Embrüonaalsed tüvirakud

Embrüonaalsete tüvirakkude avastamine ei tekkinud juhuslikult, vaid ilmus arengubioloogia valdkonna teadusuuringute ettevalmistatud pinnal. Mõiste "tüvirakk" võeti meditsiinis kasutusele 1908. aastal Berliini hematoloogiaühingu kongressil Aleksander Maksimovi poolt seoses vereloomerakkudega. Kaua enne pluripotentsete embrüonaalsete tüvirakkude stabiilsete liinide eraldamist ja tootmist kasutati terato-(embrüokartsinoomi) tüvirakke varajaste arenguprotsesside uuringutes, mille abil uuriti embrüogeneesi tundmatuid mehhanisme, sealhulgas varajaste geenide ja nende aktiivsuse valguproduktide ekspressioonijärjestust.

Aga kas inimese genoomi totipotentsus on evolutsiooniprotsessis pöördumatult kadunud? Ei, ja embrüogenees on selle tõestuseks. Kui see nii on, siis millal põhimõtteliselt realiseerub evolutsioonilise arengu teine tee? Tõenäoliselt siis, kui inimene siseneb kosmosesse, kus keskkonnatingimused on piisavalt pikka aega suhteliselt konstantsed. Luukoe kadu (luude demineraliseerumine kaaluta olekus), mis allub väga aeglaselt ümberkujunemisele ja regeneratsioonile, võib pidada esimeseks sammuks inimese kui liigi kohanemisprotsessis kosmosetingimustes eksisteerimisega. Teise evolutsioonilise arengu tee hind on aga erinev - totipotentsuse ja absoluutse plastilisuse taastamise hind kõigile rakkudele on steriilsus. Seega peame selles "evolutsiooniliste kameeleonide" maailmas paljunema ilma meioosita, pungumise teel. Aga me elame kaua. Telomeraasi surematus on amööbi surematus. Mitmerakulises organismis on tüvirakud kvantitatiivse ja kvalitatiivse pikaealisuse substraat.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Embrüonaalsete tüvirakkude allikad

Tänapäeval on laboriuuringuteks embrüonaalsete tüvirakkude allikateks hiire teratokartsinoomi liinid (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) ja inimese teratokartsinoomi liinid (NTERA-2, TERA-2, H-9 kloon), samuti Trauneoni embrüonaalsete tüvirakkude liinid. Siiski ei kompenseeri detailse rakupassi olemasolu, mis näitab immuunfenotüüpi, kromosoomianalüüsi tulemusi, mRNA ekspressiooniprofiile, eksponeeritud retseptoreid ja rakusiseseid signaalvalke, teratokartsinoomi embrüonaalsete tüvirakkude liinide olulisi puudusi - totipotentsuse kiiret kadu ja nende kliinilistes uuringutes kasutamise võimatust, samas kui segatüüpi diferentseerumine kultuuris muudab puhta spetsialiseerunud liini eraldamise heterogeensest rakupopulatsioonist väga keeruliseks. Seetõttu on kliinilistel eesmärkidel loodud embrüonaalsete tüvirakkude liinide allikaks tavaliselt blastotsüsti sisemine rakumass, 8-rakuliste embrüote üksikud blastomeerid, hilisemate staadiumite moorularakud, samuti ürgsed sugurakud.

Tuleb märkida, et teratokartsinoomirakud, kuigi neil on pluripotentsuse omadus, on iseloomulikud oluliselt madalamale pluripotentsele potentsiaalile võrreldes ESC-dega. Nende integreerumine embrüonaalsete rakkudega viib harva kimääride moodustumiseni, mis pealegi ei moodusta kunagi teratokartsinoomirakkude genotüübiga sugurakke. Arvatakse, et see on tingitud kromosomaalsete anomaaliate sagedasest esinemisest teratokartsinoomirakkude kultiveerimisel: Y-kromosoomi kadu, mitmesugused trisoomiad, deletsioonid või translokatsioonid.

Inimese ESC liini isoleerimise katseid on tehtud korduvalt, kuid seda ülesannet pole lahendatud, kuna normaalsetele inimese blastotsüstidele on raske ligi pääseda. Lisaks on kromosomaalsete anomaaliate esinemissagedus inimestel suurem kui loomade embrüogeneesis. Valdav enamus in vitro viljastamise käigus saadud varajastest inimese embrüotest näitab kaootilist kromosomaalset mosaiiksust ning neil on sageli arvulisi ja struktuurilisi aberratsioone. Isegi hiljem, blastotsüsti staadiumis, koosneb vaid 20–25% inimese embrüotest normaalse karüotüübiga rakkudest. Selliste embrüote kasutamine ESC-de loomiseks oli praktiliselt võimatu, kuna sügoote kultiveeriti tavaliselt kahe- või neljablastomeeri staadiumini ja seejärel siirdati emakasse. Alles suhteliselt hiljuti on välja töötatud usaldusväärne tehnika viljastatud inimese munarakkude kultiveerimiseks blastotsüsti staadiumini. Selle tehnika kasutuselevõtt in vitro viljastamise praktikas on mitte ainult suurendanud edukate implantatsioonitulemuste sagedust, vaid muutnud ka normaalsed blastotsüstid kättesaadavamaks objektiks.

Teine pluripotentsete tüvirakkude allikas on ürgsed sugurakud, millel erinevalt germinaalse epiteeli arenenumatest eellaspopulatsioonidest ei ole pinnal beeta-integriini, kuid mis ekspresseerivad alkaalse fosfataasi kõrget aktiivsust. Tuleb märkida, et ürgsetest sugurakkudest moodustunud tüvirakkude populatsioone on eksperimentaalselt uuritud alates 1980. aastatest. Sel ajal töötati välja tehnika ürgsete sugurakkude eraldamiseks hiire embrüo gonaadi rudimendist. Esimesed ebaõnnestunud tulemused ürgsete sugurakkude in vitro kultiveerimisel viitasid nende katsete mõttetusele, kuna rakud, kuigi nad jäid ellu, ei prolifereerunud ja surid esimese päeva jooksul. Hiljem tehti kindlaks, et hiire ürgsed sugurakud paljunevad in vitro ainult lahustuvate ja membraaniga seotud spetsiifiliste polüpeptiidi kasvufaktorite juuresolekul kultuurikeskkonnas. Arvukate uuringute tulemused on näidanud, et primaarsete sugurakkude ellujäämiseks ja proliferatsiooniks on kultuurikeskkonnas vajalik mitte ainult LIF, vaid ka membraaniga seotud ja lahustuvate Steel-faktorite (SIF) olemasolu. Neid peptiide toodavad Steeli mutatsiooni suhtes homosügootsete embrüote somaatilised rakud ja üks neist on cKit protoonkogeeni ligand.

Imetajate ja inimeste primaarsed sugurakud on ekstragonadaalse päritoluga ja on sugurakkude liini klonaalse arengu allikaks. Primaarse sugurakkude liini, nagu ka kõigi embrüonaalsete kudede ja ekstraembrüoonse mesodermi päritolu on varajaste embrüote epiblast (primaarne ektoderm), millel on mosaiikne struktuuriline organisatsioon. Varajase embrüo erinevate osade mikrokirurgilise eemaldamise meetodi abil määrati kindlaks ürgsete sugurakkude pühendunud eellasrakkude klooni lokaliseerimistsoon epiblastis. Kasutades rodamiindekstraani, mida kasutati rakumarkerina, tehti kindlaks, et ürgsete sugurakkude eellasrakud lokaliseeruvad epiblasti proksimaalses piirkonnas, ekstraembrüoonse ektodermi lähedal. Primaarne sugurakkude liin pärineb 45-rakulisest kloonist, mille eraldamine toimub gastrulatsiooni alguses. Seejärel kloon eraldub ja gastrulatsiooni ajal sisenevad primaarsed sugurakud ekstraembrüoonsesse mesodermi ja asuvad allantoisi rudimenti aluses, primaarse triibu taga. Sealt migreeruvad primaarsed sugurakud tagasoole endodermi ventraalse osa suunas ja liiguvad seejärel aktiivselt mööda mesenteeriumi, asustades migratsiooni lõpus suguelundite harjad. Migratsiooni ajal, samuti esimese 2-3 päeva jooksul pärast lokaliseerumist gonaadi rudimendis, prolifereeruvad primaarsed sugurakud aktiivselt ja läbivad kaheksa replikatsioonitsüklit. Kui migratsiooni alguses on umbes 50 primaarset sugurakku, siis kaheteistkümnepäevase arenguga hiireembrüote suguelundite harjades ületab primaarsete sugurakkude arv 25 000.

ESC-de ja ürgsete sugurakkude funktsionaalset sarnasust tõendab viimaste täielik integreerumine blastotsüsti koos sisemise rakumassi asendamisega ja sellele järgneva embrüo täieliku arenguga, mille koed koosnevad ainult ürgsete sugurakkude järeltulijatest. Muude omaduste poolest osutusid hiire ürgsed sugurakud samuti ESC-dega identseks, näidates võimet diferentseeruda erinevates suundades, moodustada in vitro embrüokehasid ja moodustada in vivo teratoome immuunpuudulikkusega hiirtele subkutaanselt manustatuna, mis meenutavad 129/ter hiirte spontaanseid munandite teratoome.

Leiti, et kui keskkonda lisada LIF-i, membraaniga seotud ja lahustuvat SIF-i, jäävad 8-päevaste hiireembrüote isoleeritud primaarsed sugurakud kultuuris ellu ja paljunevad 4 päeva, kuid seejärel surevad. Lisaks langeb periood, mil kultuuris täheldatakse primaarsete sugurakkude surma, kokku hiireembrüote arenguetapiga (12,5–13,5 päeva), mil emased primaarsed sugurakud sisenevad sugunäärmete algetes meioosi ja isastes primaarsetes sugurakkudes blokeeritakse mitootilised jagunemised. Kui aga keskkonda lisada mitte ainult kasvufaktorid LIF ja SIF, vaid ka FGF2, jätkavad primaarsed sugurakud vohamist ja subkultuurides moodustuvad rakkude kolooniad, mis on võimelised paljunema ka pärast kasvufaktorite (SIF ja FGF) eemaldamist keskkonnast. Selliseid rakke saab pikka aega kultiveerida embrüonaalsete fibroblastide substraadil ilma lahustuvat kasvufaktorit LIF lisamata. Tehti ettepanek nimetada neid primaarsetest sugurakkudest saadud stabiilseid rakuliine embrüonaalseteks sugurakkudeks. See termin ei ole sugugi edukas, kuna EG-rakkude kultiveerimisel ei ole võimalik saada embrüonaalseid sugurakke, mis on võimelised läbi viima järgnevaid oogeneesi või spermatogeneesi etappe. See on tingitud asjaolust, et EG-rakuliinid, kuigi nad pärinevad ürgsetest sugurakkudest, kuid omandades kultuuris embrüonaalsete pluripotentsete tüvirakkude omadused, kaotavad võime pühenduda sugurakkude liinidele. Teisisõnu, ürgsed sugurakud kaotavad kultiveerimisel sugurakkude eellasrakkude omadused ja transformeeruvad ESC-sarnasteks pluripotentseteks rakkudeks.

On täheldatud, et teratoomid ei teki EG-rakkude viimisel immuunpuudulikkusega hiirtele. Eeldatakse, et inimese EG-rakkude võime kadumine teratoomide tekitamiseks on tingitud asjaolust, et neid liine ei loodud otse kultiveeritud primaarsetest sugurakkudest, vaid need saadi embrüokehadest eraldatud rakkudest. Seetõttu on võimalik, et need on pluripotentsete, kuid juba pühendunud rakkude järeltulijad.

Tuleb märkida, et EG-rakkude ja ürgsete sugurakkude vahel on põhimõttelisi erinevusi. Viimased ei võimalda saada kimäärseid hiireembrüoid, mis näitab ürgsete sugurakkude võimetust integreeruda sisemisse rakumassi ehk trofektodermi. Ürgsete sugurakkude populatsiooni omadused on sarnasemad hilisemate embrüote somaatiliste rakkude pühendunud liinidega, mille viimine blastotsüsti ei vii samuti kimäärsete embrüote moodustumiseni.

EG-rakkude agregeerimise teel saadud embrüokehade kultiveerimistehnika modifitseerimine võimaldas saada selektiivse söötme abil selektsiooni abil uue pluripotentsete rakkude populatsiooni, mida nimetatakse "embrüokehast pärinevateks rakkudeks" (EBD-rakud). EBD-rakkude võime pikka aega kultuuris prolifereeruda võimaldas luua pühendunud rakkude stabiilseid rakuliine. Saadi kloonid rakkudest, mis ekspresseerivad spetsialiseerunud rakkude laia valikut mRNA ja valgu markereid. See lähenemisviis tõestas lõpuks, et inimese primaarsed sugurakud on pluripotentsed ja diferentseeruvad in vitro erinevateks rakutüüpideks: neuroniteks, neurogliateks, veresoonte endoteeliks, vereloomerakkudeks, lihas- ja endodermaalrakkudeks.

Embrüonaalsete tüvirakkude alternatiivsed allikad

Inimese ESC liinide alternatiivseks allikaks võivad olla hübriidrakud. Heterogeense konstruktsiooni implanteerimine pseudotiinele lehmale emakasse, mis on saadud inimese loote somaatiliste rakkude ja lehma munaraku (millest on eelnevalt eemaldatud protuum) elektroporatsiooni teel liitmise teel saadud konstruktsiooniga, võimaldab saada sisemise rakumassi implantatsioonieelses arengujärgus olevast kunstlikust embrüost. Selleks saadakse esimeses etapis blastotsüst lehma munarakust koos siirdatud inimese rakutuumaga.

Teises etapis eraldatakse blastotsüstist embrüoblast ja sellest Thomsoni meetodil eraldatakse ESC-d. Tähelepanuväärne on see, et parimad tulemused ESC-liinide eraldamisel selle meetodi abil saadi follikulaarsete rakkude või primaarsete sugurakkude tuumade abil, mis jäävad inimkehasse talveunne. See on tingitud asjaolust, et lehma munarakku siirdatud inimrakkude tuumadel peavad olema lühenemata telomeerid ja kõrge telomeeride aktiivsus, mis aitab vältida hübriidmunarakust saadud ESC-kloonide enneaegset vananemist (Repin, 2001). On teada, et ESC-de kõige olulisemad rakusisesed markervalgud on Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, mis kuuluvad nn kromatiini summutivalkude hulka. Summutid pakuvad eriti kompaktset heterokromatiini pakendit, mis takistab eukromatiini silmuste moodustumist. Nende valkude vahendatud kromatiini pakkimine korreleerub ESC genoomi totipotentsusega. Praeguseks on kindlaks tehtud, et küpsed veise ja inimese munarakud on ainsad spetsialiseerunud rakkude tüübid, mis sisaldavad tsütoplasmas summutivalkude kõrget kontsentratsiooni. Selle põhjal töötati välja meetod hübriidsete ESC-de saamiseks somaatiliste rakkude tuumade ülekandmise teel enukleeritud veise munarakkudesse. Esialgsed in vitro uuringud on näidanud, et veise munarakkude tsütoplasma taastab inimese somaatiliste rakkude tuumade genoomi totipotentsi pärast 12-24 tundi kultiveerimist.

Eriti huvipakkuvad on andmed inimese embrüote preimplantatsioonilise arengu iseärasuste kohta, mis viitavad totipotentsete rakkude hilisemale asendumisele pluripotentsete rakkude populatsiooniga kui hiirtel. Rakkude transformatsioonide uuring näitas, et lisaks ESC-dele tekivad inimese blastotsüstide sisemise rakumassi rakkudest ka trofoblastirakud, mis näitab nende kogupotentsiaali.

On teada, et blastotsüsti staadiumis tekib kaks erinevalt pühendunud rakupopulatsiooni. Üks neist moodustab blastotsüsti väliskihi - trofektodermi, mille derivaadid on trofoblastirakud ja platsenta teised embrüonaalsed komponendid. Teine rakupopulatsioon on koondunud tihedaks massiks, mis puutub kokku trofektodermi sisepinnaga. Sisemise rakumassi rakkude populatsiooni derivaadid on kõik embrüo organite koed ja rudimendid. Hilisblastotsüsti staadiumis moodustub sisemisest rakumassist ekstraembrüoonne endoderm ja epiblast (primaarne ektoderm). Sel juhul säilitavad epiblastirakud pluripotentsuse, samas kui ekstraembrüoonse endodermi rakkude diferentseerumisvõime on piiratud.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Inimese embrüonaalsete tüvirakkude hankimine

Kuni viimase ajani arvati, et trofoblastidest on võimatu ESC-sid saada. Blastotsüstist eraldatud diploidsete trofektodermi tüvirakkude liin aga prolifereerub ja transformeerub tüvirakkudeks keskkonnas, mis sisaldab LIF-i asemel FGF2 ja hepariini. Kui FGF2 keskkonnast eemaldatakse, siis trofektodermi rakkude paljunemine lakkab, neis algab kromosoomide endoreduplikatsioon ja trofektodermi rakulised elemendid transformeeruvad järk-järgult hiiglaslikeks trofoblastrakkudeks. Tõenäoliselt ei stimuleeri LIF trofektodermi rakkude proliferatsiooni, kuna FGF2 käivitab teistsuguse transsignaaliülekande mehhanismi, kuna plasmaretseptoriga (FGFR2) seonduv FGF2 aktiveerib tsütoplasmas MAP-kinaase - ERK1 ja ERK2. Järelikult, kui blastotsüsti rakkudes on sisse lülitatud üks signaalirada (LIF - gpl30 - JAK kinaas - STAT3), transformeeruvad sisemise rakumassi rakud pluripotentseteks ESC-deks ja kui aktiveeritakse teine transmembraanse signaaliülekande mehhanism (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaas ERK1/ERK2), moodustuvad blastotsüstis trofektodermi tüvirakud. Signaaliraja valik sõltub omakorda oct4 geeni aktiivsusest. See POU domeeni kuuluv geen asub autosoomi 17 t-lookuses ja seda ekspresseeritakse oogeneesi ajal, lõhustumisperioodil, samuti blastotsüsti sisemise rakumassi rakkudes ja primaarsetes sugurakkudes. Oct4 geeni funktsionaalne roll on kodeerida transkriptsioonifaktorit, mis on vajalik pluripotentsete rakkude tekkeks, nende diferentseerumiseks ja dedifferentseerumiseks.

Oct4 geeni ekspressioon ESC-des varieerub sõltuvalt selle transkriptsioonifaktori interaktsioonist kofaktoritega. Oct4 ekspressiooni suunatud regulatsioon blastotsüstides näitas, et kui selle aktiivsus väheneb, moodustavad pooled rakkudest trofektodermi, samas kui kui oct4 indutseeritud ekspressioon suureneb, tekivad peamiselt ESC-d.

Eksperimendis ei saa ESC-sid liini üle kanda totipotentsete blastomeeride kultiveerimise ajal lõhustumisstaadiumis, samuti gastrulatsioonistaadiumis ja embrüonaalse arengu hilisemates etappides. Hiire ESC-sid eraldatakse tavaliselt tiinuse 3,5–4,5. päeval, mis vastab normaalse embrüogeneesi kuuendale (ühekihiline blastotsüst) ja seitsmendale staadiumile (kahekihiline blastotsüst - varajane munasilinder). Ilmselgelt sisaldavad hiire embrüod ainult preimplantatsiooniperioodil rakupopulatsioone, mis on võimelised transformeeruma ESC-deks. Järelikult on ESC liinide eraldamine võimalik ainult teatud embrüogeneesi etappides. Lõhustumisel tekkiv sügoot ja blastomeerid on totipotentsed, seisukohast elujõulise embrüo arenguvõimalused embrüonaalsete membraanide ja platsentaga. Sugurakkude täieliku potentsi kadu algab hilises moorula staadiumis, kui blastomeeride edasine pühendumine sõltub nende asukohast. Varased morula blastomeerid säilitavad totipotentsuse, kuna eksperimentaalsed manipulatsioonid nende lokaliseerimise muutustega, näiteks asukoha inversioon, ei takista täieõigusliku embrüo arengut.

On kindlaks tehtud, et embrüonaalsete tüvirakkude liini isoleerimise efektiivsust mõjutab blastotsüstide seisund nende eksplanteerimise ajal. Blastotsüstide kasutamine pärast seitsmepäevase diapausi modelleerimist hiirte reproduktiivtraktis, kellel tehti munasarjad 3,5. tiinuse päeval ja kellele manustati progesterooni, hõlbustab embrüonaalsete tüvirakkude liinide edukamat isoleerimist. Eeldatakse, et sellistes tingimustes suureneb sisemist rakumassi moodustavate blastomeeride arv. Samuti on võimalik, et rakutsükkel pikeneb ja enamik blastomeere siseneb G0 faasi.

Lisaks sõltub stabiilsete pluripotentsete ESC liinide loomine embrüote genotüübist: ESC-sid on 129 hiire liini blastotsüstidest üsna lihtne eraldada, CS7BL/6 hiirte abil on neid palju raskem saada ja CBA/Ca hiirte blastotsüstidest on ESC liini eraldamine praktiliselt võimatu. Ilmselgelt on varajastel embrüotel mõned geneetilised tunnused, mis mõjutavad pluripotentsete ESC liini arengut. Sellest hoolimata eraldati isoleeritud epiblastide kultiveerimisel ja diferentseeruvate rakkude selektiivsel selektsioonil ESC liine CBA/Ca hiirte varajastest embrüotest.

Tõestatud standardtehnika ESC-liinide saamiseks blastotsüstidest on esitatud laborikäsiraamatutes varajaste embrüotega tehtavate katsete tehnika kohta. Eksperimentaalseid ESC-liine saab saada ka 4,5-päevaste hiireembrüote isoleeritud epiblasti (primaarse ektodermi) kultiveerimise teel, kasutades üsna keerukat mikrokirurgilist tehnikat ja modifitseeritud kultiveerimistingimusi. Selle protseduuri töömahukus on õigustatud, kuna ESC-liinide moodustumise sagedus osutus antud juhul oluliselt suuremaks kui blastotsüsti sisemise rakumassiga töödes.

ESC-liinide isoleerimiseks kantakse iga kloon mikrolaineahju, kasvatatakse 40–60 rakust koosnev agregaat ja seejärel dispergeeritakse uuesti. Selle protseduuri mitmekordne kordamine võimaldab meil saada immortaliseeritud ESC-liini, millel on plastikule kinnitatud normokarüotüüpsete rakkude maksimaalne proliferatsioonikiirus, mis säilitab totipotentsuse ja kõrge telomeraasi aktiivsuse pärast 50–100 passaaži. ESC-liinide säilitamise protsessis on suurimaks ohuks söötme või seerumi saastumine bakteriaalsete endotoksiinidega – isegi endotoksiini jälgedes sisalduv kontsentratsioon kultuurikeskkonnas põhjustab ebaküpsete sugurakkude massilist surma. Lineaarse kasvu hoolika jälgimise ja õigeaegse dispergeerimise korral on ESC-d kultuuris võimelised sümmeetriliseks jagunemiseks, kus mõlemad tütarrakud jäävad pluripotentseteks ja on võimelised läbima piiramatu arvu rakutsükleid, säilitades diploidse karüotüübi ja kogupotentsi.

Inimese ESC-de puhta populatsiooni selektsiooni saab läbi viia pärast nende genoomi transfektsiooni rekombinantsete DNA molekulidega, mis sisaldavad rohelise fluorestseeruva valgu (GFP) sünteesi kodeerivat geeni. GFP ekspressioon suureneb, kui ESC-sid kasvatatakse tingimustes, mis toetavad nende proliferatsiooni, samas kui diferentseerumise algusega selle geeni ekspressioonitase väheneb, mis võimaldab valida puhtaid stabiilseid pluripotentseid rakuliine selektiivsel söötmel. GFP selektsiooni abil eraldatud ESC-de kultiveerimisel suureneb kolooniate moodustumise sagedus mitu korda, kuna diferentseerunud rakkude võimas proliferatsioonivastane toime selektsioonikultuuride tingimustes kaob.

Inimese embrüonaalsete tüvirakkude translatsioon liiniks viiakse läbi nende eraldamise meetodil implantatsioonieelsetest embrüotest (staadiumis 80–120 rakku), mis jäävad alles pärast in vitro viljastamist. Selleks dispergeeritakse kunstlikult saadud „liigsed“ embrüod mehaaniliselt Delbecco-Eagle söötmes. Pärast rakkude märgistamist fluorestsentsmärgisega selektiivsete monoklonaalsete antikehadega eraldatakse embrüoblastrakud. Embrüoblast dispergeeritakse üksikuteks rakkudeks dispaas-kollagenaasi segu abil. Dissotsieerunud rakke kasvatatakse spetsiaalses söötmes (80% Delbecco sööde + 20% loote vasika seerumit 500 μg/ml IL-6, LIF ja SCF juuresolekul) esimese kolme passaaži embrüonaalsete fibroblastide toitja monokihi peal. Sel juhul säilib tüvi- ja eellasrakkude ellujäämine ja proliferatsioon IL-6, LIF ja SCF mõjul. Sellises söötmes kasvavad ESC-d kinnitumata pallideks moodustatud rakkude suspensioonkloonidena, mis tuleb dissotsieerida pehme, korduva pipeteerimisega. Uued kloonid ilmuvad suspensioonkultuuri 5.-7. päeval. ESC-de maksimaalne kasvukiirus saavutatakse kloonide korduva dissotsiatsiooni teel 10-15 raku staadiumis. Seejärel kantakse iga kloon mikrolaineahju ja kasvatatakse 40-50 raku agregaadiks. Protseduuri korratakse mitu korda passaažides, suurendades kultuuri mahtu tiheduseni 5-10 miljonit rakku 6 cm tassi kohta. Sellise passaaži abil eraldas Thomson 10 surematut inimese ESC klooni, mis pärast 100 passaaži säilitasid kõrge telomeraasi aktiivsuse, võime jõuliselt prolifereeruda, minimaalsed fenotüüpilised omadused ja täieliku potentsi võimega diferentseeruda ükskõik milliseks 350 spetsialiseerunud rakuliinist, mis pärinevad ekto-, meso- ja endodermist. Inimese ESC-de diferentseerumine algas (pärast söötme vahetamist, seerumi lisamist ja LIF-i elimineerimist) rakkude kinnitumisega substraadile, mis näitab tsütoskeleti arengut ja adhesiooniretseptorite ekspressiooni. Oluline on see, et piiramatu proliferatsiooni korral säilitasid inimese ESC-d normaalse karüotüübi.

Teine inimese ESC-liinide eraldamise meetod põhineb primaarsete sugurakkude kasutamisel. Eksperimentaalsed uuringud on näidanud, et E-rakkude liine saab saada 12,5-päevaste hiireembrüote suguelundite voltidest. Nendel juhtudel oli aga eellasrakkude liinide moodustumise sagedus oluliselt madalam kui varasemate embrüotega tehtud katsetes. Samal ajal ei ole 13,5-päevase gestatsioonieaga hiireembrüote sugunäärmetest pärinevad primaarsed sugurakud üldse võimelised liinideks transformeeruma.

Esimesed stabiilsed pluripotentsete inimese EG-rakkude liinid saadi 5-9 nädala vanuste embrüote sugunäärmetest eraldatud primaarsetest gonotsüütidest. Eraldatud rakke kultiveeriti inaktiveeritud hiire embrüonaalsete fibroblastide substraadil DMEM söötmes, millele oli lisatud looteseerumit, millele oli lisatud merkaptoetanooli, forskoliini ja rekombinantseid inimese kasvufaktoreid (FGF ja LIF). 7-12 päeva pärast ilmusid kultuuri hulkrakulised kolooniad, mis morfoloogiliste tunnuste ja molekulaarsete markerite poolest vastasid inimese EG-rakkudele. Pärast agregatsiooni moodustasid need rakud embrüokehad, mille edasise arengu käigus ilmusid kõigi kolme idukihi derivaatidele iseloomulikud spetsialiseerunud rakud. 10-20 passaaži jooksul säilitasid EG-rakuliinid normaalse karüotüübi ega kaotanud pluripotentsust.

Samuti on näidatud, et LIF-i, membraaniga seotud ja lahustuvate Steel-faktorite ning TGF-β koostoime muudab ürgsete sugurakkude arenguprogrammi. Mitootilise jagunemise lakkamise ja diferentseerumise alustamise asemel oogeneesi või spermatogeneesi suunas jätkavad ürgsed sugurakud vohamist. Pärast mitut täiendavat mitootilist tsüklit muutuvad nad epiblastirakkude sarnaseks ja kaotades sugurakkude eellasrakkude omadused, transformeeruvad pluripotentseteks embrüonaalseteks tüvirakkudeks (EG).

Nii eraldati 1998. aastal esmakordselt inimese loote lahkamiskoe suguelundite rudimendist immortaliseeritud ürgsete sugurakkude liinid. Inimese embrüogeneesis ilmuvad ürgsed sugurakud munakotti 3. arengunädalal ja 4.-5. nädalal migreeruvad need rakud suguelundite tuberkulli tsooni, kus nad moodustavad primaarsete gonotsüütide uinunud populatsioone. Mitteaktiivses olekus säilivad ürgsed sugurakud embrüos kuni sünnini. 5-9-nädalaste embrüote loote suguelundite tuberkullist eraldatakse ürgsete sugurakkude liinid, mille ekstraheeritud kude töödeldakse ex tempore kollagenaaside IV-V tüübi, hüaluronidaasi ja DNaasi seguga, et suurendada rakkude kvantitatiivset ja kvalitatiivset saagist. Loote suguelundite tuberkulli koes olevad ürgsed sugurakud on ümbritsetud stromaalsete (mesenhümaalsete) Sertoli rakkudega. Sertoli rakkude funktsionaalne eesmärk on toota antiapoptootilisi faktoreid (Fas ligand), mitogeene ja immunosupressante, mis kaitsevad sugurakke organismi immuunrünnaku eest. Lisaks mängib suguelundite tuberkuloosi stromaalne mikrokeskkond olulist rolli sugurakkude küpsemisel. Isoleeritud primaarsed sugurakud istutatakse kultuuri toitja stroomaalse kihi peale, mis koosneb esimese kolme passaaži loote fibroblastidest. Mitogeenide kõige efektiivsem kombinatsioon on kompleks, mis koosneb LIF-ist, FGF-ist ja forskoliinist (cAMP moodustumise stimulaator). Primaarsete sugurakkude proliferatsioon in vitro nõuab looteseerumi lisamist, mille juuresolekul kaasneb primaarsete gonotsüütide paljunemisega kultuuris substraadile mittekinnitatud sfääriliste rakkude kloonide moodustumine.

USA Riiklikes Tervishoiuinstituutides (National Institutes of Health) tehti blastotsüstidest inimese ESC-liinide eraldamise meetodite olemasolevate andmete kokkuvõtte põhjal esialgne järeldus, et ESC-de edukas eraldamine on kõige tõenäolisem hästi moodustunud sisemise rakumassiga blastotsüstide kultiveerimisel (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Sellest vaatenurgast on liinide loomiseks optimaalseks ESC-de allikaks inimese blastotsüstid arengu 5. päeval, millelt tuleks sisemise rakumassi eraldamisel trofektoderm ettevaatlikult eemaldada. Isoleeritud sisemist rakumassi, mis selles staadiumis koosneb 30–35 rakust, tuleks kultiveerida embrüonaalsete hiire fibroblastide substraadil, mis on kultuuris ESC-kolooniate moodustumise otsustav tingimus.

Embrüonaalsete tüvirakkude fenotüüpiliste tunnuste analüüs

Eriti huvitav on ESC-de fenotüüpiliste tunnuste liikidevaheline võrdlev analüüs. Leiti, et inimese ESC-de kolooniad on tihedad lamedate, epiteelilaadsete rakkude klastrid, samas kui hiire embrüokehad koosnevad ümarate rakkude lahtisest konglomeraadist. Inimese ESC-del on tuuma-plasma suhte indeks madalam kui hiire ESC-del. Ahvide embrüonaalsed tüvirakud moodustavad lamedamaid rakkude kolooniaid, millel on ebaühtlased servad. Üksikud rakud on primaatide ESC-de varajastes kloonides kergesti nähtavad. Kõigi uuritud loomaliikide prolifereeruvad ESC-d ei ekspresseeri MHC I ja II klassi molekule. Samal ajal annavad inimese ESC-d positiivse reaktsiooni TERA 1-60 ja GCTM-2 antikehadele, mis näitab keratiini/kondroitiinsulfaadi proteoglükaanide olemasolu nende pinnal, mis on iseloomulik embrüo-(terato)kartsinoomi tüvirakkudele. Oct4 geeni ekspressioon kõigi loomaliikide ESC-des viitab sellele, et vaatamata fenotüüpilistele erinevustele on inimese ja hiire ESC-des ilmselt aktiveeritud sama geenide komplekt, mis vastutab pluripotentsuse säilitamise eest (Peru, 2001). Lisaks on roti, sea, küüliku, primaadi ja veise embrüotest eraldatud ESC liinidel sarnased morfoloogilised omadused, sarnane molekulaarsete identifitseerimismarkerite komplekt ja peaaegu identne molekulaarne mehhanism embrüogeneesi programmide rakendamiseks, mis võimaldab meil ksenotransplantatsiooni probleemi uue pilguga vaadata.

Erinevalt normaalsest embrüogeneesist in vivo ei kaasne ESC-de proliferatsiooniga in vitro idukihtide moodustumine ja see toimub homeootiliste Hoxgeenide blokeerimise taustal, st ilma organogeneesita. Kuna segmenteerimisgeenid ei funktsioneeri, on ESC-kultuuris võimatu reprodutseerida selliseid embrüogeneesi perioode nagu somiitide munemine, embrüo segmenteerumine, munakollase, allantoisi ja teiste ajutiste organite ja kudede moodustumine. Kultiveeritud ESC-d näivad olevat külmunud spetsialiseerunud rakkude 350 restriktsiooniliini moodustumise protsessi alguses. Seega esindavad tütarprogenitsioonrakkude kloon ja tsentraalselt lokaliseeritud ESC vaid embrüo mudelit, mille arengu käigus moodustuvad samaaegselt erinevates koepiirkondades erinevad spetsialiseerunud rakkude liinid, mis aga pärinevad ühistest eellasrakkudest. Vaatamata minimaalsele retseptorite tasemele ESC-de pinnal säilitavad nad võime läbi viia primitiivseid morfogeneetilisi protsesse, imiteerides varajase embrüo mahulisi struktuure: ESC-de suspensioon kultuuriagregaatides moodustab blastotsüste või isegi hilisemaid embrüoid (munasilindrid) meenutavaid struktuure. Selliseid suspensiooniagregaate nimetatakse vastavalt lihtsateks ja keerukateks embrüokehadeks.

Segatüüpi diferentseerumisel ekspresseeritakse ühe embrüokeha erinevates rakkudes samaaegselt ektodermi (oct3, fgf-5, nodal), endodermi (gata-4), mesodermi (brachyury), kardiogeense mesodermi (pkh-2.5), neuraaltoru (msx3) ja vereloome (elkf) varaseid geene. Kasutades erinevaid kasvufaktorite ja tsütokiinide kombinatsioone sihipäraseks toimeks sugukihi rakkude moodustumisele in vitro, oli mitmetel juhtudel võimalik saada embrüokehi, milles eelistatult ekspresseeriti ektodermi või mesodermi geene, mis avab tee gastrulatsiooni ja organogeneesi algfaaside modelleerimiseks.

ESC-de klonaalne kasv on tõend asümmeetrilisest rakkude jagunemisest, kus ainult üks ESC klooni keskel säilitab piiramatu proliferatsioonipotentsiaali, samas kui teine tütarrakk genereerib eellasrakkude põlvkonna, mis juba diferentseeruvad. Seetõttu on klooni proliferatsioonikiirus embrüokeha perifeerias kõrgem kui keskel. Kasvava klooni marginaalsed rakud läbivad spontaanselt korrastamata diferentseerumise, migreeruvad või surevad apoptootiliste mehhanismide kaudu. Need sündmused määravad klooni saatuse: kui proliferatsioonikiirus ületab migratsiooni ja apoptootilise rakusurma kiirust, jätkab klooni suuruse suurenemist, stabiliseerumine toimub siis, kui apoptoosi kiirus ja uute rakkude moodustumise kiirus on võrdsed, ja regressioon toimub siis, kui nende protsesside suhe on pöördvõrdeline. Eellasrakud jagunevad sümmeetriliselt, st mõlemad tütarrakud diferentseeruvad seejärel küpseteks spetsialiseerunud rakuliinideks. ESC-de ja eellasrakkude suhe varieerub, kuid ESC-de arv on alati vaid murdosa protsendist eellasrakkude populatsioonist. Seetõttu saab ainult hoolikas pipeteerimine ja kloonide õigeaegne disagregatsioon suurendada ESC-de arvu kultuuris. ESC-de maksimaalse saagise saamiseks osutus kõige efektiivsemaks kloonide desagregatsioon 10-12 raku staadiumis. Embrüokeha rakkude diferentseerumise suund ja aste sõltuvad nende asukohast. Embrüokeha välimised rakud ei ekspresseeri oct4 geeni ja diferentseeruvad primaarse endodermi rakkudeks, millest seejärel moodustuvad parietaalse ja vistseraalse ekstraembrüoonse endodermi epiteelilaadsed rakud. Embrüokeha sisemised rakud ekspresseerivad oct4 geeni ja säilitavad pluripotentsuse 48-tunnise kultiveerimise jooksul. Seejärel struktureeritakse kultuur aga morfoloogiliselt ümber epiteeli monokihiks ja algab primaarse ektodermi arengut kontrollivate geenide ekspressioon. Seejärel algab täieliku korrastamata tsütodiferentseerumise protsess, mille käigus ilmuvad erinevat tüüpi rakud, mis on kõigi kolme idukihi derivaadid. Embrüokeha rakkude spontaanse diferentseerumise protsessis ilmuvad esimesena agregaadid endodermi markeritega munakollase fragmentide (tsüstide) kujul. Seejärel ilmuvad nendesse struktuuridesse kasvavate kapillaaride angioblastid ja endoteelirakud. Spontaanse diferentseerumise lõppstaadiumis arenevad embrüokeha sisemistest rakkudest mitmesugused terminaalselt diferentseerunud rakud, sealhulgas neuronid, gliaalelemendid, kardiomüotsüüdid, makrofaagid ja erütrotsüüdid. Teatud määral (võttes arvesse germinaalkoe kihtide moodustumise ruumilist inversiooni) on embrüokehade abil võimalik uurida morfogeneetilisi protsesse in vitro ja analüüsida embrüonaalse tsütodiferentseerumise algperioodide molekulaarseid mehhanisme.samuti kindlaks teha konkreetsete geenide roll nende protsesside rakendamisel.

Seega on klooni sees rakke, milles on avastatud erinevad geneetilise arengu programmid - ESC-d, varased eellasrakud ja diferentseeruvad eellaspopulatsioonid. ESC-de kultiveerimine rippuva tilga või masskultuuri meetodil ilma toitjakihita ja LIF-i lisamata keskkonda viib paratamatult embrüokehade moodustumiseni. Embrüokehade välis- ja sisekihi rakkude morfoloogia on erinev. Välimine kiht koosneb suurtest hargnenud rakkudest. Nende keskkonnapoolne pind on kaetud arvukate mikrovillidega. Rakkude välimine kiht on sisemisest kihist eraldatud Reicherti membraani meenutava basaalmembraaniga, samas kui embrüokehade sisemise kihi rakud on sammasepiteel. Morfoloogiliselt sarnaneb sisemine kiht, kuigi see sisaldab palju jagunevaid rakke, rohkem diferentseerumata ESC-de kolooniatega.

Inimese embrüonaalsete tüvirakkude omadused

Parenhümatoos-mesenhümaalsete signaaliülekannete puudumine homöoosi geeni blokeerimise taustal viib ESC-de korrapäratu kasvuni kultuuris, kuna see häirib ajutiste organite infrastruktuuri moodustumist ja arengut. ESC-de korrapäratu kasv ja korrapäratu spontaanne diferentseerumine kultuuris on tingitud tulevaste organite stromaalse raamistiku mesenhümaalse märgistuse puudumisest: in vitro on täiesti võimalik moodustada miljoneid hepatotsüüte, kuid on võimatu saada ühte maksa lobule'it, mis sisaldab selliseid struktuurilisi ja funktsionaalseid elemente nagu siinused, Disse'i ruumid ja Kupfferi rakud.

Arvatakse, et ESC-de pluripotentsus realiseerub ainult embrüogeneesis embrüo kudede ja organite moodustumisega, samas kui platsenta ja nabanöör on trofoblasti derivaadid. Trofektodermaalmembraani sisse suletud ESC-d genereerivad järjestikku ajutise raku kloone, mis viivad ellu arenguprogrammi Nohtejovi volumetrilise topograafilise maatriksi kombinatoorse mRNA kaudu, mis määravad ette ruumilise paigutuse, kuju ja suuruse, ajutise ja lõpliku organi rakkude arvu, samuti parenhüümi kokkupaneku struktuuri- ja funktsionaalseteks üksusteks. Samal ajal jäävad ESC-d ainsaks rakutüübiks, mille potentsiaali rakendamise molekulaarne mehhanism on geneetilisest arenguprogrammist täielikult lahti ühendatud ja ESC-del endil puudub võime teiste rakkudega suhelda nii retseptorite tajumise kui ka transsignalisatsioonisüsteemide blokeerimise tõttu. ESC-de piisav aktiveerimine viib aga embrüogeneesi programmi järkjärgulise arendamiseni, mis lõpeb täielikult moodustunud organismi sünniga, mis koosneb miljarditest rakkudest ja on valmis emakaväliseks eluks. Sellel lühiajalisel, kuid kujuteldamatult pikaajalisel teel rakulises ruumis tekivad paratamatult vead nii molekulaarsetes mehhanismides, mis tagavad rakkude elutähtsa aktiivsuse, kui ka programmides, mis kontrollivad nende proliferatsiooni, diferentseerumist ja spetsialiseerumist. Seetõttu käsitletakse tänapäevases farmakogenoomikas molekulaarstruktuuri haigusi ja rakkude programmeerimise haigusi eraldi. Lisaks on enamiku uute ravimite toime suunatud diferentseerumise, proliferatsiooni ja organogeneesi programmide korrigeerimisele, samuti organite ja kudede regenereerimisele. Täiskasvanud organismis võimaldavad ESC-d kontrollida ajju, maksa, põrna, luuüdisse ja teistesse inimorganitesse siirdatud tüvi-/progenitorrakkude käitumist, et taastada retsipientide organite kahjustatud parenhüüm, diferentseerides ja spetsialiseerudes doonorrakkudele säilinud mesenhümaalsel maatriksil. Sisuliselt hakkab totipotentsusprogramm realiseeruma munaraku, sügoodi ja blastomeeri genoomide tasandil; neid rakke pole aga veel kloonitud ja passaažitud katse- ja praktilise meditsiini vajadusteks vajalikus koguses. Seetõttu jäävad ESC-d ainulaadseks geneetilise teabe allikaks, mis sisaldab koode embrüo kolmemõõtmelise kaardi jaoks ja koode spetsialiseerunud rakuliinide lineaarseks piiramiseks gastrulatsiooni ajal.

ESC-de praktiliselt piiramatu regeneratiivne potentsiaal tuleneb asjaolust, et nende genoom, erinevalt diferentseerunud somaatiliste rakkude geneetilisest aparaadist, säilitab pluripotentsuse. Üks ESC-desse kinnistunud geneetilise teabe uinunud seisundi ilminguid on nn minimaalne fenotüüp - ESC-de pinnal ekspresseeritakse piiratud arv retseptoreid ja vastavalt sellele rakendatakse raku tuumaaparaadi ja mikrokeskkonna interaktsiooniks väga vähe transsignaaliülekande programme. Spetsialiseeritud rakuliinide piiramise ja rakkude diferentseerumise eest vastutavate geenide talveune taustal aktiveeritakse 500 geenist vaid umbes 30, mille produktid tagavad raku ühenduse ümbritseva mikrokeskkonnaga. Geeniekspressiooni seeriaanalüüsi meetodi abil näidati, et somaatiliste rakkude ja ESC-de energeetikat ja ainevahetust reguleerivate genoomi peamiste funktsionaalsete kastide ühise töö korral on viimastel retseptorite, G-valkude, sekundaarsete virgatsainete, transkriptaaside, ekspressiooni- ja repressioonikofaktorite mRNA tase, st kogu regulatiivse signaali transmembraanse ülekande süsteem rakule, väga madal. See on tingitud transsignaliseerivate geenide puudumisest või väga madalast ekspressioonist. ESC genoomis indutseeritud diferentseerumise perioodil lakkavad 18 funktsioneerivat geeni sünkroonselt töötamast 61 transsignaliseeriva geeni aktiveerimise taustal, mis kontrollivad raku adhesiooniretseptorite, rakuvälise maatriksi komponentide, restriktsioonitranskriptaaside ja signaaliülekandesüsteemi messenger-elementide sünteesi rakuplasmamembraani retseptoritelt tuumaaparaadile. Samal ajal blokeeritakse summutivalkude sünteesi eest vastutavate geenide ekspressioon, samuti geeniekspressiooni kaasinhibiitorite ekspressioon, mis tagavad ESC genoomi totipotentsuse.

Geenimarkerid on leitud kõigi kolme idukihi rakkude jaoks. Ektodermaalse rakukihi identifitseerimine toimub nodaalse, oct3 ja fgf-5 geenide ekspressiooni järgi, mesodermi rakkude identifitseerimine brahhüuria, dzeeta-globiini geenide järgi ning endodermi identifitseerimine gata-4 geeni ekspressiooni järgi. Normaalse embrüogeneesi ajal gastrulatsiooniperioodil täheldatakse tüvi- ja eellasrakkude ebaküpsete populatsioonide aktiivset migratsiooni, mis märgistab lokaalselt kolju näoluude, aju mõnede osade, perifeerse närvisüsteemi, südamejuhtivussüsteemi ja tüümuse arengutsoone, mille koed moodustuvad migreeruvate rakkude kloonidest. Rakkude märgistamine idukihtide varajaste geenide järgi hõlbustab eellasrakkude migratsiooniprotsesside topograafilist analüüsi arenevas embrüos. Eelkõige on kindlaks tehtud, et P19 embrüokartsinoomirakkude agregaatides algab esimese mesodermi geeni brachyury ekspressioon koeplasminogeeni aktivaatori, a-fetoproteiini, keratiin 8 ja keratiin 19 geenide vähenenud ekspressiooni perioodil, mis on esimese migreeruva mesodermi populatsiooni markerid. Järelikult algab mesodermaalse päritoluga kudede moodustumine alles pärast punktmigratsiooni ja mesodermaalsete eellasrakkude hajumise protsessi lõppemist.

Vaatamata äärmiselt piiratud fenotüübilistele tunnustele ja enamiku transsignaaliülekande ühikute puudumisele ekspresseerivad ESC-d siiski mõningaid retseptormolekule, mida saab kasutada nende identifitseerimiseks. On tähelepanuväärne, et ESC markerantigeenid osutusid inimestel ja primaatidel tavaliseks. Kõige sagedamini kasutatakse ESC-de märgistamiseks membraaniga seotud antigeenide SSEA-3, SSEA-4 (unikaalsed lipiidantigeenid, mis esindavad glükolipiidi GL7 ja siaalhappe kompleksi) vastaseid märgistatud antikehi, samuti kõrgpolümeerseid glükoproteiine TRA-1-81, TRA-1-60. Lisaks ekspresseerivad ESC-d spetsiifilist embrüonaalset antigeeni SSEA-1 ja endogeenset aluselist fosfataasi, samuti spetsiifilist transkriptsioonifaktorit Oct4. Viimane on vajalik ESC-de proliferatsiooni mehhanismide säilitamiseks - spetsiifiline transkriptsioonifaktor Oct4 aktiveerib fibroblastide kasvufaktori 4 geeni ekspressiooni ja stabiliseerib geenide kasti ekspressiooni, mis vastutab piiramatu DNA replikatsiooni eest ebaküpsetes rakkudes. Kõige olulisemad rakusisesed markervalgud on Oct3, Oct4, Tcf ja Groucho, mis on seotud kromatiini summutivalkudega.

Peaaegu kohe pärast aastaid kestnud katseid kultiveerida ESC-sid väljaspool keha osutus edukaks ning saadi esimesed hiire blastotsüstidest eraldatud tüvirakkude kultuurid ja primaarsete sugurakkude kultuurid, algas ESC-de pluripotentse potentsiaali uurimise etapp, kui need viidi embrüotesse arengu algstaadiumis. Näidati, et moorula ja blastotsüsti staadiumis on ESC-d võimelised moodustama kimäärseid embrüoid, milles doonor-ESC-de järeltulijaid tuvastatakse kõigis somaatilistes kudedes ja isegi sugurakkudes. Seega loodi arengubioloogias ESC-de abil "sild" in vivo ja in vitro eksperimentaalsete uuringute vahel, mis laiendas oluliselt primaarsete kudede ja organite moodustumise protsesside, nende diferentseerumise ja embrüonaalse organogeneesi uurimise võimalusi.

On selgelt kindlaks tehtud, et embrüogeneesi käigus integreeruvad ESC-d in vivo varajase embrüo rakumassi ning nende derivaate leidub kõigis organites ja kudedes. ESC-d koloniseerivad kimäärses embrüos sugurakkude liini, mille järglased moodustavad täisväärtuslikke munarakke ja seemnerakke. Embrüonaalsed tüvirakud on klonogeensed – üks ESC on võimeline looma geneetiliselt identse rakkude koloonia, millel on molekulaarsed markerid, mille hulka kuuluvad oct4 geeni ja aluselise fosfataasi ekspressioon, kõrge telomeraasi aktiivsus ja teatud embrüonaalsete antigeenide ekspressioon.

ESC-de abil embrüogeneesi mehhanismide uurimiseks on välja töötatud moorula kimäriseerimise meetod, mille käigus luuakse bioloogiline konstruktsioon, mille välisküljel on retsipienttetraploidsete blastomeeride kiht ja sisse viiakse doonor-ESC-d. Seega moodustub trofoblast retsipienttetraploidsete blastomeeride järeltulijatest, mis tagab implantatsiooni ja platsentatsiooni, ning doonor-ESC-d toimivad sisemise rakumassina, millest moodustuvad elujõulise embrüo keha ja primaarsete eellassugurakkude liin. ESC-de uurimisväärtus seisneb mitte ainult selles, et pluripotentsus säilib nende genoomi in vitro manipulatsioonide ajal, vaid ka selles, et säilib ESC-de võime osaleda kimäärse embrüo primaarsete sugurakkude moodustumisel. On näidatud, et vaid ühe geneetiliselt muundatud ESC järeltulijad asustavad kõik kimäärse embrüo primaarsed rudimendid ja arenevad koed, mis on saadud selle raku agregeerimisel või kaaskultiveerimisel 8-rakulise embrüoga. Kui rohelise fluorestseeruva valgu geeniga transfekteeritud ESC-d siirdati hiirte moorulasse, leiti selle raku fluorestseeruvaid järglasi areneva embrüo kõigis uuritud kudedes (Shimada, 1999). ESC-de siirdamine moorulasse võimaldab luua elujõulisi hiiri, kelle organism koosneb ainult doonor-ESC järeltulijatest, mis avab väljavaateid mitmesugustele terapeutilise kloonimise võimalustele. Seda metodoloogilist lähenemist kasutatakse nüüd edukalt arengubioloogia probleemide uurimisel, eelkõige X-kromosoomi geneetilise inaktiveerimise või ESC-de epigeneetilise ebastabiilsuse mehhanismide analüüsimiseks. ESC-de siirdamist varajasesse embrüosse kasutatakse ka põllumajanduslikus biotehnoloogias ja geeniteraapia katsetes.

Geneetiliselt muundatud ESC-de siirdamist kasutatakse mutantsete geenide sihtrakkude testimiseks. Biotehnoloogias kasutatakse in vitro kultiveeritud ESC-sid knockout-hiirte loomiseks. Selleks eemaldatakse ESC-dest uuritav geen homoloogse rekombinatsiooni (knockout) teel ja selle geenita rakud isoleeritakse selektiivsel söötmel. Seejärel viiakse knockout-ESC-d blastotsüsti või agregeeritakse moorula blastomeeridega. Sel viisil saadud kimäärsed varajased embrüod siirdatakse retsipient-emastele ja vastsündinud hiirte hulgast valitakse välja isendid, kelle sugurakud on antud geeni suhtes nullsügootsed. Seda tehnoloogiat on kasutatud paljude knockout-hiirte liinide loomiseks, mida kasutatakse laialdaselt eksperimentaalbioloogias ja eksperimentaalmeditsiinis. Selliseid bioloogilisi mudeleid kasutatakse teatud geenide olulisuse uurimiseks embrüonaalses arengus, samuti nende rolli uurimiseks inimeste haiguste ja patoloogiliste seisundite mehhanismides. Lisaks kasutatakse knockout-loomaliine uute geeniteraapia meetodite prekliinilistes testides. Näiteks mutantse geeni normaalse alleeli transfekteerimisega ESC genoomi on võimalik tõhusalt korrigeerida hematopoeetilist süsteemi mõjutavat mutatsiooni. Võõrgeenide viimine ESC-desse võimaldab kiiresti luua homosügootsete transgeensete laboriloomade liine. Siiski tuleb märkida, et sihipärase rekombinatsioonigeeni deletsiooni tehnikat on seni usaldusväärselt välja töötatud ainult hiire ESC-de puhul. Kasutades topeltväljalülitusega hiire ESC-sid, tehti kindlaks geeniklastri piirkonna 7. kromosoomis (inimese 19. kromosoomi genoomse piirkonna koopia) ja 11. kromosoomi proksimaalse piirkonna (inimese 5g kromosoomi koopia) funktsionaalne roll – nende geenide deletsioon hiire ESC-des võimaldas hinnata nende analoogide funktsiooni inimestel.

Inimese embrüogeneesi geenide funktsiooni uurimise võimalused on laienenud, mille transfektsioon laboriloomade ESC-de genoomi on võimaldanud eelkõige selgitada krüptogeeni rolli kardiogeense mesodermi, pax-6 geeni, moodustumisel ja arengul silma embrüogeneesis. Koostatakse esimesi geeniekspressiooni kaarte teratokartsinoomi ja hiirte blastotsüstide ebaküpsetes prolifereeruvates ESC-des ning on kinnitust leidnud transsignaliseerivate geenide supresseeriv repressioon ESC-des. 60-80 mutantse ESC ja 20-30 normaalsete preimplantatsiooni hiireembrüote raku kombinatsioon viib kimäärsete embrüote arenguni, milles elundi alged koosnevad doonor- ja retsipientrakkudest, mis võimaldab selgitada tundmatute geenide rolli gastrulatsioonis ja organogeneesis. Arenevate hiireembrüote geenide funktsionaalset kaarti täiendati teabega sf-1 geeni rolli kohta neerupealise ja sugunäärmete moodustumisel, wt-1 geeni rolli kohta neeru moodustumisel, myoD perekonna geenide rolli kohta skeletilihaste moodustumisel ning gata-1-4 perekonna geenide rolli kohta erütropoeesi ja lümfopoeesi rudimentide restriktsiooniküpsemisel.

ESC-des olevate ema- ja isapoolsete geenide alleelide suunatud väljalülitamine vektorrekombinaaside abil võimaldas selgitada erinevate geenide funktsioone embrüogeneesi varases perioodis ning tundmatute inimese geenide suunatud ülekande tehnoloogia hiire ESC-desse aitab kaasa uute mutantgeenide avastamisele, mis vastutavad raske päriliku patoloogia tekke eest. Väljalülitusmeetodi abil määrati mõnede geenide kohustuslik tähtsus embrüonaalsete kudede moodustumisel: gata-4 - müokardi jaoks, gata-1 - hematopoeetiliste kudede erütroidse liini jaoks, myoD - skeletilihaste jaoks, brachyury - mesodermi jaoks, restriktsioonitranskriptaasid hnf3 ja hnf4 - maksa tüvirakkude jaoks, rag-2 - T- ja B-lümfotsüütide kloonide moodustumiseks (Repin, 2001). Geenide kahekordne deletsioon ESC-des on avanud juurdepääsu idukihi geenide funktsionaalse rolli, segmentatsiooni ja homöoosi uurimisele ning ESC siirdamine on võimaldanud saada elujõulisi liikidevahelisi hübriidseid embrüoid. Kasutades täiustatud tehnikat ühe doonori ESC siirdamiseks 8-rakulisele embrüole, on tõestatud kimäriseerumise fakt retsipientembrüo paljude organite rakulisel tasemel. Tuleb märkida, et pärast inimese hematopoeetiliste tüvirakkude viimist blastotsüsti on retsipientide hiirte organitest leitud inimkoe rakkude idusid. On kindlaks tehtud, et pluripotentsed ESC-d ringlevad hiire embrüote veres organite moodustumise perioodil. On võimalik, et nende bioloogiline funktsioon seisneb tulevase immuunsüsteemi embrüonaalses organiseerimises. ESC-de abil on laboritingimustes reprodutseeritud adekvaatseid inimese geneetilise patoloogia mudeleid: hiirtel düstrofiini geeni topeltväljalülitamine Duchenne'i lihasdüstroofia mudelite puhul ja atm geeni (kromatiini signaalkinaasi sünteesi kontroll) seiskamine - ataksia-telangektaasia. Selle laste surmaga lõppeva päriliku haiguse korral areneb väikeajus Purkinje rakkude degeneratsioon DNA reparatsiooni defektide tõttu, millega kaasneb tüümuse involutsioon prolifereeruvate rakkude surma tõttu. Kimäärsetel hiirtel esineva ataksia-telangektaasia kliiniline pilt, patofüsioloogia ja patomorfoloogia, mis on reprodutseeritud patoloogilise geneetilise teabe sisestamise teel ESC-desse, vastavad inimeste omadele. Lisaks ataksia-telangektaasiale on ESC-de ja knockout-hiirte abil välja töötatud eksperimentaalsed mudelid mõnede pärilike homosügootsete inimese haiguste kohta, mis on seotud süsivesikute ja lipiidide metabolismi patoloogia, aminohapete katabolismi ning vase ja bilirubiini eritumisega, mis on oluliselt laiendanud eksperimentaalse meditsiini võimalusi vastavate inimeste haiguste ravimise uute meetodite prekliinilise testimise etapis.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Tüvirakkude tsütohübriidide kasutamine

ESC-de ja somaatiliste rakkude ühendamisel saadud hübriidrakud on piisav ja paljutõotav mudel tüvirakkude pluripotentsuse uurimiseks ja diferentseerunud rakkude kromosoomide ümberprogrammeerimiseks. ESC-de ja täiskasvanud looma diferentseerunud rakkude ühendamisel saadud tsütohübriidid võimaldavad uurida erinevas "vanuses" genoomide vahelisi seoseid: ainulaadne olukord tekib siis, kui erinevas diferentseerumisjärgus ja erineva küpsusastmega rakkudest pärinevad homoloogsed kromosoomid asuvad samas tuumas, kus nad saavad hõlpsalt vahetada trans-toimelisi regulatiivseid signaale. On raske ennustada, kuidas individuaalse arengu käigus moodustunud homoloogsete kromosoomide cisregulatoorsed epigeneetilised süsteemid reageerivad embrüonaalselt seotud genoomidest lähtuvate trans-toimeliste signaalide mõjule. Lisaks toimub hübriidrakkudes vanemkromosoomide segregatsioon, mis võimaldab uurida genoomide interaktsiooni üksikute kromosoomide tasandil, st potentsiaalselt tuvastada konkreetsete kromosoomide osalemist pluripotentsuse säilitamisel või vastupidi, diferentseerumisele jõudmisel.

Pluripotentsete teratokartsinoomi ja diferentseerunud somaatiliste rakkude ühendamisel saadud tsütohübriide kasutati esimese eksperimentaalse mudelina erineva "arengulooga" genoomide interaktsiooni uurimiseks. Mõnel juhul säilitasid sellised hübriidrakud pluripotentsed omadused üsna kõrgel tasemel. Eelkõige indutseerisid teratokartsinoomi-somaatilised hübriidrakud in vivo tõeliste teratoomide arengut, mis sisaldasid kõigi kolme idukihi derivaate, ja in vitro suspensioonkultuurides moodustasid nad embrüokehasid. Isegi seda tüüpi liikidevahelistes tsütohübriidides täheldati embrüonaalsete antigeenide olemasolu juhtudel, kus teratokartsinoomirakkudega ühinemise somaatilisteks partneriteks olid lümfotsüüdid või tümotsüüdid. On tähelepanuväärne, et teratokartsinoomirakkude ja fibroblastide ühendamisel loodud tsütohübriidid vastasid fenotüübilt fibroblastidele.

Kõige olulisem kindlaks tehtud fakt on see, et teratokartsinoomi-somaatilised hübriidrakud näitasid diferentseerunud raku genoomi ümberprogrammeerimise märke, mida iseloomustas kas üksikute geenide või somaatiliste partnerite inaktiivse X-kromosoomi taasaktiveerimine. Seega näitavad teratokartsinoomi-somaatilise rakutüübi tsütohübriidide uuringute tulemused, et hübriidrakkudes säilib sageli pluripotentsus ja esineb somaatiliste partnerite genoomi ümberprogrammeerimise märke.

Hiire embrüonaalsete tüvirakkude (ESC) ja täiskasvanud põrnarakkude liitmise teel liikisiseste embrüonaalsete hübriidrakkude saamise katsetes uuriti selliste tsütohübriidide omadusi, analüüsiti vanemate kromosoomide segregatsiooni ja hinnati hübriidgenoomi pluripotentsust. Teratokartsinoomirakkude ja somaatiliste rakkude liitmisel saadud liikisiseste hübriidrakkude puhul on tavaliselt iseloomulik madal kromosoomide segregatsiooni tase tetraploidse või peaaegu tetraploidse karüotüübiga. Sarnast kromosomaalset koostist täheldati tsütohübriididel primaarsete sugurakkude ja lümfotsüütide liitmisel. Samal ajal näitasid hiire teratokartsinoomirakkude ja naaritsa lümfotsüütide liitmisel saadud liikidevahelised hübriidrakud somaatiliste partnerite kromosoomide intensiivset segregatsiooni.

Kvalitatiivselt uus etapp vanemkromosoomide segregatsiooni uurimisel liikidesiseste hübriidide puhul algas pärast mikrosatelliitide analüüsimise meetodi väljatöötamist polümeraasi ahelreaktsiooni abil, tänu millele leiti iga hiire kromosoomi kohta mitu sada markerit, mis võimaldas hübriidrakkudes usaldusväärselt eristada mis tahes homoloogsete kromosoomide paari.

ESC-de (hüpoksantiinfosforibosüültransferaasi aktiivsuse puudulikkusega HM-1 rakud, 2n = 40, XY, eraldatud 129/01a hiirte blastotsüstidest) ühendamisel kongeensete DD/c hiirte splenotsüütidega oli võimalik saada hübriidkloonide komplekt, mis oli morfoloogiliselt sarnane ESC-dega. Kõik kloonid eraldati selektiivsel söötmel, milles saavad kasvada ainult aktiivse hüpoksantiinfosforibosüültransferaasiga rakud. Elektroforeetiline analüüs näitas, et kõigil kloonidel oli DD/c hiirtele iseloomulik hüpoksantiinfosforibosüültransferaasi alleelne variant. Tsütogeneetiline analüüs näitas, et kolmel neljast hübriidkloonist oli peaaegu diploidne kromosoomide komplekt. Üks peaaegu tetraploidne kloon sisaldas kahte hübriidrakkude populatsiooni, millest üks oli tetraploidne ja teine, väiksem, oli diploidne.

Mikrosatelliidi analüüs, mis võimaldab eristada hiirte 129/01a ja DD/c mis tahes homoloogsete kromosoomide paari peaaegu diploidse komplektiga hübriidkloonides, näitas, et kahes kloonis oli somaatiliste partnerite autosoomide selge eelistuslik eliminatsioon. Enamikul kloonide HESS2 ja HESS3 autosoomidel olid 129/01a liini, st pluripotentse partneri markerid. Erandiks olid 1. ja 1. kromosoom: kloonides HESS2 ja HESS3 esinesid koos HM-1 rakkude markeritega väikestes kogustes ka somaatilise partneri markerid. Sellised tulemused võivad peegeldada somaatilise partneri 1. ja 1. kromosoomi mittetäielikku segregatsiooni ning on kooskõlas tsütogeneetiliste andmetega, et nende kromosoomide trisoomiat täheldatakse 30–40%-l kloonide HESS2 ja HESS3 rakkudest. Kloon HESS4 erines oluliselt oma kromosomaalse koostise poolest: paljud selle klooni autosoomid pärinesid ESC genoomist (kromosoomid 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 ja 17), kuid kromosoome 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 ja 19 esindasid mõlema vanema homoloogid. Neid homoloogseid kromosoome tähistavate mikrosatelliitide kvantitatiivne suhe oli ligikaudu 1:1. See võimaldas autoritel eeldada, et üks homoloog pärines ESC genoomist ja teine diferentseerunud rakkudest. Mõnes klooni HESS4 alamkloonis olid olemas ainult somaatilise partneri 18. ja 19. kromosoomi markerid. Saadud tulemused näitavad, et HESS4 klooni rakkudes toimus lisaks somaatiliste partnerite kromosoomide segregatsioonile ka ühe või mõlema ülalmainitud pluripotentse genoomi kromosoomide homoloogide eliminatsioon, st mõlema vanema kromosoomide kahepoolne segregatsioon - väga ebatavaline nähtus, kuna ainult ühe vanema kromosoomide segregatsioon on iseloomulik tsütohübriididele.

Lisaks sisaldasid kõik hübriidrakkude kloonid pärast 20. passaaži ainult somaatiliste partnerite X-kromosoomi markereid, st kloonides oli ESC X-kromosoom asendatud somaatiliste partnerite X-kromosoomiga. Seda olulist fakti kinnitavad in situ hübridisatsiooni andmed, kasutades hiire X-kromosoomi suhtes spetsiifilist FITC-märgistatud sondi: positiivne signaal tuvastati ainult ühel kromosoomil. Tuleb märkida, et kultiveerimise varasemates etappides (enne 15. passaaži) sisaldasid paljud rakud tsütogeneetiliste andmete kohaselt kahte X-kromosoomi. Seetõttu võimaldab selektiivsete keskkondade kasutamine manipuleerida hübriidrakkude kromosomaalse koostisega ja valida ESC genoomi taustal selektiivselt kloone, mis kannavad somaatiliste partnerite üksikuid kromosoome.

Kuna tsütohübriidgenoomi ainulaadne omadus on vanemgenoomide lokaliseerumine ühes tuumas, tekib loomulikult küsimus embrüonaalse genoomi pluripotentsete omaduste säilimise kohta ESC-somaatilised rakuhübriidides selle tihedas kontaktis diferentseerunud raku genoomiga. Morfoloogiliselt olid ESC-de ja somaatiliste rakkude tsütohübriidid sarnased vanemliku ESC liiniga. Pluripotentsuse hindamine näitas, et kõik peaaegu diploidse kromosoomikomplektiga kloonid olid võimelised moodustama embrüokehi suspensioonkultuurides, milles esinesid kolme idukihi derivaadid.

Enamik hübriidrakke sisaldas ECMA-7 antigeeni, mis on varajastele hiireembrüotele iseloomulik marker, ning neil oli ka kõrge aluselise fosfataasi aktiivsus. Kõige veenvamad andmed hübriidrakkude kõrge pluripotentsuse kohta saadi katsetes, kus saadi HESS2 klooni hübriidrakke hõlmavate süstimiskimääride seeria. Biokeemiliste markerite analüüs näitas, et doonorhübriidrakkude järeltulijad esinesid enamikus kimääride kudedes. Seetõttu säilitavad ESC-de ja somaatiliste diferentseerunud rakkude ühendamisel saadud hübriidrakud kõrge pluripotentsuse, sealhulgas võime moodustada kimäärid blastotsüsti õõnsusse süstimisel.

Kloonid HESS2 ja HESS4 erinesid oluliselt vanemkromosoomide koostise poolest, kuid neil olid sarnased pluripotentsed omadused. Võiks eeldada, et pluripotentsus hübriidgenoomis avaldub domineeriva tunnusena, kuid on võimalik, et mitte kõik embrüonaalse genoomi kromosoomid ei ole pluripotentsuse säilitamise protsessis kaasatud. Kui see eeldus on õige, siis võib eeldada, et pluripotentse partneri mõnede kromosoomide elimineerimine hübriidrakkude genoomist ei kaasne nende pluripotentsuse staatuse muutumisega. Sellisel juhul võimaldaks vanemkromosoomide segregatsiooni analüüs embrüonaalsetes hübriidrakkudes meil lähemalt uurida embrüonaalsete rakkude pluripotentsuse kontrolli eest vastutavate kromosoomide identifitseerimist.

O. Serov jt (2001) ei leidnud 50 järglase hulgast, kes saadi kimääride ristamisel normaalsete hiirtega, kellel oli hiire genotüüp 129/01a ja kes kandsid DD hiirte X-kromosoomi, ühtegi järglast. Autorid usuvad, et see on tingitud hübriidrakkude pluripotentsuse vähenemisest somaatilise genoomi mõjul. Alternatiivseks seletuseks võib olla trisomia negatiivne mõju mõnedele autosoomidele ja sugukromosoomide tasakaalustamatus (XXY kromosoome täheldati rakkudes kuni 15. passaažini) hübriidrakkudes meioosi ajal. On teada, et XXY rakud ei ole võimelised meioosi läbima ja sugurakke moodustama. Trisomia võib põhjustada ka hübriidrakkude proliferatiivse aktiivsuse vähenemist, mille tulemusena võib kimääride arengu selektiivne eelis kuuluda retsipientsembrüo rakkudele. Sellest järeldub, et hübriidrakkude pluripotentse potentsiaali adekvaatseks hindamiseks on vaja saada hübriidkloonid normaalse diploidse kromosoomikomplektiga.

O. Serovi ja kaasautorite (2001) katsetes demonstreeriti esmakordselt somaatiliste rakkude X-kromosoomi ümberprogrammeerimise võimalust hübriidrakkude genoomis. Autorite see järeldus tuleneb kimäärides oleva hprt geeni (X-kromosoomi marker) ekspressiooni analüüsist: DD/c hiirte hprt alleelse variandi olemasolu tuvastati kõigis analüüsitud kimäärsetes kudedes. On kohane rõhutada, et pärast hübriidrakkude viimist blastotsüsti õõnsusse satuvad tsütohübriidid mitteselektiivsetesse tingimustesse ja X-kromosoomi säilimine hübriidrakkude genoomis tähendab, et sellest on saanud selle obligaatne komponent ja genoom ei erista seda pluripotentse partneri Y-kromosoomist.

Hübriidsete embrüonaalsete rakkude somaatiliste ja pluripotentsete genoomide interaktsiooni analüüsi tulemusi kokku võttes järeldavad autorid, et mõnedes tsütohübriidides avaldub pluripotentsus domineeriva tunnusena. Hübriidgenoom on võimeline ümber programmeerima diferentseerunud rakkude üksikuid kromosoome, mis aga ei välista somaatilise genoomi pöördmõju võimalust embrüonaalse genoomi pluripotentsusele. Hübriidrakkude kultiveerimisel toimub diferentseerumise indutseerimine oluliselt sagedamini kui ESC-de HM-1 algses vanemliinis. Sarnast efekti täheldatakse ka primaarsete kolooniate moodustumisel: paljud embrüonaalsete hübriidrakkude primaarsed kolooniad diferentseeruvad moodustumise algstaadiumis, kusjuures kloonide kadu nende selektsiooni ja paljunemise ajal on suur.

Seega säilitavad ESC-de ja somaatiliste rakkude sulandumisel loodud tsütohübriidid, hoolimata tihedast kontaktist diferentseerunud rakkude genoomiga, pluripotentsuse kui embrüonaalse genoomi ainulaadse omaduse. Lisaks on sellistes hübriidrakkudes võimalik diferentseerunud rakkudest pärinevate üksikute kromosoomide ümberprogrammeerimine. Jääb selgusetuks, mil määral säilivad hübriidrakkudes embrüonaalse genoomi pluripotentsed omadused, eriti nende võime osaleda kimääride iduliini moodustumisel. See nõuab normaalse karüotüübiga embrüonaalsete hübriidrakkude saamist. Igal juhul võivad pluripotentsed embrüonaalsed hübriidrakud saada tõeliseks geneetiliseks mudeliks pluripotentsuse säilitamises või selle kontrollimises osalevate kromosoomide tuvastamiseks, kuna vanemate kromosoomide kahepoolne segregatsioon pakub potentsiaalselt sellist võimalust.

Mitte vähem atraktiivne pole ka O. Serov jt (2001) poolt „kromosomaalseks mäluks“ defineeritud nähtuse uurimine. Hübriidgenoomis on homoloogsed kromosoomid kahes alternatiivses konfiguratsioonis: somaatilise partneri homoloogid on juba kunagi diferentseerunud, pluripotentse partneri homoloogides aga see protsess alles algab. Järelikult näitab hübriidrakkude kõrge pluripotentsuse säilitamine, et ESC homoloogide „pluripotentne“ konfiguratsioon on hübriidgenoomis piisavalt stabiilne, hoolimata somaatilisest partnerist lähtuvate transaktiivsete faktorite mõjust. Eespool kirjeldatud diferentseerunud genoomi homoloogsete kromosoomide ümberprogrammeerimise tunnused kimääride arengu ajal ei välista võimalust, et tsütohübriidide in vitro moodustumise ja kultiveerimise algstaadiumis säilitavad nad in vivo diferentseerumise käigus omandatud staatuse. Hiljuti saadud andmete kohaselt näitavad embrüonaalsete hübriidrakkude ülekandmisel mitteselektiivsesse keskkonda intensiivset ainult somaatilise partneri kromosoomide elimineerimist, st hübriidrakkude genoom eristab homolooge kergesti pärast 10–15 passaaži in vitro kultiveerimist. Seega kujutavad embrüonaalsed hübriidrakud endast paljulubavat eksperimentaalset mudelit mitte ainult embrüonaalse genoomi sellise põhilise omaduse nagu pluripotentsus, vaid ka selle alternatiivi - embrüonaalse diferentseerumise - uurimiseks.

Embrüonaalsete tüvirakkude siirdamise terapeutiline efektiivsus

Enne ESC-de ja nende derivaatide siirdamise terapeutilise efektiivsuse analüüsimist võtame kokku ülaltoodud materjali. ESC-de võimekus embrüogeneesi täielikuks rakendamiseks in vitro on ebapiisav, kuna arenguhäired tulenevad antud juhul mesenhümaalsete tüvirakkude puudumisest, mis tekivad organismis autonoomselt ja ESC-dest sõltumatult. ESC-de geneetiline potentsiaal on väiksem kui sügoodi geneetiline potentsiaal, seetõttu ei kasutata ESC-sid otseselt embrüote kloonimiseks. ESC-de ainulaadset bioloogilist potentsiaali kui ainsaid rakke, mille arendusprogrammid on täielikult ja järjepidevalt rakendatud, kasutatakse geenifunktsiooni uuringutes. ESC-de abil dekodeeritakse esimesed signaalide kombinatsioonid, mis aktiveerivad kolme idukihi arengut kodeerivate varajaste ja hiliste geenide ekspressiooni. ESC genoomi pluripotentsuse säilitamine in vitro muudab need ainulaadseks vahendiks reparatiivseks regenereerimiseks, mis on võimeline automaatselt täiendama rakkude kadusid elundite ja kudede kahjustuste korral. Ideaalses hüpoteetilises stsenaariumis võib eeldada, et „...doonori ESC-de siirdamisel kanduvad retsipiendi kehasse kompaktselt pakitud programmid, mis soodsates tingimustes realiseeruvad uue koe ehituses“7, mis on võimeline „...retsipiendi kehasse tõhusalt integreeruma nii morfoloogilisel kui ka funktsionaalsel tasandil“.

Loomulikult, pärast ESC-de monodiferentseerumise meetodite väljatöötamist, alustati ühest spetsialiseerunud kloonist in vitro saadud rakkude funktsionaalse aktiivsuse in vivo uuringuid. Prolifereeruv ESC kloon genereerib migreeruvate eellasrakkude populatsioone, mis on tõeliselt võimelised aktiivselt integreeruma retsipientkoe kahjustuse piirkondadesse, mida kasutatakse regeneratiiv-plastilises meditsiinis. On kindlaks tehtud, et DOPA neuronite siirdamine mustainesse vähendab kliinilisi ilminguid eksperimentaalse hemiparkinsonismi korral. Doonori närvisüsteemi tüvirakkude regionaalne siirdamine vähendab seljaaju ja aju trauma või põrutuse põhjustatud motoorsete häirete astet. Samuti on saadud esimesed positiivsed tulemused tüvirakkude siirdamisest demüeliniseerivate haiguste korral. Näib, et ESC-de regeneratiiv-plastiline potentsiaal avab piiramatud võimalused rakkude siirdamise kasutamiseks praktilises meditsiinis. Ektoopilistesse tsoonidesse siirdamisel muutuvad ESC-d aga paratamatult kasvajateks. Teratoomid tekivad siis, kui ESC-sid süstitakse subkutaanselt immuunpuudulikkusega hiirtele. Kui süngeensetel hiirtel siirdatakse ESC suspensioone munandi kapsli alla, moodustuvad ka teratoomid, mis koosnevad erinevatest kudedest, mille rakud on kõigi kolme idukihi derivaadid. Selliste teratoomide puhul on redutseeritud organogeneesi protsessid äärmiselt haruldased.

Mitmed uuringud annavad teavet varajaste ESC derivaatide siirdamise positiivsete tulemuste kohta eksperimentaalse patoloogiaga loomadele. ESC derivaatide abil teostatavat rakulist neurotransplantatsiooni arendatakse edasi katsetes ja esimestes kliinilistes uuringutes, et korrigeerida funktsionaalseid häireid aju- ja seljaaju vigastuste korral ning ravida süringomüeliat ja sclerosis multiplex'i (Repin, 2001). ESC-dest in vitro neurogeneesi tehnika tulekuga töötatakse embrüonaalse ajukoe asemel välja meetodeid embrüonaalsete närvikoe kultuuridest saadud neurosfääri derivaatide siirdamiseks. Sellised siirdamissuspensioonid on oluliselt homogeensemad ja sisaldavad neuronite ja neuroglia prekursoreid.

Retinoehappe regulaarsel lisamisel kultuurikeskkonda annuses 10 μg/ml 6 nädala jooksul moodustub inimese embrüo-(terato)kartsinoomi liinis NTERA-2 üle 80% postmitootilistest neuronitest. Neuronaalse populatsiooni täielik homogeensus saavutatakse immunofenotüübiliste markeritega märgistatud küpsete neuronite voolusorteerimise teel, mis võimaldab vabaneda teratokartsinoomi jäänustest ja ebaküpsetest rakkudest. Pärast siirdamist katseloomade aju erinevatesse piirkondadesse sellised neuronid mitte ainult ei ela, vaid integreeruvad ka piirkondlikesse närvivõrkudesse. Loomadel, kellel on lokaalsete KNS-i defektide eksperimentaalsed mudelid, vähendab neurotransplantatsioon selliste inimese patoloogiate kliinilisi ilminguid nagu traumaatilise ajukahjustuse, insuldi, demüeliniseerivate haiguste, väikeaju arengu pärilike defektide ning lipiidide ja polüsahhariidide ladestumise haiguste tagajärjed.

Kesknärvisüsteemi degeneratiivsete haiguste regeneratsiooniprotsesside optimeerimiseks töötatakse välja tehnoloogiaid müeliini tootvate oligodendrotsüütide saamiseks ESC-dest. Esimene etapp hõlmab traditsiooniliselt ESC-de proliferatsiooni koos siirdamiseks vajaliku rakkude arvu paljundamisega. Teises etapis viiakse läbi rakkude sihipärane diferentseerimine müeliini tootvate oligodendrotsüütide eellasrakkude populatsiooniks, mida kontrollivad selektiivsed markerantigeenid.

ESC derivaatide kasutamiseks avanuvad teatud väljavaated meetodite väljatöötamiseks, mis parandavad tüümuse küpsemise geneetilistest defektidest tingitud immuunpuudulikkust. Uuringutes knockout (rag 1) hiirtega, kellel on indutseeritud geenidefekt - TCR geenide V(D)J lookuste rekombinatsioonimehhanismi häire, mis viib T-lümfotsüütide funktsiooni kadumiseni - taastab varajaste ESC derivaatide siirdamine loomade tüümusesse rakulise immuunsuse eest vastutavate immuunkloonide normaalsete populatsioonide küpsemise. Käimas on kliinilised uuringud in vitro eelnevalt moodustunud ESC-de siirdamise kohta laste surmaga lõppevate pärilike aneemiate raviks.

Tüvirakkude siirdamise kiire kliinikusse kasutuselevõtu vastuväited põhinevad inimese embrüonaalsete tüvirakkude stabiilsete liinide piiratud arvul ja vajadusel nende standardiseerimise järele. Standardiseeritud ESC-liinide, aga ka täiskasvanud inimese tüvirakkude puhtuse suurendamiseks tehakse ettepanek kasutada liinivaliku meetodit, mis põhineb lühikeste tandem-DNA korduste molekulaargeneetilisel analüüsil. Samuti on vaja testida ESC-liine väikeste kromosomaalsete ümberkorralduste ja geneetiliste mutatsioonide suhtes, mille esinemise potentsiaal rakukultuuri tingimustes on üsna suur. Esitatakse väitekiri igat tüüpi ESC-de ja regionaalsete pluripotentsete tüvirakkude omaduste kohustusliku testimise kohta, kuna nende paljunemine in vitro võib viia uute omaduste ilmnemiseni, mis ei ole embrüonaalsetele tüvirakkudele ega definitiivsetele kudedele omased. Eelkõige eeldatakse, et pikaajaline kultiveerimine tsütokiinidega söötmetes lähendab ESC-liine kasvajarakkudele, kuna need läbivad sarnaseid muutusi rakutsükli regulatsiooni radades, omandades võime teostada piiramatul arvul rakkude jagunemisi. Mõned autorid peavad kasvaja arengu potentsiaali põhjal varajaste embrüonaalsete tüvirakkude derivaatide siirdamist inimestele hoolimatuks. Nende arvates on palju ohutum kasutada ESC-de pühendunud järglasi, st diferentseerunud rakkude eellasrakkude liine. Praegu aga pole veel välja töötatud usaldusväärset tehnikat stabiilsete, soovitud suunas diferentseeruvate inimese rakuliinide saamiseks.

Seega ilmub kirjanduses üha rohkem andmeid inimese embrüonaalsete tüvirakkude derivaatide siirdamise positiivse terapeutilise efekti kohta. Paljusid neist uuringutest aga arvustatakse ja kritiseeritakse. Mõned teadlased usuvad, et varajaste kliiniliste uuringute tulemused on esialgse iseloomuga ja näitavad vaid seda, et tüvirakud on võimelised avaldama soodsat mõju konkreetse haiguse kliinilisele kulgemisele. Seetõttu on vaja saada andmeid rakkude siirdamise kaugemate tulemuste kohta. Argumendina tuuakse välja kliinilise neurotransplantoloogia arenguetapid. Tõepoolest, alguses domineerisid kirjanduses publikatsioonid embrüonaalsete ajufragmentide siirdamise kõrge efektiivsuse kohta Parkinsoni tõve korral, kuid seejärel hakkasid ilmuma teated, mis eitasid patsientide ajju siirdatud embrüonaalse või loote närvikoe terapeutilist efektiivsust.

Esimesed kliinilised uuringud viidi läbi NTERA-2 teratokartsinoomi ESC-dest saadud neuroblastide siirdamise ohutuse hindamiseks, kusjuures ebaküpseid rakke prolifereeriti kultuuris kuni 100 miljoni rakumassi akumuleerumiseni. Osa sel viisil saadud rakkudest kasutati fenotüübi iseloomustamiseks ja rakuliste lisandite määramiseks, samuti võimaliku viiruste ja bakteritega saastumise testimiseks. LIF ja loote stroomarakkude toitekiht eemaldati kultuurikeskkonnast ning loodi tingimused ESC-de sihipäraseks diferentseerumiseks neuroblastideks, kasutades tsütokiinide ja kasvufaktorite kombinatsiooni. Seejärel puhastati neuroblastid ebaküpsetest teratokartsinoomirakkudest vooluraku sorteerijal. Pärast siirdatud rakkude sekundaarset puhastamist ja fenotüübi iseloomustamist süstiti patsientide aju basaalsesse tuuma (seitsmendal kuul pärast hemorraagilist insulti) spetsiaalse mikrokanüüli ja süstla abil stereotaksilise ja kompuutertomograafia kontrolli all neuroblastide suspensioon (10–12 miljonit). Neuronite siirdamise tagajärgede siirdamise järgne üheaastane skriining insuldi tsooni ei näidanud mingeid kõrvaltoimeid ega soovimatuid kõrvalmõjusid. Pooltel patsientidest täheldati motoorse funktsiooni paranemist perioodil 6 kuni 12 kuud pärast siirdamist. Positiivsete kliiniliste muutustega kaasnes pärast rakkude siirdamist insuldi tsooni verevarustuse suurenemine: positronemissioontomograafia andmetel ulatus fluorestsentsmärgistatud 2-deoksüglükoosi imendumise keskmine suurenemine 18%-ni ja mõnel patsiendil 35%-ni.

USA riiklikud tervishoiuinstituudid viisid siiski läbi sõltumatu uuringu neurotransplantatsiooni kliinilise efektiivsuse kohta parkinsonismiga patsientidel. Esimese rühma patsientidele siirdati dopamiini tootvaid embrüonaalse närvikoe lõike, samas kui teisele patsientide rühmale tehti näiv operatsioon. Tulemused näitavad sellise neurotransplantatsiooni kliinilist efektiivsust null, hoolimata asjaolust, et dopamiini tootvad embrüonaalsed neuronid jäid retsipientide ajus ellu. Lisaks tekkis 2 aastat pärast embrüonaalse närvikoe siirdamist 15%-l patsientidest püsiv düskineesia, mis platseeborühma patsientidel puudus (Tüvirakud: teaduslik progress ja tulevased uurimissuunad. Nat. Inst, of Health. USA). Nende patsientide haiguse edasise arengu vaatlused on käimas.

Mõned autorid seostavad neurotransplantatsiooni kliinilise efektiivsuse hindamise kohta käivaid vastuolulisi kirjandusandmeid patsientide rühmade valiku erinevate lähenemisviisidega, nende seisundi objektiivseks hindamiseks ebapiisava meetodite valikuga ja, mis kõige tähtsam, embrüonaalse närvikoe ja aju erinevate piirkondade, kust see kude saadi, erinevate siirdesuuruste ja kirurgilise sekkumise metodoloogiliste iseärasustega.

Tuleb märkida, et katsed pluripotentsete embrüonaalsete tüvirakkude otseseks siirdamiseks eksperimentaalse hemiparkinsonismiga rottide aju striatumi piirkonda kaasnesid ESC-de proliferatsiooniga ja nende diferentseerumisega dopamiinergilisteks neuroniteks. Tuleb eeldada, et äsja moodustunud neuronid integreeriti tõhusalt närvivõrkudesse, kuna pärast ESC siirdamist täheldati käitumuslike anomaaliate ja motoorse asümmeetria korrigeerimist apomorfiini testis. Samal ajal surid mõned loomad siirdatud ESC-de transformatsiooni tõttu ajukasvajateks.

USA Riikliku ja Meditsiiniakadeemia eksperdid ning USA Riikliku Tervishoiuinstituudi spetsialistid usuvad, et tüvirakkude kliiniline potentsiaal väärib kõige tõsisemat tähelepanu, kuid rõhutavad vajadust uurida üksikasjalikult nende omadusi, tüsistuste tõenäosust ja pikaajalisi tagajärgi inimhaiguste adekvaatsete bioloogiliste mudelite katsetes (Tüvirakud ja tulevane regeneratiivne meditsiin, National Academy Press.; Tüvirakud ja tulevased uurimissuunad, Nat. Inst, of Health USA).

Sellest vaatenurgast on oluline, et ESC suspensiooni munandisse siirdamise teel saadud eksperimentaalsete teratoomide võrdlev histoloogiline analüüs varase embrüo, mis samuti sisaldab ESC-d, siirdamise tulemusel moodustunud teratoomidega näitas, et ESC-d, olenemata nende päritoluallikast või interaktsioonist teatud ümbritsevate rakkudega, rakendavad oma tumorigeenset potentsiaali samal viisil. On tõestatud, et sellistel teratoomidel on klonaalne päritolu, kuna ühest ESC-st võivad tekkida kasvajad, mis koosnevad kõigi kolme idukihi derivaadist (Rega, 2001). Tähelepanuväärne on see, et kui immuunpuudulikkusega hiirtele siirdati normaalse karüotüübiga kloonitud ESC-sid, moodustusid ka teratoomid, mis koosnesid erinevat tüüpi diferentseerunud somaatilistest rakkudest. Need eksperimentaalsed andmed on laitmatuks tõendiks teratoomide klonaalse päritolu kohta. Arengubioloogia seisukohast näitavad need, et mitte mitu pühendunud eellasrakku, vaid üks pluripotentne tüvirakk toimib kõigi kolme teratoomi moodustava idukihi diferentseerunud derivaatide allikana. Praktilise rakusiirdamise teel on nende uuringute tulemused aga kui mitte keelavad, siis hoiatavad potentsiaalse ohu eest, kuna ESC-de või ürgsete sugurakkude inokuleerimine täiskasvanud immuunpuudulikkusega hiirte erinevatesse kudedesse põhjustab paratamatult siirdatud tüvirakkudest kasvajate teket. Ektoopiliselt siirdatud ESC-de neoplastilise degeneratsiooniga kaasneb diferentseerunud rakkude satelliitpopulatsioonide teke - see on tingitud ESC-de ja eellaskloonide osalisest diferentseerumisest spetsialiseeritud liinideks. Huvitav on see, et kui ESC-sid siirdatakse skeletilihastesse, moodustuvad neuronid kõige sagedamini teratokartsinoomirakkude kõrval. ESC-de viimisega jagunevasse munarakku või blastotsüsti kaasneb aga rakkude täielik integreerumine embrüosse ilma neoplastiliste elementide moodustumiseta. Sellisel juhul integreeruvad ESC-d praktiliselt kõigisse embrüo organitesse ja kudedesse, sealhulgas suguelundite algkoesse. Sellised allofeenloomad saadi esmakordselt teratokartsinoomi 129 rakkude viimisega varajastesse embrüotesse 8-100 raku staadiumis. Allofeeni hiirtel integreeruvad doonori ESC-dest pärinevad heterogeensete rakkude populatsioonid luuüdi, soole, naha, maksa ja suguelundite kudedesse, mis võimaldab katses luua isegi liikidevahelisi rakukimääre. Mida lühem on varajase embrüo arenguperiood, seda suurem on rakkude kimäristumisprotsent, kusjuures kõrgeim kimäristumisaste on täheldatud allofeeni embrüo vereloomesüsteemis, nahas, närvisüsteemis, maksas ja peensooles. Täiskasvanud organismis on kimäristumisvõimelised koed, mis on retsipientide immuunsüsteemi eest kaitstud histohemaatiliste barjääridega:Primaarsete sugurakkude siirdamine munandi parenhüümi kaasneb doonori tüvirakkude inkorporeerimisega retsipiendi germinaalkoe kihti. ESC-de siirdamisel blastotsüsti ei toimu aga suguelundite kimäärsete rudimentide moodustumist koos doonori primaarsete sugurakkude tekkega. ESC-de pluripotentsust saab spetsiaalsete tingimuste loomisel kasutada ka kloonimiseks: hiire ESC-de siirdamine 8-16-rakulisele hiire embrüole, milles tsütokalsiin blokeerib rakulisi mitoose, soodustab normaalse embrüogeneesi teostumist koos embrüo arenguga doonori ESC-dest.

Seega on allogeensete ESC-de siirdamise alternatiiviks terapeutiline kloonimine, mis põhineb somaatiliste rakkude tuumade siirdamisel enukleeeritud munarakku, et luua blastotsüst, mille sisemisest rakumassist eraldatakse seejärel somaatilise tuuma doonoriga geneetiliselt identsed ESC-de liinid. Tehniliselt on see idee üsna teostatav, kuna ESC-liinide loomise võimalust blastotsüstidest, mis on saadud pärast somaatiliste tuumade siirdamist enukleeeritud munarakku, on korduvalt tõestatud laboriloomade katsetes (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Eelkõige rag2 geeni mutatsiooni suhtes homosügootsetel hiirtel kasutati tuumade doonoritena subepidermaalsete koerakkude kultiveerimise teel saadud fibroblaste, mis siirdati enukleeeritud munarakkudesse. Pärast munaraku aktiveerimist kultiveeriti "sügooti" kuni blastotsüsti moodustumiseni, mille sisemisest rakumassist eraldati ESC-d ja kanti üle mutantse geeni (rag2~/~) suhtes nullsügootsele rakuliinile. Sellistes ESC-des korrigeeriti ühe alleelse geeni mutatsioon homoloogse rekombinatsiooni meetodil. Esimeses katseseerias saadi embrüokehad rekombinantse taastatud geeniga ESC-dest, nende rakud transfekteeriti rekombinantse retroviirusega (HoxB4i/GFP) ja pärast paljunemist süstiti need rag2~/~ hiirte veeni. Teises seerias agregeeriti tetraploidsed blastomeerid geneetiliselt muundatud ESC-dega ja siirdati retsipient-emastele. Saadud immunokompetentsed hiired olid luuüdidoonoriteks siirdamiseks rag2~/~ mutantsetele hiirtele. Mõlemas seerias oli tulemus positiivne: 3-4 nädala pärast leiti kõigil hiirtel küpseid normaalseid müeloid- ja lümfoidrakke, mis on võimelised tootma immunoglobuliine. Seega saab somaatiliste rakkude tuumade siirdamist munarakkudesse kasutada mitte ainult ESC liinide saamiseks, vaid ka tsütogenoteraapiaks - pärilike anomaaliate korrigeerimiseks, kasutades ESC-d vektorina korrigeeriva geneetilise teabe transportimiseks. Kuid sellel rakkude siirdamise suunal on lisaks bioeetilistele probleemidele ka oma piirangud. Pole selge, kui ohutu on terapeutiliselt kloonitud rakkude siirdamine, mille genotüüp on identne konkreetse patsiendi genotüübiga, kuna sellised rakud võivad sisse tuua mutatsioone, mis loovad eelsoodumuse teistele haigustele. Normaalsed inimese munarakud on endiselt raskesti ligipääsetavad, samas kui isegi somaatiliste tuumade siirdamisel enukleeritud loomamunarakkudesse areneb blastotsüsti staadiumisse vaid 15–25% konstrueeritud „sügootidest“. Pole veel kindlaks tehtud, mitu blastotsüsti on vaja ühe pluripotentsete kloonitud ESC-de liini saamiseks. Samuti väärib märkimist terapeutilise kloonimise metoodika keerukusega seotud kõrged rahalised kulud.

Kokkuvõtteks tuleb märkida, et ESC-de puhul on hüpometüleeritud DNA-ga genoomi pluripotentsus kombineeritud kõrge telomeraasi aktiivsuse ja lühikese rakutsükli C^-faasiga, mis tagab nende intensiivse ja potentsiaalselt lõpmatu paljunemise, mille jooksul ESC-d säilitavad diploidse kromosoomide komplekti ja "juveniilse" fenotüüpiliste omaduste komplekti. ESC-de klonaalne kasv kultuuris ei häiri nende diferentseerumist organismi spetsialiseerunud rakuliinideks, kui proliferatsioon on peatatud ja lisatud sobivad regulatiivsed signaalid. ESC-de restriktsiooniline diferentseerumine somaatilisteks rakuliinideks in vitro toimub ilma mesenhüümi osaluseta, möödudes Nochteyst, väljaspool organogeneesi ja ilma embrüo moodustumiseta. ESC-de ektoopiline sisseviimine in vivo viib paratamatult teratokartsinoomide tekkeni. ESC-de siirdamine blastotsüsti või varajasesse embrüosse kaasneb nende integreerumisega embrüonaalsete kudedega ja selle organite stabiilse kimäriseerumisega.

Rakkude siirdamisel põhinevad regeneratiiv-plastilised tehnoloogiad on rakubioloogia, arengubioloogia, eksperimentaalgeneetika, immunoloogia, neuroloogia, kardioloogia, hematoloogia ja paljude teiste eksperimentaalse ja praktilise meditsiini harude esindajate huvide ristumiskohaks. Eksperimentaalsete uuringute olulisemad tulemused tõestavad tüvirakkude ümberprogrammeerimise võimalust nende omaduste sihipärase muutmisega, mis avab väljavaated tsütodiferentseerumisprotsesside kontrollimiseks kasvufaktorite abil - müokardi regenereerimiseks, kesknärvisüsteemi kahjustuste taastamiseks ja kõhunäärme saarekeste aparaadi funktsiooni normaliseerimiseks. ESC derivaatide siirdamise laialdaseks kasutuselevõtuks praktilises meditsiinis on aga vaja inimese tüvirakkude omadusi üksikasjalikumalt uurida ja jätkata ESC-dega katseid eksperimentaalsetel haigusmudelitel.

Bioeetilised küsimused ja allogeense rakusiirdamise äratõukereaktsiooni probleemi võiks lahendada täiskasvanud organismi piirkondlike tüvirakkude genoomi avastatud plastilisus. Esialgne teave, et isoleeritud ja hoolikalt iseloomustatud hematopoeetiliste autoloogsete rakkude maksa siirdamisel, millest pärinevad uued hepatotsüüdid, integreeruvad maksa lobulitesse, on aga nüüd läbi vaadatud ja kritiseeritud. Sellest hoolimata on avaldatud andmeid, et närvitüvirakkude siirdamine tüümusesse põhjustab uute doonor-T- ja B-lümfotsüütide võrsete teket ning aju närvitüvirakkude siirdamine luuüdisse viib hematopoeetiliste võrsete moodustumiseni pikaajalise doonor-müelo- ja erütropoeesiga. Järelikult võivad täiskasvanud organismi organites püsida pluripotentsed tüvirakud, mis on võimelised genoomi ümber programmeerima ESC-de potentsiaaliks.

ESC meditsiiniliseks otstarbeks saamise allikaks jääb endiselt inimembrüo, mis määrab ette moraalsete, eetiliste, õiguslike ja religioossete küsimuste uue kokkupuutepunkti inimelu alguspunktis. ESC avastamine on andnud võimsa tõuke ägedate arutelude taasalustamiseks selle üle, kus on piir elusrakkude ja mateeria, olendi ja isiksuse vahel. Samal ajal puuduvad ESC meditsiinis kasutamise kohta universaalsed normid, reeglid ja seadused, hoolimata korduvatest katsetest neid luua ja omaks võtta. Iga riik lahendab selle probleemi oma seadusandluse raames iseseisvalt. Omalt poolt püüavad arstid kogu maailmas jätkuvalt regeneratiiv-plastilist meditsiini selliste arutelude raamidest väljapoole viia, peamiselt täiskasvanud tüvirakkude reservide, mitte embrüonaalsete tüvirakkude kasutamise kaudu.

Natuke embrüonaalsete tüvirakkude eraldamise ajaloost

Terato(embrüo)kartsinoomi rakud eraldati 129/ter-Sv hiirte spontaanselt tekkinud munanditeratoomidest, Lt/Sv hiirte spontaanselt tekkinud munasarjateratoomidest ja ektoopiliselt siirdatud embrüonaalsetest rakkudest või kudedest pärinevatest teratoomidest. Sel viisil saadud stabiilsete hiire terato(embrüo)kartsinoomi rakuliinide hulgas olid mõned pluripotentsed, teised diferentseerusid ainult üheks spetsiifiliseks rakutüübiks ja mõned olid täiesti võimetud tsütodiferentseerumiseks.

Ühel ajal keskenduti uuringutele, mille tulemused näitasid terato-(embrüo)-kartsinoomirakkude normaalse fenotüübi taastamise võimalust pärast nende viimist areneva embrüo kudedesse, samuti tööle geneetiliselt modifitseeritud terato-(embrüo)-kartsinoomirakkude in vitro loomisel, mille abil saadi mutantseid hiiri inimese päriliku patoloogia bioloogiliseks modelleerimiseks.

Terato-(embrüo)-kartsinoomi rakuliinide isoleerimiseks kasutati konditsioneeritud suspensioonkultiveerimist. Kultuuris kasvavad terato-(embrüo)-kartsinoomi rakud, nagu ka ESC-d, embrüokehadeks ja vajavad liiniülekandeks kohustuslikku dissotsiatsiooni, säilitades pluripotentsuse embrüonaalsete fibroblastide toitekihil või suspensioonkultiveerimise ajal konditsioneeritud keskkonnas. Pluripotentsete terato-(embrüo)-kartsinoomi liinide rakud on suured, sfäärilised, iseloomulik kõrge aluselise fosfataasi aktiivsus, moodustavad agregaate ja on võimelised mitmesuunaliseks diferentseerumiseks. Blastotsüsti sisseviimisel agregeeruvad nad moorulaga, mis viib kimäärsete embrüote moodustumiseni, mis kuuluvad erinevate organite ja kudede koostisse, mille terato-(embrüo)-kartsinoomi rakkude derivaate leidub. Valdav enamus sellistest kimäärsetest embrüotest sureb aga emakas ning ellujäänud vastsündinud kimääride organites avastatakse võõrrakke harva ja madala tihedusega. Samal ajal suureneb järsult kasvajate (fibrosarkoom, rabdomüosarkoom, muud tüüpi pahaloomulised kasvajad ja pankrease adenoom) esinemissagedus ning kasvaja degeneratsioon toimub sageli kimäärsete embrüote emakasisese arengu perioodil.

Enamik terato-(embrüo)-kartsinoomi rakke normaalsete embrüonaalsete rakkude mikrokeskkonnas omandavad peaaegu loomulikult pahaloomulised neoplastilised tunnused. Arvatakse, et pöördumatu pahaloomulisus on tingitud protoonkogeenide aktiveerimisest struktuuriliste ümberkorralduste protsessis. Üks erand on embrüokartsinoomi liini SST3 rakud, mis on saadud hiire munandi teratoomidest (liin 129/Sv-ter) ja millel on kimäärsetel hiirtel kõrge võime integreeruda embrüo kudedesse ja organitesse ilma järgneva kasvaja moodustumiseta. Kimäärsetel hiirtel esinevate terato-(embrüo)-kartsinoomi rakuliinide derivaadid praktiliselt ei osale primaarsete gonotsüütide moodustumisel. Ilmselt on see tingitud enamiku terato-(embrüo)-kartsinoomi liinide iseloomulikust kromosoomaberratsioonide kõrgest sagedusest, mille rakkudes täheldatakse nii aneuploidsust kui ka kromosoomanomaaliaid.

Laboratoorsetes tingimustes saadi mitu stabiilset inimese terato-(embrüo)-kartsinoomi rakuliini, mida iseloomustab pluripotentsus, kõrge proliferatiivne aktiivsus ja võime diferentseeruda kultuuride kasvu ajal. Täpsemalt kasutati inimese terato-(embrüo)-kartsinoomi rakuliini NTERA-2 neuraalse tsütodiferentseerumise mehhanismide uurimiseks. Pärast selle liini rakkude siirdamist vastsündinud rottide eesaju subventrikulaarsesse piirkonda täheldati nende migratsiooni ja neurogeneesi. Tehti isegi katseid siirdada terato-(embrüo)-kartsinoomi liini NTERA-2 rakkude kultiveerimisel saadud neuroneid insuldihaigetele, mis autorite sõnul viis haiguse kliinilise kulgu paranemiseni. Samal ajal ei esinenud insuldihaigetel terato-(embrüo)-kartsinoomi liini NTERA-2 siiratud rakkude pahaloomulisuse juhtumeid.

Esimesed diferentseerumata pluripotentsete hiire embrüonaalsete tüvirakkude liinid saadi 1980. aastate alguses Evansi ja Martini poolt, kes isoleerisid need blastotsüsti sisemisest rakumassist – embrüoblastist. Isoleeritud ESC liinid säilitasid pluripotentsuse ja võime diferentseeruda spetsiaalses söötmes faktorite mõjul mitmesugusteks rakutüüpideks pikka aega.

Termin „embrüonaalne pluripotentne tüvirakk” ise kuulub Leroy Stevensile, kes tubakatõrva mõju kasvajate tekkele uurides juhtis tähelepanu munandi teratokartsinoomi spontaansele esinemisele kontrollrühma lineaarsetel (129/v) hiirtel. Munandi teratokartsinoomi rakke iseloomustas kõrge proliferatsioonikiirus ja kõhuõõne vedeliku juuresolekul diferentseerusid nad spontaanselt neuronite, keratinotsüütide, kondrotsüütide, kardiomüotsüütide, samuti juuste ja luufragmentide moodustumisega, kuid ilma vastava koe korrastatud tsütoarhitektuuri tunnusteta. Kultuuri paigutamisel kasvasid teratokartsinoomirakud substraadist sõltumatute pluripotentsete kloonidena ja moodustasid embrüoidseid kehasid, mille järel nad lakkasid jagunemast ja läbisid spontaanse korrastamata diferentseerumise neuroniteks, gliarakkudeks, lihasrakkudeks ja kardiomüotsüütideks. Stevens leidis, et hiire teratokartsinoom 129/v sisaldab vähem kui 1% rakke, mis on võimelised diferentseeruma mitmesugusteks spetsialiseerunud somaatilisteks liinideks, ja diferentseerumine ise sõltub neid mõjutavatest teguritest (peritoneaalse vedeliku koostis, küpsete rakkude produktid või kultuuri lisatud koed). Leroy Stevensoni hüpotees sugurakkude liini embrüonaalsete eellasrakkude olemasolust teratokartsinoomirakkude hulgas leidis kinnitust: preimplantatsiooni embrüote embrüoblastrakkude suspensioon täiskasvanud hiirte kudedes moodustas teratokartsinoome ja neist eraldatud puhtad rakuliinid pärast intraperitoneaalset manustamist retsipientloomadele diferentseerusid neuroniteks, kardiomüotsüütideks ja teisteks somaatilisteks rakkudeks, mis pärinesid kõigist kolmest idukihist. In vivo katsetes viis embrüoblastidest, kuid mitte trofoblastidest saadud ESC-de siirdamine teise liini hiireembrüotesse blastomeeride staadiumis 8-32 kimäärsete loomade sünnini (ilma kasvajate tekketa), kelle organitest leiti doonorkoe võrseid. Kimerismi täheldati isegi sugurakkude liinis.

Hiire embrüo suguelundite rudimendist eraldatud primaarsed eellasrakud vastasid morfoloogia, immunoloogilise fenotüübi ja funktsionaalsete omaduste poolest Stevensoni poolt teratokartsinoomist ja embrüoblastist saadud ESC-dele. Pärast ESC-de blastotsüsti viimist sündinud kimäärides iseloomustas allofeeni morfogeneesi doonori ja retsipientmaksa, kopsude ja neerude struktuuri- ja funktsionaalsete üksuste mosaiikne vaheldumine. Mõnel juhul täheldati nii retsipient- kui ka doonorrakkudest koosnevate soolekrüptide või maksalobulite moodustumist. Morfogenees realiseerus aga alati vastavalt retsipientliigi geneetilisele programmile ja kimäärism piirdus ainult rakulise tasemega.

Seejärel tehti kindlaks, et embrüonaalsete tüvirakkude (ESC-de) proliferatsioon ilma tsütodiferentseerumiseta mesenhüümist pärinevate rakkude (loote fibroblastide) toitmiskihil toimub LIF-i kohustusliku kohalolekuga selektiivsetes toitainekeskkondades, mis selektiivselt tagavad ainult tüvi- ja eellasrakkude ellujäämise, samas kui valdav enamus spetsialiseerunud rakuelementidest sureb. Selliste meetodite abil eraldas James Thomson 1998. aastal inimese blastotsüsti sisemisest rakumassist viis immortaliseeritud embrüonaalsete tüvirakkude liini. Samal aastal töötas John Gerhart välja meetodi surematute ESC-liinide eraldamiseks nelja- kuni viienädalaste inimese embrüote suguelundite kühmust. Tänu oma ainulaadsetele omadustele hakati embrüonaalseid tüvirakke ja definitiivsete kudede tüvirakke vaid kaks aastat hiljem kasutama regeneratiivse meditsiini ja geeniteraapia praktikas.