronektiin, laminiin, kollageen ja proteoglükaanid, samuti CD44 (hüaluronaani ja osteopontüni retseptor), millel on oluline roll rakkudevaheliste interaktsioonide korraldamisel ja rakuvälise maatriksi moodustamisel luuüdis ja luukoes. On tõestatud, et luuüdi multipotentsed mesenhümaalsed eellasrakud loovad stromaalse mikrokeskkonna, mis annab induktiivseid ja regulatiivseid signaale mitte ainult MSC-dele, vaid ka hematopoeetilistele eellasrakkudele ja teistele luuüdi mitte-mesenhümaalsetele tüvirakkudele. On teada, et MSC-de osalemine vereloomes on määratud nende võimega diferentseeruda vereloomet toetavateks stromaalseteks rakkudeks ja seda instruktiivset signaali saavad MSC-d otse hematopoeetilistelt tüvirakkudelt. Seetõttu toimib stromaalsete eellasrakkude võrgustik kultuuris kõigi hematopoeetiliste rakkude kloonide arengu toitmisbaasina.

Küpses organismis on hemo- ja lümfopoeesi intensiivsus dünaamilises tasakaalus küpsete vererakkude ja immuunsüsteemi rakkude "kuluga" perifeerias. Kuna luuüdi ja lümfoidorganite stroomarakud uuenevad äärmiselt harva, ei toimu neis stroomastruktuuride olulist ümberkorraldamist. Süsteemi saab dünaamilisest tasakaalust välja viia mis tahes hemo- või lümfopoeesi organi mehaanilise kahjustusega, mis viib ühtlase järjestikuse muutuseni, mis puudutab mitte ainult ja mitte niivõrd hematopoeetilisi või lümfoidseid elemente, kuivõrd kahjustatud organi stroomastruktuure. Reparatiivse regeneratsiooni käigus moodustub kõigepealt strooma alus, mis seejärel taasasustatakse hematopoeetiliste või immunokompetentsete rakkudega. See ammu teadaolev fakt muudab traumajärgse regeneratsiooni mugavaks mudeliks hematopoeetiliste organite strooma mikrokeskkonna uurimiseks. Eelkõige kasutatakse luuüdi reparatiivse regeneratsiooni uurimiseks torukujuliste luude medullaarse õõnsuse mehaanilist tühjendamist - kuretaaži, mis võimaldab vereloomekude kiiresti ja tõhusalt dünaamilise tasakaalu seisundist eemaldada. Merisigade sääreluu medullaarse õõnsuse mehaanilise tühjendamise järgselt luuüdi hematopoeetiliste ja stromaalsete komponentide reparatiivse regenereerimise protsesside uurimisel leiti, et hematopoeetiliste ja stromaalsete rakkude regeneratsiooni näitajate (hematopoeetiliste rakkude arv, stromaalsete eellasrakkude kontsentratsioon ja arv) vahel puudub otsene seos. Lisaks selgus, et stromaalsete eellasrakkude populatsiooni suurenemine toimub pärast kuretaaži varem ja stromaalsed fibroblastid ise muutuvad fosfataaspositiivseks, mis on osteogeensele koele tüüpiline. Samuti on kindlaks tehtud, et 3-5 toruluu kuretaažimine viib selle rakupopulatsiooni kasvuni mitteopereeritud luude luuüdis ja isegi põrnas, mis merisigadel on ainult lümfopoeetiline organ.

Merisigade küreteeritud sääreluu luuüdi reparatiivsete protsesside morfoloogiline pilt vastab üldiselt kirjanduses kirjeldatud andmetele, mis on saadud teiste liikide loomadega tehtud katsetes, ning vereloomekoe eemaldamise järgsete muutuste dünaamika on kõigil loomaliikidel sama ja erinevus puudutab ainult ajaparameetreid. Morfoloogiliselt koosneb vereloome taastumise faasijärjestus tühjendatud luuüdiõõnes järjestikustest verehüübe organiseerimise, jämeda kiulise luukoe moodustumise, selle resorptsiooni, sinusoidide arengu ja retikulaarse strooma moodustumise protsessidest, mis seejärel taasasustatakse vereloomeelementidega. Sel juhul suureneb luuüdi kudede regenereerimise protsessis vereloome tüvirakkude eellasrakkude arv paralleelselt vereloome tüvirakkude sisalduse suurenemisega.

Yu. Gerasimov ja kaasautorid (2001) võrdlesid hematopoeetiliste rakkude ja strooma eellasrakkude arvu muutusi regeneratsiooniprotsessi üksikutes faasides. Selgus, et luuüdi rakkude kvantitatiivsed muutused kurettluudes vastavad regeneratsiooni morfoloogiliste tunnuste dünaamikale. Autorid seostavad regeneraadi rakulise sisalduse vähenemist esimese kolme päeva jooksul hematopoeetiliste rakkude surmaga, mis on tingitud epifüüsi piirkonnas säilinud luuüdis prolifereeruva retikulaarse koe loodud mikrokeskkonna ebasoodsast mõjust, samuti osteoidkoe fookuste moodustumisega viimases ja veresoonte kahjustusega kuretaaži ajal. 7.-12. päeval langeb tuumaliste rakkude taseme tõus kokku müeloidse vereloome üksikute fookuste ilmnemisega strooma elementide proliferatsiooni tsoonides. 20. päeval ilmuvad märkimisväärsed regenereerunud luuüdi ja hästi arenenud siinuste alad, millega kaasneb rakkude koguarvu oluline suurenemine. Hematopoeetiliste elementide arv on sel perioodil aga 68% kontrolltasemest. See on kooskõlas varem avaldatud andmetega, et vereloomerakkude arv pärast kuretaaži saavutab normi alles 35.–40. päeval pärast operatsiooni.

Varasel traumajärgsel perioodil on vereloome taastamise peamiseks allikaks kuretaaži ajal säilinud lokaalsed rakulised elemendid. Hilisemates etappides on luuüdi vereloomekoe regenereerimise peamiseks allikaks tüvirakud, mis taasasustavad strooma vabu tsoone. Mis puutub üksikutesse stroomarakkude kategooriatesse (endoteeli-, retikulaarsed ja osteogeensed), siis allikad, mis tagavad nende moodustumise luuüdi õõnsuse reorganiseerimise ajal, jäävad ebaselgeks. Yu. V. Gerasimovi ja kaasautorite (2001) uuringu tulemused näitavad, et pärast kuretaaži säilinud luuüdis on fibroblastide kolooniaid moodustavate rakkude kontsentratsioon oluliselt suurem kui normaalses luuüdis. Autorid usuvad, et kuretaaži tulemusel toimub vereloomerakkude intensiivsem selektiivne väljapesemine võrreldes kolooniaid moodustavate stroomarakkudega, mis osalevad strooma moodustumisel ja on selle põhiainega tugevamalt seotud kui vereloomerakud.

Fibroblastide kolooniaid moodustavate rakkude arvu muutuse dünaamika korreleerub osteogeneesi protsesside intensiivsusega, järgneva luutrabeekulite resorptsiooniga ja retikulaarse strooma moodustumisega, mida asustavad hematopoeetilised rakud. Enamik strooma eellasrakkudest moodustavad regeneratsiooni kindlaksmääratud perioodidel jämeda kiulise luukoe ja retikulaarse strooma. Reieluumurdude korral pikaajalise osteosünteesi tingimustes suureneb regeneratsioonitsoonis 5. päeval fibroblastide kolooniaid moodustavate rakkude kontsentratsioon ja arv ning intensiivse luu moodustumise perioodil suureneb nende arv 6 korda. On teada, et fibroblastide kolooniaid moodustavatel luuüdi rakkudel on osteogeensed omadused. Stromaalsete eellasrakkude arv suureneb enne, kui hematopoeetilised rakud asustavad kurettidega luuüdi territooriumi. See on kooskõlas andmetega, et stroomarakud tagavad hematopoeetilise mikrokeskkonna moodustumise. Ilmselt vastab hematopoeetilise mikrokeskkonna loomine teatud tasemele strooma kudede regenereerimisel ning hematopoeetiliste rakkude arv suureneb vereloomeks sobiva strooma platvormi laienemisega.

Kõige huvitavamad on autorite andmed, mis näitavad, et kohe pärast kuretaaži suureneb strooma eellasrakkude arv skeleti kaugemates osades. Alates kuuendast tunnist kuni kahekümnenda päevani (kaasa arvatud) täheldatakse kontralateraalses sääreluus nii fibroblastide kolooniaid moodustavate rakkude kontsentratsiooni kui ka arvu enam kui kahekordset suurenemist. Selle nähtuse mehhanism on tõenäoliselt seotud asjaoluga, et massiline luuüdi kahjustus viib suure hulga verehüüvete moodustumiseni, millega kaasneb samaaegselt märkimisväärse arvu trombotsüütide hävimine ja trombotsüütidest pärineva kasvufaktori (PDGF) vabanemine verre, mis teadaolevalt põhjustab fibroblastide kolooniaid moodustavate rakkude proliferatsiooni väljaspool proliferatiivset basseini. Küülikutega tehtud katsetes soodustab MSC-de lokaalne manustamine kirurgiliselt kahjustatud põlveliigese kõhrekoe taastumist, mis võib olla seotud süstitud MSC-dest pärinevate kondrotsüütide moodustumisega. Laborirottidel parandab aga luudefektide reparatiivset regenereerimist oluliselt keraamilisse raamistikku suletud mesenhümaalsete tüvirakkude kasutamine. Seega võib eeldada, et kui mitte RBOC, siis mõni muu kahjustatud stroomarakkudest pärinev faktor avaldab intaktsetes luuüdi tsoonides mesenhümaalsete eellasrakkude proliferatsioonile kaugeid stimuleerivaid efekte ja stimuleerib nende migratsiooni luuüdi defekti piirkonda. Sellele omakorda räägivad vastu varasemate aastate kirjanduse andmed, mis näitavad, et mikrokeskkonna eest vastutavad stroomarakud, erinevalt hematopoeetilistest rakkudest, ei ole võimelised migreeruma ja pärinevad kohalikest allikatest.

Sellest hoolimata näitavad Yu. Gerasimovi ja kaasautorite (2001) uuringu tulemused, et mehaaniline trauma põhjustab mitte ainult kurettluu stroomakoe järsku ümberstruktureerimist, vaid ka olulisi muutusi kaugemate tervete luude stroomas, st stroomakoe süsteemne reaktsioon lokaalsele traumale tekib. Lisaks polütrauma - mitmekordse kuretaaži - korral see reaktsioon tugevneb ja seda täheldatakse mitte ainult opereeritud luus ja skeleti kaugemates osades, vaid ka lümfoidorganites, eriti põrnas. Luuüdi ja põrna stroomakoe sellise süsteemse reaktsiooni mehhanism lokaalsele traumale ja polütraumale jääb teadmata. Eeldatakse, et see protsess on seotud luuüdi medullaarse õõnsuse mesenhümaalse strooma poolt eritatava humoraalse faktori toimega. Luuüdi ja põrna stroomarakkude poolt organi mittespetsiifilise humoraalse faktori tootmise võimalust, mis vastutab fibroblastide kolooniaid moodustavate rakkude proliferatsiooni eest, tõendavad andmed nende kolooniaid stimuleeriva aktiivsuse kohta luuüdi ühekihilistes kultuurides.

Sellega seoses väärib märkimist, et multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude süsteemse manustamise korral taasasustavad nende derivaadid mitte ainult luuüdi, vaid ka teisi kudesid, mida kasutatakse eelkõige geeniteraapias. On näidatud, et metsiktüüpi genoomiga MSC-de suure koguse intravenoossel manustamisel hiirtele, kellel on mutatsioon kollageen I geenis, asendavad doonorrakud kuni 30% retsipientide luu- ja kõhrekoe rakkudest ning inimese IL-3 sekreteerivad transfekteeritud hiire mesenhümaalsed tüvirakud toetavad vereloomet tõhusalt 9 kuu jooksul, kui neid manustatakse samaaegselt inimese vereloome tüvirakkudega immuunpuudulikkusega hiirtele.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Mesenhümaalsete tüvirakkude geneetiline modifitseerimine

MSC-de eksperimentaalse geneetilise modifitseerimise edusammude hulgas väärib märkimist IX faktori geeni transfektsioon inimese MSC-desse koos järgneva transfektantrakkude ülekandmisega immuunpuudulikkusega hiirtele, mis viib antihemofiilse faktor B ilmnemiseni veres 8 nädala jooksul pärast siirdamist. Selles katses viidi transfekteeritud rakkudes läbi IX faktori translatsioonijärgne modifitseerimine γ-glutamüülkarboksülaasi abil. MSC-de transduktsioon inimese IX faktorit kodeeriva retroviirusvektoriga oli vähem edukas – nende rakkude hilisem manustamine hemofiilia B-ga koerale tagas IX faktori terapeutilise taseme, säilitades hüübimishemostaasi normaalse intensiivsuse, vaid 12 päeva jooksul.

Mesenhümaalsete tüvirakkude siirdamine loomade aju parenhüümi on näidanud, et doonori ebaküpsed rakud transformeeruvad nii neuronaalseteks kui ka gliaalseteks populatsioonideks. Terve doonori mesenhümaalse koe neuronaalsete derivaatide siirdamine võimaldab teoreetiliselt korrigeerida aju ainevahetuse geneetilisi kõrvalekaldeid Gaucher' tõve ja teiste lipiidide, gangliosiidide või süsivesikute ainevahetuse häiretega patsientidel.

Jätkub eksperimentaalne otsing tingimuste leidmiseks luuüdi strooma tüvirakkude transdiferentseerumiseks närvi- ja maksakoe eelrakkudeks. Teadlaste tähelepanu on keskendunud diferentseerumise indutseerijate ja spetsiaalsete konditsioneeritud söötmete kombinatsioonidele. Eelkõige stroomarakkude primaarkultuuri isoleerimiseks külvatakse tihedusega 200 000/cm2 DMEM/F12 (1/1) söötmes pestud ja resuspendeeritud luuüdi rakke, mis sisaldavad 10% vasikaloote seerumit. 24 tunni pärast eemaldatakse mittekleepuvad rakud ja plastikule kinnitunud fibroblastilaadseid rakke kultiveeritakse üks nädal. Luuüdi stroomarakkude diferentseerimiseks neuroblastideks kasutatakse hiire embrüonaalsete fibroblastide primaarkultuuri kolmepäevase kultiveerimise teel saadud konditsioneeritud söödet, samuti DMEM/F12 söödet (1/1) 2% vasikaloote seerumiga ja 20 ng/ml NF või 10-6 M retinoehappe lisamisega (neuroinduktorid, mida kasutatakse hiire ja inimese embrüonaalsete tüvirakkude neuraalseks diferentseerumiseks). Luuüdi stroomarakkude diferentseerumine hepatotsüütide eellasrakkudeks indutseeritakse konditsioneeritud söötmes, mis on loodud hiire embrüonaalsete maksarakkude primaarkultuuri kolmepäevase kultiveerimise tulemusena DMEM/F12 söötmes (1/1), millele on lisatud 10% vasikaloote seerumit.

Siinkohal tuleb veel kord märkida, et luuüdi strooma kolooniaid moodustavad rakud on heteromorfsed ja neid saab jagada kahte tüüpi. Esimene tüüp hõlmab fibroblastitaolisi rakke, mis moodustavad suurte tuumade ja ühe või kahe nukleooliga filopoode. Teist tüüpi esindavad väikesed spindlikujulised rakud. Mõlema tüübi rakkude kultiveerimisel konditsioneeritud söötmes, mis on saadud hiire embrüonaalsete fibroblastide toitekihil, ilmuvad neuroblastidega sarnased rakud kultuuri 3.-4. päeval. Selles etapis on neil kõige sagedamini spindlikujuline vorm ühe või kahe pika jätkega, mis lõpevad filopoodidega. Harvemini esinevad lühikeste dendriitidega püramiid- või stellaatrakud. Mõnede neuroblastide dendriitidel on iseloomulikud laienemised (kasvupungad) ja harud distaalses osas, teistel aga on selgelt eristuvad kasvukoonused filopoodidega, mille kaudu dendriidid kasvavad. Sarnaseid morfoloogilisi tunnuseid (pungad ja kasvukoonused filopoodidega), mis on omased neuroniteks diferentseeruvatele neuroblastidele, on neurogeneesi uuringutes üksikasjalikult kirjeldatud. Selle põhjal järeldavad mõned autorid, et kultuurist leitud rakud on neuroblastid. Eelkõige leidsid E. Štšegelskaja ja kaasautorid (2002) pärast stroomarakkude primaarkultuuri kahe nädala pikkust kultiveerimist konditsioneeritud söötmes, mida vahetati iga 3.-4. päeva järel, et mõned rakud prolifereerusid, säilitades samal ajal diferentseerumata seisundi. Väliselt meenutasid sellised rakud fibroblaste ja neid tuvastati kultuuris koos diferentseeruvate neuroblastidega. Enamik rakke (umbes 80%) olid närvikoe rakkudeks, peamiselt neuroniteks, diferentseerumise erinevates etappides. Nende rakkude dendriitsed jätked olid üksteisega tihedas kontaktis, nii et rakud moodustasid substraadile järk-järgult närvivõrgu lõike pikkade hulkraksete ahelate kujul. Neuroblastide dendriitsed jätked muutusid oluliselt pikemaks, mõned neist ületasid neuroni keha enda pikkust 8-10 korda. Järk-järgult suurenes püramiid- ja tähtkujuliste rakkude osakaal. Tähtkujuliste rakkude dendriidid hargnesid. Autorite sõnul vastab püramiid- ja tähtkujuliste rakkude hilisem diferentseerumine võrreldes spindlikujuliste rakkudega loomade normaalse neurogeneesi etappide järjestusele. Selle tulemusena järeldavad autorid, et luuüdi strooma tüvirakud läbivad indutseeritud neurogeneesi, mille käigus moodustuvad neuroblastidest in vitro kõik kolm peamist neuronitüüpi. Närvirakkude eellasrakke tuvastati ka luuüdi stroomarakkude kultiveerimisel 3-4 päeva jooksul keskkonnas, mis sisaldas 2% looteseerumit ja 20 ng/ml LIF-i. Kuid sel juhul jagunesid tüvirakud väga aeglaselt, neuroblastide diferentseerumine toimus ainult 30% juhtudest ja nad ei moodustanud neuronaalseid võrgustikke. Kasutades retinoehapet kui üht närvirakkude diferentseerumise indutseerijat, said autorid kultuurist kuni 25-30% närvirakkudest,valdavalt gliaalelementidega - astrotsüüdid ja oligodendrotsüüdid. Neuronid moodustasid vaid kolmandiku kõigist närvirakkudest, kuigi neid oli esindatud kõigis kolmes tüübis: spindlikujulised, püramiid- ja stellaatrakud. Stroomarakkude kultiveerimise kuuendal päeval retinoehappega keskkonnas muutusid närvirakud diferentseerunumaks ja üksikutes püramiidneuronites leiti aksoneid, mis normaalses neuroontogeneesis ilmuvad hiljem kui dendriitjätkete moodustumine. Autorite sõnul on retinoehappe indutseerimise meetodil vaatamata närvirakkude madalale saagikusele oma eelised: oligodendrotsüüdid ja astrotsüüdid täidavad dendriitide ja aksonite kasvu ajal müeliniseerivaid ja toitumisfunktsioone ning on vajalikud närvikoe normaalseks moodustumiseks. Seetõttu on kahjustatud piirkondade parandamiseks in vivo parem kasutada gliaalrakkudega rikastatud neuronite suspensiooni.

Teises katseseerias püüdsid autorid esile kutsuda luuüdi stroomarakkude diferentseerumist maksarakkudeks. Pärast kolmepäevast luuüdi strooma tüvirakkude kultiveerimist hiire embrüonaalsete hepatotsüütide inkubeerimise teel saadud konditsioneeritud söötmes leiti suuri, kerakujulisi, sageli kahetuumalisi rakke, millel olid erineva suurusega tsütoplasmaatilised inklusioonid. Need rakud olid diferentseerumise erinevates etappides ja erinesid suuruse, tuumade arvu ja tsütoplasmas olevate inklusioonide poolest. Enamikus neist rakkudest tuvastati glükogeeni, mille põhjal autorid identifitseerisid need hepatotsüütide eellasrakkudena. Kuna kultuuris ei leitud neuroblastidega sarnaseid rakke, järeldati, et embrüonaalsete hepatotsüütide kultiveerimise tulemusel saadud konditsioneeritud söötmes puudusid närvirakkude diferentseerumisfaktorid ja vastupidi, see sisaldas faktoreid, mis indutseerisid luuüdi stroomarakkude diferentseerumist hepatotsüütide eellasrakkudeks. Kokkuvõtteks viitavad autorid luuüdi stroomarakkude pluripotentsuse olemasolule, kuna need diferentseeruvad in vitro närvi- või maksakoe rakkudeks, olenevalt kasutatud spetsiifilisest konditsioneeritud söötmest ja indutseerijatest.

Mõned uuringud on tõepoolest õigesti näidanud luuüdi stroomarakkude diferentseerumist kardiomüotsüütideks, kõhredeks, luu- ja närvikoe rakkudeks. On tõendeid, et luuüdi rakkude hulgas on tüvirakkude populatsioone, mis on võimelised diferentseeruma hepatotsüütideks. Neid andmeid arvestades võib ülaltoodud hiirtega tehtud katsete tulemusi pidada täiendavaks kinnituseks pluripotentsete mesenhümaalsete tüvirakkude olemasolust luuüdis, mis on võimelised diferentseeruma täiskasvanud organismi erinevate kudede rakkudeks.

Mesenhümaalsete tüvirakkude siirdamine

Kliinilises transplantoloogias saab inimese mesenhümaalseid tüvirakke kasutada nii hematopoeetiliste tüvirakkude kui ka nende varajaste eelsoodunud järglaste paljunemise tagamiseks. Eelkõige kiirendab autoloogsete hematopoeetiliste tüvirakkude ja MSC-de sissetoomine vähihaigetele pärast suurtes annustes keemiaravi neutrofiilide ja trombotsüütide arvu taastumist perifeerses veres. Mesenhümaalsete tüvirakkude allo- ja autoloogseid siirdamisi kasutatakse hulgimüeloomi, aplastilise aneemia ja spontaanse trombotsütopeenia raviks - haigused, mis on seotud hematopoeetilise koe strooma primaarse defektiga. Rakuteraapia efektiivsus onkohematoloogilises patoloogias on paljudel juhtudel suurem strooma ja hematopoeetiliste tüvirakkude samaaegse sissetoomisega, mis avaldub hematopoeesi taastumise postoperatiivse perioodi lühenemises, piirkondlike ja ringlevate vähirakkude mitteselektiivse hävimise tõttu surmaga lõppevate tulemuste arvu vähenemises, mille käigus surevad ka patsiendi enda hematopoeetilised eelrakud. MSC-de ja teiste multipotentsete mesenhümaalsete eelrakkude kasutamise väljavaated kliinilises praktikas tulenevad nende suhteliselt lihtsast saamisest luuüdi aspiraatidest, kultuuri laiendamisest ja terapeutiliste geenide transfektsioonist. Samal ajal saab multipotentsete mesenhümaalsete eellasrakkude lokaalset implanteerimist kasutada lokaalsete koedefektide kompenseerimiseks ning mesenhümaalse päritoluga kudede süsteemsete düsfunktsioonide korral ei ole välistatud nende sissetoomine üldisse vereringesse.

Tööde autorid, milles analüüsitakse MSC-de kasutamise väljavaateid lokaalseks, süsteemseks siirdamiseks ja geeniteraapiaks stroomarakkude bioloogia vaatenurgast, on oma arutluskäigus ettevaatlikumad. Postnataalset luuüdi peetakse traditsiooniliselt organiks, mis koosneb kahest peamisest selgelt määratletud rakuliinide süsteemist - vereloomekoest endast ja sellega seotud toetavast stroomast. Seetõttu peeti luuüdi mesenhümaalseid tüvirakke algselt ainult strooma baasi allikaks vereloome mikrokeskkonna regulatiivsete faktorite tootmiseks. Seejärel pöördus teadlaste tähelepanu MSC-de rolli uurimisele skeleti kudede tüvirakkude allikana. Uusimad andmed näitavad ootamatut potentsiaali luuüdi stroomarakkude diferentseerumiseks närvi- või lihaskoe moodustumisega. Teisisõnu, mesenhümaalsed tüvirakud omavad transgermaalset plastilisust - võimet diferentseeruda rakutüüpideks, mis on fenotüübiliselt mitteseotud algse koe rakkudega. Samal ajal on luuüdi stroomarakkude bioloogia mõned aspektid nii üldises bioloogilises mõttes kui ka üksikute detailide osas ebaselged ja lahendamata, sealhulgas luuüdi stroomarakkude identifitseerimine, olemus, päritolu, areng ja funktsioon in vivo, samuti lubatud diferentseerumispotentsiaal ex vivo ja terapeutilise kasutamise võimalused in vivo. MSC-de potentsiaali kohta saadud andmed, aga ka teiste tüvirakkude regeneratiivse potentsiaali uuringute tulemused on teravas vastuolus bioloogias kehtestatud dogmadega.

Madala tihedusega kultiveerimisel moodustavad luuüdi strooma tüvirakud eraldiseisvaid kolooniaid, millest igaüks pärineb ühest eellasrakust. Stromaalsete eellasrakkude protsent tuumalistes luuüdi rakkudes, mis määratakse kolooniate moodustamise võime järgi, sõltub suuresti nii kultuuritingimustest kui ka MSC liikidest. Näiteks närilistel on kiiritatud luuüdi toitjarakkude ja seerumi olemasolu kultuuris absoluutselt vajalik, et saada maksimaalne arv strooma eellasrakke, samas kui inimestel on mesenhümaalsete tüvirakkude kolooniate moodustamise efektiivsus sõltumatu nii toitjast kui ka kultuurikeskkonnast. Teadaolevate mitogeensete faktorite arv, mis stimuleerivad strooma eellasrakkude proliferatsiooni, on piiratud. Nende hulka kuuluvad PDGF, EGF, FGF, TGF-b ja IGF1. Optimaalsetes kultuuritingimustes taluvad polüklonaalsed MSC liinid in vitro enam kui 50 rakujagunemist, mis võimaldab saada miljardeid luuüdi strooma rakke 1 ml aspiraadist.

Luuüdi stroomarakkude populatsioon on aga heterogeenne, mis avaldub nii kolooniate suuruse varieeruvuses, nende erinevas moodustumise kiiruses kui ka mitmekesises rakumorfoloogias, mis hõlmab fibroblastide sarnaseid spindlikujulisi rakke kuni suurte lamedate rakkudeni. Selliste kultuuride arengu käigus täheldatakse ka 20 päeva pärast fenotüübilist heterogeensust. Mõnedele kolooniatele on iseloomulik aluselise fosfataasi kõrge ekspressioon, teised ei ekspresseeri seda üldse ning kolmanda tüübi kolooniad on fosfataas-positiivsed keskosas ja fosfataas-negatiivsed perifeerias. Üksikud kolooniad moodustavad luukoe sõlmi (maatriksi mineralisatsiooni algust tähistab värvimine alizariinpunasega või kaltsiumi suhtes Van Kossi järgi). Teistes kolooniates toimub rasva kogunemine, mis tuvastatakse G-värvimisega õlipunasega. Harvemini moodustavad mesenhümaalsete tüvirakkude kolooniad kõhre, mis on värvitud altsiaansinisega.

Pärast ektoopilist siirdamist katseloomadele moodustavad polüklonaalsed MGK liinid ektoopilist luud, millel on retikulaarne strooma, mis on seotud müelopoeesi ja adipotsüütidega ning harvemini kõhrekoega. Luuüdi stroomarakkude monoklonaalsete liinide siirdamisel täheldatakse mõnel juhul kimärismi, kus de novo luu koosneb luukoe rakkudest, sisaldab doonori päritolu stroomat ja adipotsüüte, samas kui hematopoeetilise liini ja veresoonkonna rakud pärinevad retsipiendist.

Nende uuringute tulemused kinnitavad luuüdi strooma eellasrakkude, millest klonaalne liin pärineb, tüviraku olemust. Samuti näitavad need, et mitte kõik kultuuris klonogeensed rakud ei ole tõeliselt multipotentsed tüvirakud. Mõned teadlased usuvad ja meie jagame nende arvamust, et kõige usaldusväärsemat teavet üksikute kloonide tegeliku diferentseerumispotentsiaali kohta saab alles in vivo pärast siirdamist, mitte nende derivaatide fenotüübi määramise teel in vitro. Osteo-, kondro- või adipogeneesi fenotüüpiliste markerite ekspressioon kultuuris (määratud mRNA või histokeemiliste meetodite abil) ja isegi mineraliseerunud maatriksi tootmine ei kajasta üksiku klooni pluripotentsuse astet in vivo. Seetõttu on tüvirakkude identifitseerimine stroomarakkude rühmas võimalik ainult tagantjärele, bioloogilise siirdamisanalüüsi sobivates tingimustes. Eelkõige on kondrogeneesi avatud siirdamissüsteemides väga harva täheldatud, samas kui kõhre moodustumine on kaugeltki mitte haruldane suletud süsteemides, nagu difusioonikambrid või stroomarakkude in vitro mikromassikultuurid, kus saavutatakse lokaalne madal hapnikurõhk, mis soodustab kõhrekoe moodustumist. Seega mõjutavad isegi siirdamistehnika ja mittespetsiifilised in vitro kultuuritingimused oluliselt MSC diferentseerumise ulatust.

Eksperimentaalne siirdamine kindlaksmääratud katsetingimustes on luuüdi stroomarakkude diferentseerumispotentsiaali määramise kuldstandard ja võtmeelement nende identifitseerimisel. Ajalooliselt on luuüdi stroomarakkude siirdamise uuringud seotud luuüdi siirdamise üldise probleemiga. On kindlaks tehtud, et hematopoeetiline mikrokeskkond luuakse luuüdi stroomarakkude liinide siirdamise teel ja see tagab hematopoeetilise koe ektoopilise arengu siirdamisvööndis. Mikrokeskkonna päritolu doonorilt ja hematopoeetiline kude peremeesorganismilt võimaldab meil pidada ektoopilist luud tõeliseks "pööratud" luuüdi siirdamiseks. Luuüdi stroomarakkude lokaalne siirdamine soodustab luudefektide tõhusat korrigeerimist, mis on märgatavam kui spontaanse reparatiivse regenereerimise korral. Mitmed prekliinilised uuringud eksperimentaalsete mudelite kohta on veenvalt näidanud luuüdi stroomarakkude siirdamise võimalikkust ortopeedias, kuigi nende meetodite optimeerimiseks on vaja kõige hoolikamat tööd ja analüüsi isegi kõige lihtsamatel juhtudel. Eelkõige ei ole veel kindlaks tehtud osteogeensete stroomarakkude ex vivo laienemise optimaalseid tingimusi, ideaalse kandja struktuur ja koostis, samuti mahuliseks luu regenereerimiseks vajalike rakkude arv on endiselt välja arendamata.

Lisaks ex vivo laiendatud luuüdi stroomarakkude kasutamisele mesenhümaalse päritoluga kudede regenereerimiseks avab MSC-de ebatavaline plastilisus potentsiaalseid rakendusi närvirakkude regenereerimiseks või geeniproduktide KNS-i kohaletoimetamiseks. Põhimõtteliselt lihtsustab see närvisüsteemi kahjustuste rakuteraapiat, kuna puudub vajadus hankida autoloogseid inimese närvisüsteemi tüvirakke. On teatatud luuüdirakkude potentsiaalsetest rakendustest nii tõelise strooma kui ka ekstrastromaalse päritoluga kardiomüotsüütide ja müogeensete eellasrakkude genereerimiseks.

Katseid tehakse luuüdi stroomarakkude süsteemseks siirdamiseks levinud skeletihaiguste raviks. Pole kahtlustki, et luuüdi stroomarakud on skeletihaiguste geneetiliste häirete eest vastutav populatsioon, mida illustreerib hästi geneetilise teabe vektorülekanne nende rakkude abil, mis viib patoloogilise luukoe moodustumiseni katseloomadel. Stroomarakkude võimet implanteerida, siirduda, vohada ja diferentseeruda skeletiluudesse pärast üldist vereringesse viimist pole aga veel tõestatud.

See on osaliselt tingitud asjaolust, et standardse luuüdi siirdamise korral ei siirdata stroomat koos hematopoeetiliste koega, seega pole süsteemselt manustatud stroomarakkude eduka siirdumise hindamise ranged kriteeriumid veel välja töötatud. Tuleb meeles pidada, et markergeenide olemasolu koeekstraktides või doonorpäritoluga rakkude eraldamine kultuuris ei näita rakkude siirdumist, vaid ainult nende ellujäämist. Isegi luuüdi stroomarakkude intraarteriaalne süstimine hiire jäsemesse võib viia praktiliselt nullini siirdumiseni, hoolimata asjaolust, et doonorpäritoluga rakke leidub luuüdi mikrovaskulatuuris suurel hulgal. Kahjuks kirjeldatakse selliseid rakke tavaliselt "siirdunud" rakkudena lihtsalt doonorrakkude markergeenide tuvastamise alusel ex vivo kultuuris. Lisaks tuleb esitada veenvaid tõendeid doonorpäritoluga diferentseerunud ja funktsionaalselt aktiivsete rakkude pikaajalise integratsiooni kohta uuritavatesse kudedesse. Paljudes avaldatud artiklites, mis käsitlevad luuüdi stroomarakkude siirdumist skeletti, on silmatorkav selliste selgete andmete puudumine. Siiski tuleb märkida, et mõned korrektsed loomkatsed on tõepoolest kindlaks teinud stromaalsete eellasrakkude piiratud, kuid reaalse siirdumise pärast nende süsteemset manustamist.

Need andmed on kooskõlas uuringute tulemustega, mis käsitlevad luuüdi müogeensete eellasrakkude lihasesse toimetamise võimalikkust veresoonte süsteemi kaudu. Siiski ei tohiks unustada, et nii skeleti- kui ka lihaskude moodustuvad arengu ja kasvu käigus ekstravaskulaarsete rakkude liikumise teel, mis kasutab migratsiooniprotsesse, mis ei hõlma vereringet. Kui eellasrakkude tahkefaasilistesse kudedesse toimetamiseks on olemas iseseisev vereringetee, kas on võimalik eeldada füsioloogiliselt ringlevate mesenhümaalsete eellasrakkude olemasolu? Mis on nende rakkude päritolu nii arenevas kui ka postnataalses organismis ja kuidas nad tungivad läbi veresoone seina? Nendele küsimustele lahendus tundub olevat absoluutselt vajalik ja nõuab kõige hoolikamat prekliinilist analüüsi. Isegi pärast nendele küsimustele vastuste leidmist jäävad skeleti kasvu ja sidekoe ümberkujunemisega seotud problemaatilised kineetilised aspektid lahendamata. Samal ajal näib osteogeneesi häirete ravi, asendades kogu muteerunud skeleti eellasrakkude populatsiooni tervete strooma elementidega, olevat reaalne kliiniline väljavaade. Sellisel juhul saab patoloogilisest osteogeneesist tingitud lokaalseid murdumisvööndeid või deformatsioone, samuti luukoe destruktiivseid muutusi korrigeerida in vitro kultiveeritud strooma tüvirakkude abil. Seetõttu on soovitatav tulevastes uuringutes keskenduda autoloogsete muteerunud osteogeensete eellasrakkude ex vivo transformatsiooni või geneetilise korrigeerimise probleemidele.

Rakkude geneetiline muundamine, olgu see lühiajaline või püsiv, on saanud raku- ja molekulaarbioloogia aluseks, paljude teaduslike avastuste allikaks, mis käsitlevad üksikute valkude rolli raku ainevahetuses in vitro ja in vivo. Molekulaarsete tehnoloogiate kasutamine päriliku patoloogia ja inimeste haiguste korrigeerimiseks on praktilise meditsiini jaoks väga paljutõotav, kuna luuüdi strooma tüvirakkude omadused võimaldavad välja töötada ainulaadseid siirdamisskeeme skeleti geneetiliste haiguste korrigeerimiseks. Samal ajal saab mesenhümaalseid eellasrakke tulevaselt retsipiendilt hõlpsasti saada, need on geneetiliselt manipuleeritavad ja suudavad lühikese aja jooksul suurtes kogustes paljuneda. Mesenhümaalsete tüvirakkude kasutamine võimaldab vältida piiranguid ja riske, mis on seotud geneetilise teabematerjali otse patsiendile intravaskulaarsete vektorkonstruktsioonide kaudu kohaletoimetamisega. Sarnane strateegia on rakendatav ka embrüonaalsete tüvirakkude puhul, kuid autoloogsed postnataalsed luuüdi stroomarakud on eelistatavam materjal, kuna nende sissetoomine välistab võimalikud immunoloogilised siirdamisjärgsed tüsistused. Lühiajalise efekti saavutamiseks, näiteks luukoe regeneratsiooni kiirendamiseks, on optimaalseim meetod mesenhümaalsete tüvirakkude geneetiline modifitseerimine elektroporatsiooni, keemilise fusiooni, lipofektsiooni, plasmiidide ja adenoviiruskonstruktsioonide abil. Eelkõige on viiruse transfektsioon luuüdi strooma rakkudesse BMP-2 osutunud efektiivseks luukoe regeneratsiooni kiirendamisel eksperimentaalse polütrauma korral. Adenoviirusvektorkonstruktsioonide loomine on eelistatav toksilisuse puudumise tõttu. Luuüdi stroomarakkude geneetilist modifitseerimist iseloomustab sel juhul aga äärmiselt madal stabiilsus. Lisaks vajavad normaalsed transformeeritud luuüdi stroomarakud geneetilise teabe vektorkandjate kasutamist, mis on 10 korda nakkavamad kui teist tüüpi rakud, mis suurendab oluliselt transfekteeritud rakkude surma protsenti.

Teatud geenide madala või nullbioloogilise aktiivsuse põhjustatud retsessiivsete haiguste ravi nõuab mesenhümaalsete tüvirakkude pikaajalist või püsivat modifitseerimist, milleks on vaja adeno-assotsieerunud viiruste, retroviiruste, lentiviiruste või adeno-retroviiruslike kimääride kasutamist. Nende viiruste transpordipiirkonnad on võimelised üle kandma suuri DNA transfektsioone (kuni 8 kb). Teaduskirjanduses on juba avaldatud andmeid luuüdi stroomarakkude eksogeense bioloogilise aktiivsuse kohta, mis on transfekteeritud regulatiivsete ja markermolekulide - IL-3, CD2, faktor VIII, aga ka L-DOPA sünteesis osalevate ensüümide - sünteesi kodeerivate retroviiruslike konstruktidega. Kuid isegi nendes uuringutes toovad autorid välja mitmeid piiranguid, mis tuleb enne selle tehnoloogia praktilist rakendamist ületada. Esimene probleem on MSC modifitseerimise protsessi optimeerimine ex vivo. On teada, et luuüdi stroomarakkude pikaajaline (3-4 nädalat) proliferatsioon in vitro vähendab nende transfektsiooni. Samal ajal on MSC-de geneetilise modifitseerimise kõrge taseme saavutamiseks vaja läbi viia mitu transfektsioonitsüklit. Teine probleem on seotud terapeutilise geeniekspressiooni kestusega, mis ei ületa veel nelja kuud. Efektiivse geeniekspressiooni loomulik vähenemine on tingitud promootori inaktiveerimisest ja modifitseeritud rakkude surmast. Arvestades geneetilise teabe edastamise üldisi väljavaateid mesenhümaalsete tüvirakkude abil, näitavad esialgsete uuringute tulemused vajadust ex vivo transfektsioonimeetodite edasise optimeerimise, sobiva promootori valimise järele, mis reguleerib bioloogilist aktiivsust soovitud suunas, ja modifitseeritud luuüdi stroomarakkude võime suurendamise järele in vivo pärast siirdamist isemajandada. Tuleb märkida, et retroviiruslike konstruktide kasutamine luuüdi stroomarakkude modifitseerimiseks soovitud suunas ei nõua alati nende kohustuslikku siirdamist. Transfekteeritud mesenhümaalsed tüvirakud võivad täita korrigeerivat funktsiooni stabiilse residentsuse taustal ja ilma kohustusliku aktiivse füüsilise inkorporeerimise ja toimimiseta sidekoes. Sellisel juhul tuleks neid pidada bioloogiliseks minipumbaks, mis toodab in vivo faktorit, mille defitsiit määrab geneetilise patoloogia avaldumise.

Palju problemaatilisem on transformeeritud luuüdi stroomarakkude kasutamine dominantse geneetilise patoloogia raviks, mida iseloomustab patoloogilise või ebanormaalse bioloogilise aktiivsusega geeni ekspressioon, kuna sel juhul on vaja blokeerida moonutatud geneetilise teabe ülekannet või rakendamist. Üks geenitehnoloogia meetoditest on embrüonaalsete tüvirakkude homoloogne rekombinatsioon transgeensete loomade loomiseks. Kuid äärmiselt madal homoloogse rekombinatsiooni aste koos selliste rekombinantide identifitseerimise, eraldamise ja laiendamise probleemidega ei aita tõenäoliselt kaasa selle meetodi laialdasele kasutamisele lähitulevikus, isegi kui töötatakse välja uusi tehnoloogilisi meetodeid. Teine lähenemisviis dominantse patoloogia geeniteraapias põhineb kahjustatud DNA automaatsel korrigeerimisel, kuna geneetilisi mutatsioone saab korrigeerida soovitud järjestusega eksogeense DNA (lühikesed DNA oligonukleotiidid või kimäärsed RNA/DNA oligonukleotiidid) sisseviimisega, mis seondub kahjustatud genoomi homoloogidega. Kolmas võimalus hõlmab patoloogilise teabe edastamise blokeerimist, mis saavutatakse spetsiaalselt loodud oligonukleotiidide abil, mis seonduvad spetsiifilise geeniga, moodustades kolmikstruktuurilise spiraalse struktuuri, mis välistab transkriptsiooni võimaluse.

Kuigi geneetilise haiguse korrigeerimine genoomi tasandil on endiselt kõige optimaalsem ja eelistatum ravimeetod, on mRNA ka paljutõotav vektor (võimalik, et isegi kättesaadavam) dominantse negatiivse geeni blokeerimiseks. Translatsiooni pärssimiseks ja/või mRNA degradatsiooni suurendamiseks on pikka aega kasutatud valgu molekule, millel on antisenss-oligonukleotiid või täielikud järjestused, mis blokeerivad mRNA seondumist rakulise biosünteesi aparaadiga. Lisaks indutseerib kaheahelaline RNA mRNA kiiret degradatsiooni, mille mehhanism on endiselt ebaselge. Siiski on ebatõenäoline, et lühikeste või üksikute mutatsioonidega mutantsest alleelist transkribeeritud mRNA-de elimineerimine soodustab normaalse alleeli mRNA ekspressiooni. Alternatiiviks on haamripea- ja juuksenõelaribosünteesi kasutamine, millel on võime seonduda mRNA väga spetsiifiliste piirkondadega, mille järel indutseeritakse nende lõhustumine ja inaktiveerimine translatsiooni ajal. Praegu uuritakse selle meetodi kasutamise võimalust patoloogilise osteogeneesi ravis. Sõltumata sellest, mis täpselt on sihtmärk - genoomsed või tsütoplasmaatilised elemendid, määrab uute geeniteraapia tehnoloogiate edu reagentide lisamise efektiivsus luuüdi strooma rakkudesse ex vivo, konkreetse vektori optimaalne valik ja mesenhümaalsete tüvirakkude stabiilne võime ekspresseerida vajalikke faktoreid in vivo.

Seega loob mesenhümaalsete tüvirakkude avastamine koos nende ootamatute omadustega uue kontseptuaalse skeemi rakuliinide arendamiseks. Siiski on vaja täiendavaid interdistsiplinaarseid uuringuid, et mõista strooma tüvirakkude bioloogilist rolli, nende olemust, võimet transdiferentseeruda või dedifferentseeruda, nende füsioloogilist tähtsust embrüonaalse arengu, postnataalse kasvu, küpsemise ja vananemise ajal, samuti inimeste haiguste korral.