Munajuha vereloome tüvirakud

Ilmselgelt määravad hematopoeetiliste tüvirakkude erinevad proliferatiivsed ja diferentseerumispotentsiaalid nende ontogeneetilise arengu iseärasused, kuna isegi vereloome peamiste piirkondade lokaliseerimine muutub inimestel ontogeneesi ajal. Loote rebukoti vereloome eellasrakud on pühendunud ainult erütropoeetilise rakuliini moodustumisele. Pärast primaarsete HSC-de migratsiooni maksa ja põrna laieneb pühendumisliinide spekter nende organite mikrokeskkonnas. Eelkõige omandavad hematopoeetilised tüvirakud võime genereerida lümfoidse liini rakke. Sünnieelsel perioodil jõuavad hematopoeetilised eellasrakud lõpliku lokaliseerimise tsooni ja asustavad luuüdi. Emakasisese arengu ajal sisaldab loote veri märkimisväärsel hulgal hematopoeetilisi tüvirakke. Näiteks 13. rasedusnädalal ulatub HSC tase 18%-ni mononukleaarsete vererakkude koguarvust. Seejärel täheldatakse nende sisalduse järkjärgulist vähenemist, kuid isegi enne sündi erineb HSC-de hulk nabaväädi veres vähe nende hulgast luuüdis.

Klassikaliste kontseptsioonide kohaselt toimub vereloome lokaliseerimise loomulik muutus imetajate embrüonaalse arengu ajal pluripotentsete vereloome tüvirakkude migratsiooni ja uude mikrokeskkonda viimise teel - munakollase kotikesest maksa, põrna ja luuüdisse. Kuna embrüonaalse arengu algstaadiumis sisaldab vereloomekude suures koguses tüvirakke, mis loote küpsedes väheneb, peetakse vereloome tüvirakkude saamiseks kõige lootustandvamaks embrüonaalse maksa vereloomekude, mis on eraldatud aborteeritud materjalist 5-8 rasedusnädalal.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Küsimused vereloome tüvirakkude päritolu kohta

Pole kahtlustki, et erütrotsüütide embrüonaalne moodustumine pärineb rebukoti veresaartest. Rebukoti vereloomerakkude diferentseerumispotentsiaal in vitro on aga väga piiratud (nad diferentseeruvad peamiselt erütrotsüütideks). Tuleb märkida, et rebukoti vereloome tüvirakkude siirdamine ei suuda pikka aega vereloomet taastada. Selgus, et need rakud ei ole täiskasvanud HSC-de eelkäijad. Tõelised HSC-d ilmuvad varem, emakasisese arengu 3.-5. nädalal, mao koe ja veresoonte endoteeli moodustumise tsoonis (paraaortaalne splanhnopleura, P-SP), samuti aordi, sugunäärmete ja primaarsete neerude asemele - mesonefroosse ehk nn AGM-i piirkonda. On näidatud, et AGM-i piirkonna rakud on mitte ainult HSC-de, vaid ka veresoonte endoteelirakkude ja luukoe moodustumise protsessides osalevate osteoklastide allikaks. 6. rasedusnädalal liiguvad AGM-i piirkonnast pärit varajased vereloome eellasrakud maksa, mis jääb loote peamiseks vereloomeorganiks kuni sünnini.

Kuna see punkt on rakkude siirdamise seisukohast äärmiselt oluline, väärib inimese embrüogeneesi protsessis HSC-de päritolu probleem üksikasjalikumat käsitlemist. Klassikalised ideed, et imetajate ja lindude vereloome tüvirakud pärinevad ekstraembrüoonilisest allikast, põhinevad Metcalfi ja Moore'i uuringutel, kes olid esimesed, kes kasutasid HSC-de ja nende järglaste kloonimise meetodeid, eraldades need rebukotist. Nende töö tulemused olid aluseks migratsiooniteooriale, mille kohaselt HSC-d, mis esmakordselt ilmusid rebukotis, asustavad järjestikku ajutisi ja lõplikke vereloomeorganeid, kui neis moodustub vastav mikrokeskkond. Nii tekkiski seisukoht, et HSC-de teke, mis algselt lokaliseeritud rebukotis, on lõpliku vereloome rakuline alus.

Munakotsa hematopoeetilised eellasrakud kuuluvad kõige varasemate hematopoeetiliste eellasrakkude kategooriasse. Nende fenotüüpi kirjeldab valem AA4.1+CD34+c-kit+. Erinevalt küpsetest luuüdi HSC-dest ei ekspresseeri nad Sca-1 antigeene ega MHC molekule. Näib, et markerantigeenide ilmumine munakotsa HSC-de pinnamembraanidele kultiveerimise ajal vastab nende diferentseerumisele embrüonaalse arengu ajal pühendunud hematopoeetiliste liinide moodustumisega: CD34 ja Thy-1 antigeeni ekspressiooni tase väheneb, CD38 ja CD45RA ekspressioon suureneb ning ilmuvad HLA-DR molekulid. Järgneva tsütokiinide ja kasvufaktorite poolt indutseeritud in vitro spetsialiseerumisega algab teatud rakuliini hematopoeetiliste eellasrakkude suhtes spetsiifiliste antigeenide ekspressioon. Kolme selgroogsete klassi (kahepaiksed, linnud ja imetajad) esindajate embrüonaalse hematopoeesi uurimise tulemused ja eriti postnataalses ontogeneesis lõpliku hematopoeesi eest vastutavate HSC-de päritolu analüüs on aga klassikaliste kontseptsioonidega vastuolus. On kindlaks tehtud, et kõigi vaadeldavate klasside esindajatel moodustuvad embrüogeneesi ajal kaks sõltumatut piirkonda, kus HSC-d tekivad. Ekstraembrüoonilist „klassikalist“ piirkonda esindab rebukott või selle analoogid, samas kui hiljuti tuvastatud HSC-de lokaliseerimise intraembrüooniline tsoon hõlmab paraaortilist mesenhüümi ja AGM-i piirkonda. Tänapäeval võib väita, et kahepaiksetel ja lindudel pärinevad lõplikud HSC-d intraembrüoonilistest allikatest, samas kui imetajatel ja inimestel ei saa rebukoti HSC-de osalemist lõplikus vereloomes veel täielikult välistada.

Embrüonaalne vereloome rebukotis on tegelikult primaarne erütropoees, mida iseloomustab tuuma säilimine erütrotsüütide küpsemise kõigil etappidel ja lootetüüpi hemoglobiini süntees. Viimaste andmete kohaselt lõpeb primaarse erütropoeesi laine rebukotis embrüonaalse arengu 8. päeval. Sellele järgneb definitiivsete erütroidsete eellasrakkude - BFU-E - akumuleerumise periood, mis moodustuvad ainult rebukotis ja ilmuvad esmakordselt tiinuse 9. päeval. Embrüogeneesi järgmises etapis on juba moodustunud definitiivsed erütroidsed eellasrakud - CFU-E, samuti (!) nuumrakud ja CFU-GM. See on aluseks seisukohale, et definitiivsed eellasrakud tekivad rebukotis, migreeruvad vereringega, settivad maksa ja algatavad kiiresti intraembrüoonse vereloome esimese faasi. Nende kontseptsioonide kohaselt võib munakollast pidada ühelt poolt primaarse erütropoeesi kohaks ja teiselt poolt embrüonaalse arengu esimeseks lõplike hematopoeetiliste eellasrakkude allikaks.

On näidatud, et kõrge proliferatiivse potentsiaaliga kolooniaid moodustavaid rakke saab rebukotist eraldada juba 8. tiinuse päeval, st ammu enne embrüo ja rebukoti veresoonte süsteemi sulgumist. Lisaks moodustavad rebukotist in vitro saadud kõrge proliferatiivse potentsiaaliga rakud kolooniaid, mille suurus ja rakkude koostis ei erine luuüdi tüvirakkude kultuurilise kasvu vastavatest parameetritest. Samal ajal moodustub kõrge proliferatiivse potentsiaaliga rebukoti kolooniaid moodustavate rakkude retransplanteerimisel oluliselt rohkem tütarrakke ja multipotentseid eellasrakke kui vereloome luuüdi eellasrakkude kasutamisel.

Lõpliku järelduse munakoti vereloome tüvirakkude rolli kohta definitiivses vereloomes võiksid anda töö tulemused, milles autorid said munakoti endoteelirakkude liini (G166), mis toetas tõhusalt oma rakkude proliferatsiooni HSC-de fenotüüpiliste ja funktsionaalsete omadustega (AA4.1+WGA+, madal tihedus ja nõrgad adhesiooniomadused). Viimaste sisaldus suurenes enam kui 100 korda, kui neid kasvatati C166 rakkude toitekihil 8 päeva jooksul. C166 rakkude aluskihil kasvatatud segakolooniates identifitseeriti makrofaage, granulotsüüte, megakarüotsüüte, blastrakke ja monotsüüte, samuti B- ja T-lümfotsüütide eellasrakke. Endoteelirakkude aluskihil kasvavatel munakotirakkudel oli võime ise paljuneda ja nad talusid autorite katsetes kuni kolm passaaži. Hematopoeesi taastamisega nende abiga raske kombineeritud immuunpuudulikkusega (SCID) küpsetel hiirtel kaasnes igat tüüpi leukotsüütide, samuti T- ja B-lümfotsüütide moodustumine. Siiski kasutasid autorid oma uuringutes 10-päevase embrüo munakotirakke, milles ekstra- ja intraembrüonaalne veresoonte süsteem on juba suletud, mis ei võimalda välistada intraembrüonaalsete HSC-de esinemist munakotirakkude hulgas.

Samal ajal näitas enne munakollase ja embrüo veresoonte süsteemide ühinemist (8–8,5 tiinuspäeva) isoleeritud varases arengujärgus hematopoeetiliste rakkude diferentseerumispotentsiaali analüüs T- ja B-rakkude eellasrakkude olemasolu munakollases, kuid mitte embrüo kehas. In vitro süsteemis, kaheastmelise kultiveerimise meetodil tüümuse epiteeli- ja subepiteliaalsete rakkude monokihil, diferentseerusid munakollase mononukleaarsed rakud pre-T- ja küpseteks T-lümfotsüütideks. Samades kultiveerimistingimustes, kuid maksa ja luuüdi stroomarakkude monokihil, diferentseerusid munakollase mononukleaarsed rakud pre-B-rakkudeks ja küpseteks IglVT-B-lümfotsüütideks.

Nende uuringute tulemused näitavad immuunsüsteemi rakkude arengu võimalust munakollase ekstraembrüoonilisest koest ning primaarsete T- ja B-rakkude liinide moodustumine sõltub embrüonaalsete vereloomeorganite stromaalse mikrokeskkonna teguritest.

Teised autorid on samuti näidanud, et rebukott sisaldab rakke, millel on lümfoidse diferentseerumise potentsiaal, ning saadud lümfotsüüdid ei erine antigeensete omaduste poolest suguküpsete loomade omadest. On kindlaks tehtud, et 8-9-päevase embrüo rebukotirakud on võimelised taastama lümfopoeesi atümotsüütides tüümuses küpsete CD3+CD4+- ja CD3+CD8+-lümfotsüütide tekkimisega, millel on moodustunud T-rakkude retseptorite repertuaar. Seega võivad tüümust asustada ekstraembrüoonse päritoluga rakud, kuid on võimatu välistada varajaste T-lümfotsüütide eellasrakkude tõenäolist migratsiooni embrüonaalsetest lümfopoeesi allikatest tüümusesse.

Samal ajal ei kaasne rebukoti vereloomerakkude siirdamine täiskasvanud kiiritatud retsipientidele alati ammendunud vereloomekoe lokaliseerimistsoonide pikaajalist taasasustamist ning in vitro rebukoti rakud moodustavad oluliselt vähem põrnakolooniaid kui AGM-piirkonna rakud. Mõnel juhul on 9-päevase embrüo rebukoti rakkude abil siiski võimalik saavutada kiiritatud retsipientidel vereloomekoe pikaajaline (kuni 6 kuud) taasasustamine. Autorid usuvad, et CD34+c-kit+ fenotüübiga rebukoti rakud mitte ainult ei erine AGM-piirkonna rakkudega oma võime poolest taasasustada ammendunud vereloomeorganeid, vaid taastavad ka vereloomet tõhusamalt, kuna rebukott sisaldab neid peaaegu 37 korda rohkem.

Tuleb märkida, et katsetes kasutati rebukoti hematopoeetilisi rakke koos hematopoeetiliste tüvirakkude markerantigeenidega (c-kit+ ja/või CD34+ ja CD38+), mis süstiti otse emaste hiirte järglaste maksa- või kõhuveeni, kellele manustati busulfaani süsti 18. tiinuse päeval. Sellistel vastsündinud loomadel oli nende enda müelopoees järsult pärsitud busulfaani põhjustatud hematopoeetiliste tüvirakkude eliminatsiooni tõttu. Pärast rebukoti hematopoeetiliste tüvirakkude siirdamist tuvastati retsipientide perifeerses veres 11 kuu jooksul moodustunud elemente, mis sisaldasid doonori markerit - glütserofosfaatdehüdrogenaasi. Leiti, et rebukoti HSC-d taastavad lümfoidsete, müeloidsete ja erütroidsete liinirakkude sisalduse veres, tüümuses, põrnas ja luuüdis ning kimärismi tase oli kõrgem rebukoti rakkude intrahepaatilise kui intravenoosse manustamise korral. Autorid usuvad, et varajases staadiumis embrüote (kuni 10 päeva) rebukoti HSC-d vajavad eelnevat interaktsiooni maksa hematopoeetilise mikrokeskkonnaga, et edukalt asustada täiskasvanud retsipientide hematopoeetilisi organeid. On võimalik, et embrüogeneesis on ainulaadne arenguetapp, mil munakollase rakud, mis algselt migreeruvad maksa, omandavad seejärel võime asustada küpsete retsipientide vereloomeorganite stroomat.

Sellega seoses tuleb märkida, et immuunsüsteemi rakkude kimärism on üsna sageli täheldatud pärast luuüdi rakkude siirdamist kiiritatud küpsetele retsipientidele - viimaste veres leidub doonori fenotüübi rakke retsipientide B- ja T-lümfotsüütide ning granulotsüütide hulgas üsna suurtes kogustes, mis kestab vähemalt 6 kuud.

Imetajate vereloomerakud tuvastatakse morfoloogiliste meetoditega esmakordselt embrüonaalse arengu 7. päeval ja neid esindavad vereloome saared munakollase veresoontes. Kuid loomulik vereloome diferentseerumine munakollases piirdub primaarsete erütrotsüütidega, mis säilitavad tuumad ja sünteesivad loote hemoglobiini. Sellest hoolimata arvati traditsiooniliselt, et munakollane on ainus allikas HSC-dele, mis migreeruvad areneva embrüo vereloomeorganitesse ja tagavad täiskasvanud loomadel lõpliku vereloome, kuna HSC-de ilmumine embrüo kehas langeb kokku munakollase ja embrüo veresoonte süsteemide sulgumisega. Seda seisukohta toetavad andmed, et munakollase rakud annavad in vitro kloonimisel granulotsüüte ja makrofaage ning in vivo põrna kolooniaid. Seejärel tehti siirdamiskatsete käigus kindlaks, et munakollase vereloomerakud, mis munakollases endas on võimelised diferentseeruma ainult primaarseteks erütrotsüütideks, omandavad vastsündinud ja täiskasvanud SCID-hiirte maksa mikrokeskkonnas, vaesestatud harknäärmes või strooma toitjas võime taasasustada vereloomeorganeid kõigi vereloomeliinide taastamisega isegi täiskasvanud retsipientloomadel. Põhimõtteliselt võimaldab see meil neid liigitada tõelisteks HSC-deks - rakkudeks, mis toimivad postnataalsel perioodil. Eeldatakse, et munakollane koos AGM-piirkonnaga on imetajatel lõpliku vereloome HSC-de allikaks, kuid nende panus vereloomesüsteemi arengusse on endiselt ebaselge. Samuti on ebaselge kahe sarnase funktsiooniga vereloomeorgani olemasolu bioloogiline tähendus varases imetajate embrüogeneesis.

Nendele küsimustele vastuste otsimine jätkub. In vivo õnnestus tõestada subletaalselt kiiritatud SCID-hiirte, kellel oli väljendunud T- ja B-lümfotsüütide puudulikkus, 8-8,5-päevaste embrüote munakotis lümfopoeesi taastavate rakkude olemasolu. Munakotsist vereloomerakke süstiti nii intraperitoneaalselt kui ka otse põrna ja maksakoesse. 16 nädala pärast tuvastati retsipientidel doonori MHC antrxgeenidega märgistatud TCR/CD34 CD4+ ja CD8+ T-lümfotsüüdid ning B-220+IgM+ B-lümfotsüüdid. Samal ajal ei leidnud autorid 8-8,5-päevaste embrüote kehas tüvirakke, mis oleksid võimelised immuunsüsteemi selliseks taastamiseks.

Munakotsa vereloomerakkudel on kõrge proliferatsioonipotentsiaal ja nad on võimelised in vitro pikaajaliseks isepaljunemiseks. Mõned autorid identifitseerivad neid rakke HSC-dena erütroidsete eellasrakkude pikaajalise (peaaegu 7 kuud) genereerimise põhjal, mis erinevad erütroidse liini luuüdi eellasrakkudest pikema passaažiperioodi, suuremate kolooniate suuruse, suurenenud tundlikkuse kasvufaktorite suhtes ja pikema proliferatsiooni poolest. Lisaks moodustuvad munakotsarakkude in vitro kultiveerimise sobivates tingimustes ka lümfoidsed eellasrakud.

Esitatud andmed võimaldavad meil üldiselt pidada munakollakotti HSC-de allikaks, mis on vähem pühendunud ja seetõttu suurema proliferatiivse potentsiaaliga kui luuüdi tüvirakud. Hoolimata asjaolust, et munakollakott sisaldab pluripotentseid vereloome eellasrakke, mis säilitavad in vitro pikka aega mitmesuguseid vereloome diferentseerumisliine, on HSC-de täielikkuse ainus kriteerium nende võime pikaajaliselt taasasustada retsipiendi vereloomeorganeid, mille vereloomerakud on hävinud või geneetiliselt defektsed. Seega on põhiküsimus, kas munakollakoti pluripotentsed vereloomerakud saavad migreeruda ja asustada vereloomeorganeid ning kas on soovitatav läbi vaadata teadaolevad tööd, mis näitavad nende võimet taasasustada küpsete loomade vereloomeorganeid peamiste vereloomeliinide moodustumisega. Definitiivsete GSC-de intraembrüoonilised allikad tuvastati lindude embrüotes juba 1970. aastatel, mis juba siis seadis kahtluse alla väljakujunenud ideed GSC-de ekstraembrüoonilise päritolu kohta, sealhulgas teiste selgroogsete klasside esindajate puhul. Viimastel aastatel on ilmunud publikatsioone sarnaste embrüonaalsete piirkondade esinemise kohta, mis sisaldavad GSC-sid imetajatel ja inimestel.

Tuleb veel kord märkida, et selle valdkonna fundamentaalsed teadmised on praktilise rakutransplantoloogia jaoks äärmiselt olulised, kuna need aitavad mitte ainult määrata HSC-de eelistatud allikat, vaid ka kindlaks teha primaarsete hematopoeetiliste rakkude interaktsiooni tunnuseid geneetiliselt võõra organismiga. On teada, et inimese loote maksa hematopoeetiliste tüvirakkude sisseviimine lamba embrüosse organogeneesi staadiumis viib kimäärsete loomade sünnini, kelle veres ja luuüdis on stabiilselt määratud 3–5% inimese hematopoeetilistest rakkudest. Samal ajal ei muuda inimese HSC-d oma karüotüüpi, säilitades kõrge proliferatsioonikiiruse ja diferentseerumisvõime. Lisaks ei ole siirdatud ksenogeensed HSC-d vastuolus peremeesorganismi immuunsüsteemi ja fagotsüütidega ega transformeeru kasvajarakkudeks, mis moodustas aluse päriliku geneetilise patoloogia emakasisese korrigeerimise meetodite intensiivsele arendamisele, kasutades puudulike geenidega transfekteeritud HSC-sid või ESC-sid.

Aga millises embrüogeneesi etapis on sellise korrektsiooni läbiviimine sobivam? Esmakordselt ilmuvad imetajatel vereloome jaoks määratud rakud kohe pärast implantatsiooni (6. tiinuspäev), kui vereloome diferentseerumise ja eeldatavate vereloomeorganite morfoloogilised tunnused veel puuduvad. Selles etapis on hiire embrüo hajutatud rakud võimelised taasasustama kiiritatud retsipientide vereloomeorganeid erütrotsüütide ja lümfotsüütide moodustumisega, mis erinevad peremeesrakkudest vastavalt hemoglobiini või glütserofosfaadi isomeraasi tüübi, samuti doonorrakkude täiendava kromosomaalse markeri (Tb) poolest. Imetajatel, nagu ka lindudel, ilmuvad hematopoeetilised rakud samaaegselt munakollasega, enne ühise veresoonkonna sulgumist, otse embrüo kehasse paraaortaalsesse splanhnopleurasse. AA4.1+ fenotüübiga vereloomerakud eraldati AGM piirkonnast ja neid iseloomustati multipotentsete vereloomerakkudena, mis moodustavad T- ja B-lümfotsüüte, granulotsüüte, megakarüotsüüte ja makrofaage. Fenotüübiliselt on need multipotentsed eellasrakud väga lähedased täiskasvanud loomade luuüdi HSC-dele (CD34+c-kit+). Multipotentsete AA4.1+ rakkude arv kõigi AGM piirkonna rakkude seas on väike - need moodustavad mitte rohkem kui 1/12 selle osast.

Inimese embrüos on tuvastatud ka embrüonaalne piirkond, mis sisaldab HSC-sid, mis on homoloogsed loomade AGM-piirkonnaga. Lisaks leidub inimestel embrüo kehas üle 80% kõrge proliferatiivse potentsiaaliga multipotentsetest rakkudest, kuigi selliseid rakke leidub ka rebukotis. Nende lokaliseerimise üksikasjalik analüüs näitas, et sadu selliseid rakke on kogunenud kompaktsetesse rühmadesse, mis paiknevad dorsaalse aordi ventraalseina endoteeli vahetus läheduses. Fenotüüpiliselt on need CD34CD45+Lin rakud. Seevastu rebukotis, nagu ka embrüo teistes vereloomeorganites (maks, luuüdi), on sellised rakud üksikud.

Seega sisaldab AGM piirkond inimese embrüos hematopoeetiliste rakkude klastreid, mis on tihedalt seotud dorsaalse aordi ventraalse endoteeliga. See kontakt on jälgitav ka immunokeemilisel tasandil – nii hematopoeetiliste klastrite rakud kui ka endoteelirakud ekspresseerivad veresoonte endoteeli kasvufaktorit Flt-3 ligandi, nende retseptoreid FLK-1 ja STK-1, samuti leukeemia tüvirakkude transkriptsioonifaktorit. AGM piirkonnas esindavad mesenhümaalseid derivaate tihe ümarate rakkude ahel, mis paikneb piki kogu dorsaalset aordi ja ekspresseerib tenastsiin C-d – jahvatatud aine glükoproteiini, mis osaleb aktiivselt rakkudevahelise interaktsiooni ja migratsiooni protsessides.

AGM-piirkonna multipotentsed tüvirakud taastavad pärast siirdamist kiiresti küpsetel kiiritatud hiirtel vereloome ja tagavad pikaajalise (kuni 8 kuud) efektiivse vereloome. Autorid ei leidnud munakollases selliste omadustega rakke. Selle uuringu tulemusi kinnitavad teise töö andmed, mis näitasid, et varajases arengujärgus (10,5 päeva) embrüotes on AGM-piirkond ainus HSC definitsioonile vastavate rakkude allikas, taastades müeloidse ja lümfoidse vereloome küpsetel kiiritatud retsipientidel.

AGM-i piirkonnast eraldati strooma liin AGM-S3, mille rakud toetavad pühendunud eellasrakkude CFU-GM, BFU-E, CFU-E ja segatüüpi kolooniat moodustavate ühikute teket kultuuris. Viimaste sisaldus AGM-S3 liini rakkude toitjakihil kultiveerimise ajal suureneb 10-lt 80-kordselt. Seega sisaldab AGM-i piirkonna mikrokeskkond strooma baasrakke, mis toetavad tõhusalt vereloomet, seega võib AGM-i piirkond ise toimida embrüonaalse vereloomeorganina - definitiivsete HSC-de, st täiskasvanud looma vereloomekoe moodustavate HSC-de allikana.

AGM piirkonna rakulise koostise laiendatud immunofenotüüpimine näitas, et see sisaldab lisaks multipotentsele hematopoeetilisele rakule ka müeloidse ja lümfoidse (T- ja B-lümfotsüüdid) diferentseerumisele pühendunud rakke. AGM piirkonna üksikute CD34+c-kit+ rakkude molekulaarne analüüs polümeraasi ahelreaktsiooni abil näitas aga ainult beeta-globiini ja müeloperoksidaasi geenide aktivatsiooni, kuid mitte CD34, Thy-1 ja 15 sünteesi kodeerivate lümfoidsete geenide aktivatsiooni. Liinispetsiifiliste geenide osaline aktivatsioon on iseloomulik HSC-de ja eellasrakkude genereerimise varajastele ontogeneesi etappidele. Arvestades, et pühendunud eellasrakkude arv 10-päevase embrüo AGM piirkonnas on 2-3 suurusjärku väiksem kui maksas, võib väita, et embrüogeneesi 10. päeval on vereloome AGM piirkonnas alles algamas, samas kui loote peamises vereloomeorganis on sel perioodil hematopoeetilised liinid juba arenenud.

Tõepoolest, erinevalt varasematest (9-11 päeva) munakollase ja AGM piirkonna hematopoeetilistest tüvirakkudest, mis taasasustavad vastsündinu hematopoeetilist mikrokeskkonda, kuid mitte täiskasvanud organismi, ei vaja 12-17 päeva vanuse embrüonaalse maksa hematopoeetilised eellasrakud enam varajast postnataalset mikrokeskkonda ja asustavad täiskasvanud looma hematopoeetilisi organeid mitte halvemini kui vastsündinul. Pärast embrüonaalsete maksa HSC-de siirdamist oli kiiritatud täiskasvanud retsipient-hiirte hematopoeesil polüklonaalne iseloom. Lisaks näidati märgistatud kolooniate abil, et siirdatud kloonide toimimine sõltub täielikult täiskasvanud luuüdis ilmnevast klonaalsest suktsessioonist. Järelikult on embrüonaalsetel maksa HSC-del, mis on märgistatud kõige leebemates tingimustes, ilma eksogeensete tsütokiinidega eelneva stimuleerimiseta, juba täiskasvanud HSC-de peamised omadused: nad ei vaja varajast postembrüoonilist mikrokeskkonda, lähevad pärast siirdamist sügavasse puhkeolekusse ja mobiliseeritakse klonaalseks moodustumiseks järjestikku vastavalt klonaalse suktsessiooni mudelile.

Ilmselgelt on vaja klonaalse suktsessiooni fenomenil lähemalt peatuda. Erütropoeesi viivad läbi hematopoeetilised tüvirakud, millel on kõrge proliferatsioonipotentsiaal ja võime diferentseeruda kõikideks pühendunud vererakkude eellasrakkude liinideks. Normaalse vereloome intensiivsuse korral on enamik hematopoeetilisi tüvirakke uinunud olekus ja mobiliseeritakse proliferatsiooniks ja diferentseerumiseks, moodustades järjestikku kloone, mis üksteist asendavad. Seda protsessi nimetatakse klonaalseks suktsessiooniks. Eksperimentaalseid tõendeid klonaalse suktsessiooni kohta hematopoeetilises süsteemis saadi uuringutes retroviiruse geeniülekandega märgistatud HSC-dega. Täiskasvanud loomadel säilitavad vereloomet paljud samaaegselt toimivad hematopoeetilised kloonid, HSC-de derivaadid. Klonaalse suktsessiooni fenomeni põhjal on välja töötatud repopulatsiooni lähenemisviis HSC-de identifitseerimiseks. Selle põhimõtte kohaselt tehakse vahet pikaajaliste hematopoeetiliste tüvirakkude (LT-HSC) vahel, mis on võimelised taastama hematopoeetilist süsteemi kogu eluea jooksul, ja lühiajaliste HSC-de vahel, mis täidavad seda funktsiooni piiratud aja jooksul.

Kui vaatleme hematopoeetilisi tüvirakke taasasustamise lähenemisviisi seisukohast, siis embrüonaalse maksa hematopoeetiliste rakkude eripäraks on nende võime luua kolooniaid, mis on oluliselt suuremad kui nabaväädivere või luuüdi HSC-de kasvus olevad kolooniad ja see kehtib igat tüüpi kolooniate kohta. Ainuüksi see fakt näitab embrüonaalse maksa hematopoeetiliste rakkude suuremat proliferatiivset potentsiaali. Embrüonaalse maksa hematopoeetiliste eellasrakkude ainulaadne omadus on lühem rakutsükkel võrreldes teiste allikatega, millel on siirdamise ajal hematopoeetiliste organite taasasustamise efektiivsuse seisukohast suur tähtsus. Küpse organismi allikatest saadud hematopoeetilise suspensiooni rakulise koostise analüüs näitab, et ontogeneesi kõigis etappides on tuumarakud valdavalt esindatud lõplikult diferentseerunud rakkudega, mille arv ja fenotüüp sõltuvad hematopoeetilise koe doonori ontogeneetilisest vanusest. Eelkõige koosnevad luuüdi ja nabaväädivere mononukleaarsete rakkude suspensioonid enam kui 50% lümfoidse seeria küpsetest rakkudest, samas kui embrüonaalse maksa hematopoeetiline kude sisaldab vähem kui 10% lümfotsüüte. Lisaks on embrüonaalses ja loote maksas müeloidse liini rakud esindatud peamiselt erütroidsete rakkudega, samas kui nabaväädi veres ja luuüdis domineerivad granulotsüütide-makrofaagide elemendid.

Samuti on oluline, et embrüonaalne maks sisaldaks täielikku komplekti kõige varasemaid vereloome eellasrakke. Viimaste hulgas tuleks märkida erütroidseid, granulopoeetilisi, megakarüopoeetilisi ja mitmerealisi kolooniaid moodustavaid rakke. Nende primitiivsemad eellasrakud - LTC-IC - on võimelised in vitro prolifereeruma ja diferentseeruma 5 nädalat või kauem ning säilitavad funktsionaalse aktiivsuse ka pärast retsipiendi organismi kinnitumist allogeense ja isegi ksenogeense siirdamise ajal immuunpuudulikkusega loomadele.

Erütroidrakkude ülekaalu bioloogiline otstarbekus embrüonaalses maksas (kuni 90% hematopoeetiliste elementide koguarvust) tuleneb vajadusest varustada areneva loote kiiresti kasvavat veremahtu erütrotsüütide massiga. Embrüonaalses maksas esindavad erütropoeesi erineva küpsusastmega tuumaerütroidprekursorid, mis sisaldavad loote hemoglobiini (a2u7), mis oma suurema afiinsuse tõttu hapniku suhtes tagab viimase efektiivse imendumise ema verest. Erütropoeesi intensiivistumine embrüonaalses maksas on seotud erütropoetiini (EPO) sünteesi lokaalse suurenemisega. On tähelepanuväärne, et ainuüksi erütropoetiini olemasolu on piisav hematopoeetiliste rakkude hematopoeetilise potentsiaali realiseerimiseks embrüonaalses maksas, samas kui luuüdi ja nabaväädivere HSC-de erütropoeesile pühendumiseks on vajalik tsütokiinide ja kasvufaktorite kombinatsioon, mis koosnevad EPO-st, SCF-ist, GM-CSF-ist ja IL-3-st. Samal ajal ei reageeri embrüonaalsest maksast eraldatud varajased hematopoeetilised eellasrakud, millel puuduvad EPO retseptorid, eksogeensele erütropoetiinile. Erütropoeesi indutseerimiseks embrüonaalse maksa mononukleaarsete rakkude suspensioonis on vajalik arenenumate erütropoetiinitundlike rakkude olemasolu CD34+CD38+ fenotüübiga, mis ekspresseerivad EPO retseptorit.

Kirjanduses puudub endiselt üksmeel vereloome arengu osas embrüonaalsel perioodil. Hematopoeetiliste eellasrakkude ekstra- ja intraembrüonaalsete allikate olemasolu funktsionaalset tähtsust ei ole kindlaks tehtud. Siiski pole kahtlust, et inimese embrüogeneesis on maks vereloome keskne organ ning 6.–12. rasedusnädalal on see peamine vereloome tüvirakkude allikas, mis asustavad põrna, tüümust ja luuüdi. GDR-id tagavad vastavate funktsioonide täitmise arengu pre- ja postnataalsel perioodil.

Tuleb veel kord märkida, et embrüonaalset maksa iseloomustab võrreldes teiste allikatega kõrgeim HSC-de sisaldus. Ligikaudu 30%-l embrüonaalse maksa CD344+ rakkudest on CD38 fenotüüp. Samal ajal ei ole lümfoidsete eellasrakkude (CD45+) arv maksas vereloome algstaadiumis suurem kui 4%. On kindlaks tehtud, et loote arenedes, 7.–17. rasedusnädalani, suureneb B-lümfotsüütide arv järk-järgult igakuise 1,1% „sammuga“, samas kui HSC-de tase langeb püsivalt.

Hematopoeetiliste tüvirakkude funktsionaalne aktiivsus sõltub ka nende allika embrüonaalse arengu perioodist. Inimese embrüote maksarakkude kolooniaid moodustava aktiivsuse uuring 6.-8. ja 9.-12. rasedusnädalal poolvedela keskkonnas kultiveerimise ajal SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 ja EPO juuresolekul näitas, et kolooniate koguarv on 1,5 korda suurem embrüonaalse maksa HSC-de külvamisel arengu algstaadiumis. Samal ajal on müelopoeesi eellasrakkude, näiteks CFU-GEMM, arv maksas 6.-8. embrüogeneesi nädalal enam kui kolm korda suurem kui nende arv 9.-12. rasedusnädalal. Üldiselt oli embrüote hematopoeetiliste maksarakkude kolooniaid moodustav aktiivsus raseduse esimesel trimestril oluliselt suurem kui loote maksarakkudel raseduse teisel trimestril.

Ülaltoodud andmed näitavad, et embrüonaalset maksa embrüogeneesi alguses iseloomustab mitte ainult varajaste hematopoeetiliste eellasrakkude suurenenud sisaldus, vaid selle hematopoeetilisi rakke iseloomustab ka laiem diferentseerumisspekter erinevatesse rakuliinidesse. Need embrüonaalse maksa hematopoeetiliste tüvirakkude funktsionaalse aktiivsuse tunnused võivad omada teatud kliinilist tähtsust, kuna nende kvalitatiivsed omadused võimaldavad meil oodata väljendunud terapeutilist toimet isegi väikese arvu tiinuse algstaadiumis saadud rakkude siirdamisel.

Sellest hoolimata jääb efektiivseks siirdamiseks vajalike hematopoeetiliste tüvirakkude hulga probleem lahtiseks ja aktuaalseks. Seda püütakse lahendada, kasutades ära embrüonaalse maksa hematopoeetiliste rakkude suurt potentsiaali isepaljunemiseks in vitro tsütokiinide ja kasvufaktorite stimuleerimisel. Varajaste embrüonaalsete maksa HSC-de pideva perfusiooniga bioreaktoris on 2-3 päeva pärast võimalik saada väljundis hematopoeetiliste tüvirakkude kogus, mis on 15 korda suurem kui nende algne tase. Võrdluseks tuleb märkida, et inimese nabaväädivere HSC-de väljundi 20-kordseks suurenemiseks samades tingimustes kulub vähemalt kaks nädalat.

Seega erineb embrüonaalne maks teistest vereloome tüvirakkude allikatest nii pühendunud kui ka varajaste vereloome eellasrakkude suurema sisalduse poolest. Kasvufaktoritega kultuuris moodustavad CD34+CD45Ra1 CD71l0W fenotüübiga embrüonaalsed maksarakud 30 korda rohkem kolooniaid kui sarnased nabaväädivere rakud ja 90 korda rohkem kui luuüdi HSC-d. Kõige ilmekamad erinevused nimetatud allikate vahel ilmnevad varajaste vereloome eellasrakkude sisalduses, mis moodustavad segakolooniaid - CFU-GEMM hulk embrüonaalses maksas ületab nabaväädiveres ja luuüdis vastavalt 60 ja 250 korda.

Samuti on oluline, et kuni 18. embrüonaalse arengu nädalani (luuüdi vereloome algusperiood) osaleb vereloomefunktsiooni rakendamises üle 60% maksarakkudest. Kuna inimese lootel puudub tüümus ja vastavalt ka tümotsüüdid kuni 13. arengunädalani, vähendab vereloomerakkude siirdamine 6.–12. rasedusnädala embrüonaalsest maksast oluliselt transplantaadi ja peremehe vahelise reaktsiooni tekkimise riski ega nõua histoloogiliselt ühilduva doonori valimist, kuna see muudab vereloome kimärismi saavutamise suhteliselt lihtsaks.