Kristallkihi roll osteoartriidi patogeneesis

Aluselise kaltsiumfosfaadi (BCP) kristalle leidub sünoviaalvedelikus 30–60%-l osteoartriidiga patsientidest. A. Swan jt (1994) andmetel leidub kaltsiumi sisaldavaid kristalle palju suurema hulga osteoartriidiga patsientide sünoviaalvedelikus; kristallide äärmiselt väikese suuruse või väikese arvu tõttu neid aga tavapäraste meetodite abil ei tuvastata. BCP kristallide esinemine sünoviaalvedelikus korreleerub liigesekõhre degeneratsiooni radiograafiliste tunnustega ja on seotud suurema efusiooni mahuga võrreldes efusiooniga kristallideta põlveliigestes. Gonartroosi radiograafilist progresseerumist mõjutavate tegurite uuring näitas, et kaltsiumpürofosfaatdihüdraadi (CPPD) kristallide ladestumine on ebasoodsa kliinilise ja radiograafilise tulemuse ennustaja. Eakate patsientide uuringus leiti, et osteoartriit on seotud kondrokaltsinoosiga, eriti põlve lateraalses sääreluu-reieluu sektsioonis ja esimeses kolmes metakarpofalangeaalliigeses. Pole haruldane, et osteoartriidiga patsientidel leidub mõlemat tüüpi kristalle, nii OFC-d kui ka PFC-d.

Kliiniliselt erineb kaltsiumkristallide ladestumisest tingitud liigesekõhre degeneratsioon primaarse osteoartroosi korral täheldatust. Kui kristallid oleksid kõhre degeneratsiooni lihtne epifenomen, leiduksid need primaarse osteoartroosi poolt kõige sagedamini mõjutatud liigestes, st põlvedes, puusades ja käte väikestes liigestes. Seevastu kristallide ladestumisega seotud haigused mõjutavad kõige sagedamini liigeseid, mis ei ole primaarse osteoartroosi puhul tüüpilised, näiteks õlga, randmet ja küünarnukki. Kristallide olemasolu liigesevedelikus (efusioonvedelikus) on seotud raskema liigesekõhre degeneratsiooniga. Vaieldakse küsimuse üle, kumb on põhjus ja kumb tagajärg, kristallide ladestumine või kõhre degeneratsioon. Vahepealse seisukoha hõivab järgmine eeldus: kõhre ainevahetuse primaarne anomaalia viib selle degeneratsioonini ja kristallide sekundaarne ladestumine kiirendab selle lagunemist (nn amplifikatsiooniahela teooria).

Täpne mehhanism, mille abil kaltsiumkristallid liigesekõhre kahjustavad, on teadmata. Teoreetiliselt võivad kaltsiumkristallid kondrotsüüte otseselt kahjustada. Histoloogiline uuring näitab aga harva kristalle kondrotsüütide lähedal ja veelgi harvemini neelavad need kondrotsüütidesse. Kõige tõenäolisem mehhanism on kristallide fagotsütoos sünoviaalmembraani rakkude poolt, millele järgneb proteolüütiliste ensüümide vabanemine või tsütokiinide sekretsioon, mis stimuleerivad kondrotsüütide ensüümide vabanemist. Seda kontseptsiooni toetab uuring PFKD-indutseeritud sünoviidi rollist kiiresti progresseeruva osteoartriidi tekkes pürofosfaatartropaatia korral. Selles uuringus süstiti kaltsiumpürofosfaatdihüdraadi kristalle (1 või 10 mg) igal nädalal küülikute paremasse põlve, kellel oli osaline külgmine meniskektoomia, mille tagajärjel oli osteoartriit esile kutsutud. Selgus, et pärast 8 süsti ilmnesid paremas põlveliiges oluliselt tõsisemad muutused võrreldes vasakuga. Sünoviaalpõletiku intensiivsus korreleerus kaltsiumpürofosfaatdihüdraadi kristallide intraartikulaarsete süstide ja nende annusega. Hoolimata asjaolust, et käesolevas uuringus kasutatud CPPD kristallide annused ületavad in vivo annuseid, näitavad tulemused CPPD-indutseeritud põletiku rolli osteoartriidi progresseerumisel pürofosfaatartropaatia korral.

Kaltsiumi sisaldavate kristallide poolt liigesekõhre kahjustuse indutseerimise võimalikud mehhanismid on seotud nende mitogeensete omadustega, võimega indutseerida MMP-sid ja stimuleerida prostaglandiinide sünteesi.

Kaltsiumi sisaldavate kristallide mitogeenne toime. Kristallidega seotud artropaatiate korral täheldatakse sageli sünoviaalmembraani rakkude proliferatsiooni, kusjuures kristallid ise vastutavad selle protsessi eest vaid osaliselt. Sünoviaalrakkude arvu suurenemisega kaasneb tsütokiinide sekretsiooni suurenemine, mis soodustab kondrolüüsi ja indutseerib proteolüütiliste ensüümide sekretsiooni. OFC kristallid stimuleerivad inimese liigesepatoloogias leiduvates kontsentratsioonides annusest sõltuvalt puhkeolekus naha fibroblastide kultuuride ning koerte ja hiirte sünoviaalfibroblastide mitogeneesi. Kaltsiumpürofosfaatdihüdraadi, uraat-, sulfaat-, karbonaadi ja kaltsiumfosfaadi kristallid stimuleerivad rakkude kasvu. Nende kristallide poolt indutseeritud ( ^3H )-tümidiini inkorporeerimise algus ja piik on 3 tunni võrra nihkunud võrreldes rakkude stimuleerimisega vereseerumiga. See ajavahemik võib olla vajalik kristallide fagotsütoosiks ja lahustumiseks. Sama suurusega kontrollkristallide (nt teemanttolmu või lateksiosakeste) lisamine ei stimuleerinud mitogeneesi. Naatriumuraatmonohüdraadi kristallidel olid nõrgad mitogeensed omadused ja need olid oluliselt halvemad kui kaltsiuraamil, mis näitab kristallide kaltsiumisisalduse olulisust mitogeneesis. Sünteetilistel OFC kristallidel olid samad mitogeensed omadused kui kondrokaltsinoosiga patsientidelt saadud kristallidel. Kaltsiumi sisaldavate kristallide mitogeenne toime ei tulenenud ümbritseva toitekeskkonna kaltsiumisisalduse suurenemisest in vitro, kuna aluseliste kaltsiumfosfaadi kristallide lahustumine toitekeskkonnas ei stimuleerinud ( ^3H )-tümidiini omastamist fibroblastide poolt.

Üks pakutud OFC-indutseeritud mitogeneesi mehhanism on see, et sünoviaalrakkude ebanormaalne proliferatsioon võib olla vähemalt osaliselt tingitud endotsütoosist ja kristallide rakusisesest lahustumisest, mis suurendab tsütoplasmaatilist Ca2 ⁺ kontsentratsiooni ja aktiveerib kaltsiumist sõltuva raja, mis viib mitogeneesini. Seda kontseptsiooni toetab vajadus otsese raku-kristalli kontakti järele mitogeneesi stimuleerimiseks, kuna rakukultuuride kokkupuude kristallidega indutseeris rakkude kasvu, samas kui sellisest kontaktist ilma jäänud rakkude kokkupuude seda ei teinud. Kristallide fagotsütoosi vajaduse uurimiseks pärast raku-kristalli interaktsiooni kultiveeriti rakke ^45Ca -OPC ja ( ^3H )-tümidiiniga. Leiti, et ^45Ca -OPC-d sisaldavad rakud omastasid oluliselt rohkem ( ^3H )-tümidiini kui rakud, millel puudus kaltsiumfosfaadi baasmärgistus. Makrofaagide kultuurides põhjustas kristallide endotsütoosi pärssimine tsütokalasiini poolt kristallide lahustumise pärssimist, mis rõhutab veelgi fagotsütoosi vajalikkust.

Kaltsiumi sisaldavad kristallid lahustuvad happes. Pärast fagotsütoosi lahustuvad kristallid makrofaagide fagolüsosoomide happelises keskkonnas. Klorokviin, ammooniumkloriid, bafilomütsiin A1 ja kõik lüsosomaalse pH-d suurendavad lüsosomotroofsed ained pärsivad annusest sõltuvalt rakusisest kristallide lahustumist ja (3H)-tümidiini omastamist ^{fibroblastides}, mida kultiveeritakse aluseliste kaltsiumfosfaadi kristallidega.

OFC kristallide lisamine monokihilisele fibroblastide kultuurile põhjustas koheselt rakusisese kaltsiumi kümnekordse suurenemise, mis naasis 8 minuti pärast algtasemele. Kaltsiumi allikaks olid peamiselt rakuvälised ioonid, kuna aluselised kaltsiumfosfaadi kristallid lisati kaltsiumivabasse söötmesse. Järgmine rakusisese kaltsiumi kontsentratsiooni suurenemine täheldati 60 minuti pärast ja kestis vähemalt 3 tundi. Siin oli kaltsiumi allikaks fagotsütoositud kristallid, mis olid lahustatud fagolüsosoomides.

Leiti, et OFC kristallide mitogeenne toime on sarnane PDGF-i kui kasvufaktori omaga; sarnaselt viimasele on OFC kristallidel sünergism IGF-1 ja vereplasmaga. IGF-1 blokeerimine vähendab rakkude mitogeneesi vastusena OFC-le. PG Mitchell jt (1989) näitasid, et mitogeneesi indutseerimine Balb/c- ₃ T3 fibroblastides OFC kristallide _poolt nõuab seriin/treoniin proteiinkinaas C (PKC) olemasolu, mis on üks peamisi signaalide mediaatoreid, mis tekivad rakkude välise stimulatsiooni käigus hormoonide, neurotransmitterite ja kasvufaktoritega. PKC aktiivsuse vähenemine Balb/c-3 T3 rakkudes _pärsibOFC -vahendatud protoonkogeenide c-fos ja c-myc indutseerimist, kuid ei mõjuta nende onkogeenide stimuleerimist PDGF-i poolt.

Rakusisene kaltsiumi suurenemine pärast fagotsüütitud kristallide lahustumist ei ole ainus mitogeneesi signaalirada. Kui kasvufaktorid, näiteks PDGF, seonduvad oma membraaniretseptoriga, stimuleeritakse fosfolipaas C-d (fosfodiesteraas), mis hüdrolüüsib fosfatidüülinositool-4,5-bisfosfaati, moodustades rakusisesed virgatsained inositool-3-fosfaat ja diatsüülglütserool. Esimene vabastab kaltsiumi endoplasmaatilisest retiikulumist, moduleerides kaltsiumist sõltuvate ja kaltsium/kalmoduliinist sõltuvate ensüümide, näiteks proteiinkinaaside ja proteaaside aktiivsust.

R. Rothenberg ja H. Cheung (1988) teatasid fosfatidüülinosiitool-4,5-bisfosfaadi suurenenud lagunemisest fosfolipaas C poolt küüliku sünoviaalrakkudes vastusena OFC kristallidega stimuleerimisele. Viimane suurendas oluliselt inositool-1-fosfaadi sisaldust märgistatud ( ^3H )-inositooliga rakkudes; piik saavutati 1 minuti jooksul ja püsis umbes 1 tund.

Diatsüülglütserool on kaltsiumpürofosfaatdihüdraadi potentsiaalne aktivaator. Kuna OFC kristallid suurendavad fosfolipaas C aktiivsust, mis viib diatsüülglütserooli akumuleerumiseni, võib eeldada PKC aktivatsiooni suurenemist. PG Mitchell jt (1989) võrdlesid OFC kristallide ja PDGF mõju Balb/c- _{3T3fibroblastide} DNA sünteesile. Rakukultuuris inaktiveeriti PKC rakkude inkubeerimisel kasvajat toetava forbooldiestriga (TPD), mis on diatsüülglütserooli analoog. Pikaajaline stimulatsioon madalate TPD annustega vähendas PKC aktiivsust, samas kui ühekordne stimulatsioon suure annusega aktiveeris selle. OFC kristallide DNA sünteesi stimuleerimine pärsiti pärast PKC inaktiveerimist, mis näitab selle ensüümi olulisust OFC-indutseeritud mitogeneesis. Varem näitasid GM McCarthy jt (1987) seost inimese fibroblastide mitogeense vastuse OFC kristallidele ja PKC aktivatsiooni vahel. OFC kristallid ei aktiveeri aga fosfatidüülinositool-3-kinaasi ega türosiinkinaase, mis kinnitab, et OFC kristallide poolt rakkude aktiveerimise mehhanism on selektiivne.

Rakkude proliferatsiooni kontrollib geenide rühm, mida nimetatakse protoonkogeenideks. Protoonkogeenide c-fos ja c-myc produktid, valgud foe ja mye, lokaliseeruvad rakutuumas ja seonduvad spetsiifiliste DNA järjestustega. 3T3 fibroblastide stimuleerimine OFC kristallidega põhjustab c-fos ekspressiooni mõne minuti jooksul, mis saavutab maksimumi 30 minutit pärast stimulatsiooni. c-myc transkriptsiooni indutseerimine OFC kristallide või PDGF poolt toimub 1 tunni jooksul ja saavutab maksimumi 3 tundi pärast stimulatsiooni. Rakud säilitavad c-fos ja c-myc transkriptsiooni kõrgendatud taseme vähemalt 5 tundi. Inaktiveeritud PCD-ga rakkudes on c-fos ja c-myc stimuleerimine OFC või TFD kristallide poolt oluliselt pärsitud, samas kui nende geenide indutseerimine PDGF poolt ei muutu.

Mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAP K) perekonna liikmed on mitmesuguste rakusiseste signaaliülekande kaskaadide peamised regulaatorid. Selle perekonna üks alamklass, p42/p44, reguleerib rakkude proliferatsiooni mehhanismi kaudu, mis hõlmab proto-onkogeenide c-fos ja c-jun aktiveerimist. OFC ja PFKD kristallid aktiveerivad proteiinkinaasi signaaliülekande raja, mis hõlmab nii p42 kui ka p44, mis viitab selle raja rollile kaltsiumi sisaldavate kristallide poolt indutseeritud mitogeneesis.

Lõpuks hõlmab OFC-indutseeritud mitogeneesi transkriptsioonifaktorit tuumafaktor κB (NF-κB), mida esmakordselt kirjeldati kui immunoglobuliini κ kerge ahela (IgK) geeni. See on indutseeritav transkriptsioonifaktor, mis on oluline paljudes signaaliülekande radades, kuna see reguleerib erinevate geenide ekspressiooni. NF-κB indutseerimine on tavaliselt seotud inhibeerivate valkude, mida nimetatakse IκB-ks, vabanemisega tsütoplasmast. NF-κB indutseerimisele järgneb aktiivse transkriptsioonifaktori translokatsioon tuuma. OFC kristallid indutseerivad NF-κB-d Balb/c- _3T3 fibroblastides ja inimese naha fibroblastides.

NF-κB aktivatsioonile järgnevas signaaliülekandes võib osaleda mitu rada, kuid kõik need hõlmavad proteiinkinaase, mis fosforüülivad (ja seega lagundavad) IκB-d. In vitro uuringute põhjal arvati varem, et IκB toimib kinaaside (nt PKC ja proteiinkinaas A) substraadina. Hiljuti on aga tuvastatud suure molekulmassiga IκB kinaasi kompleks. Need kinaasid fosforüülivad spetsiifiliselt IκB seriini jääke. NF-κB aktivatsioon TNF-α ja IL-1 poolt nõuab NF-κB-indutseeriva kinaasi (NIK) ja IκB kinaasi tõhusat toimet. NIK aktivatsiooni molekulaarne mehhanism on praegu teadmata. Kuigi OFC kristallid aktiveerivad nii PKC-d kui ka NF-κB-d, ei ole teada, mil määral need kaks protsessi võivad olla seotud. Kuna GκB kinaasi modifitseerimine toimub fosforüülimise kaudu, ei saa välistada PKC rolli NF-κB indutseerimisel OFC kristallide poolt fosforüülimise ja GκB kinaasi aktiveerimise kaudu. Seda kontseptsiooni toetab OFC kristallide poolt indutseeritud mitogeneesi ja NF-κB ekspressiooni pärssimine PKC inhibiitori staurosporiini poolt. Samamoodi võib staurosporiin pärssida GκB kinaasi ja seega inhibeerib proteiinkinaas A-d ja teisi proteiinkinaase.

Seega hõlmab OFC-kristallide poolt indutseeritud mitogeneesi mehhanism fibroblastides vähemalt kahte erinevat protsessi:

• kiire membraaniga seotud sündmus, mis põhjustab PKC ja MAP K aktivatsiooni, NF-κB ja protoonkogeenide indutseerimist,
• ^{kristallide aeglasem rakusisene lahustumine, mis viib Ca2 +} rakusisese sisalduse suurenemiseni ja seejärel mitmete kaltsiumist sõltuvate protsesside aktiveerimiseni, mis stimuleerivad mitogeneesi.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Indutseerimine MMP-kaltsiumi sisaldavate kristallide abil

Kaltsiumi sisaldavate kristallide põhjustatud koekahjustuste mediaatoriteks on MMP-d - kollagenaas-1, stromelüsiin, 92 kD želatinaas ja kollagenaas-3.

Arvestades OFC kristallide sisalduse ja liigesekoe hävimise vahelist seost, püstitati hüpotees, et OFC kristallid ja võimalik, et ka mõned kollageenid fagotsüteeritakse sünoviaalrakkude poolt. Stimuleeritud sünovotsüüdid prolifereeruvad ja sekreteerivad proteaase. Seda hüpoteesi testiti in vitro, lisades looduslikke või sünteetilisi OFC-d, PFCD-d ja teisi kristalle kultiveeritud inimese või koera sünovotsüütidele. Neutraalsete proteaaside ja kollagenaaside aktiivsus suurenes annusest sõltuvalt ja oli ligikaudu 5-8 korda suurem kui kristallideta kasvatatud kontrollrakkude kultuuris.

Kristalle sisaldavas keskkonnas kultiveeritud rakkudes tuvastati kollagenaas-1, stromelüsiini ja želatinaas-92 kDa mRNA samaaegne indutseerimine, millele järgnes ensüümide sekretsioon keskkonda.

OFC kristallid indutseerisid ka kollagenaas-1 ja kollagenaas-2 mRNA akumuleerumist küpsetes seakondrotsüütides, millele järgnes ensüümide sekretsioon keskkonda.

GM McCarty jt (1998) uurisid rakusisese kristallide lahustumise rolli kristallide poolt indutseeritud MMP tootmises. Lüsosomaalse pH tõstmine bafilomütsiin A-ga pärssis rakusisese kristallide lahustumist ja nõrgendas ka inimese fibroblastide proliferatiivset vastust OFC kristallidele, kuid ei pärssinud MMP sünteesi ja sekretsiooni.

Ei aluseline kaltsiumfosfaat ega PFCD kristallid indutseerinud in vitro IL-1 tootmist, kuid naatriumuraadi kristallid küll.

Praegused andmed näitavad selgelt MMP tootmise otsest stimuleerimist fibroblastide ja kondrotsüütide poolt kokkupuutel kaltsiumi sisaldavate kristallidega.

Osteoartriidi sümptomid viitavad MMP olulisele rollile haiguse progresseerumisel. Kaltsiumi sisaldavate kristallide olemasolu suurendab kahjustatud liigeste kudede degeneratsiooni.

Prostaglandiinide sünteesi stimuleerimine

Lisaks rakkude kasvu ja ensüümide sekretsiooni stimuleerimisele põhjustavad kaltsiumi sisaldavad kristallid imetajate rakukultuuridest prostaglandiinide, eriti PGE2, vabanemist _. PGE2 vabanemine toimub _kõigil juhtudel esimese tunni jooksul pärast rakkude kokkupuudet kristallidega. R. Rothenberg (1987) tegi kindlaks, et arahhidoonhappe peamised allikad PGE2 sünteesiks _on fosfatidüülkoliin ja fosfatidüületanoolamiin ning kinnitas ka, et fosfolipaas A2 _{ja NOX on PGE2tootmise} domineerivad rajad.

PGE1 võib vabaneda ka vastusena OFA kristallidele. GM McCarty jt (1993, 1994) uurisid PGE2 _, PGE ja selle analoogi misoprostooli mõju inimese fibroblastide mitogeensele vastusele OFA kristallidele. Kõik kolm ainet pärssisid mitogeenset vastust annusest sõltuval viisil, kusjuures PGE ja misoprostool näitasid tugevamat inhibeerivat aktiivsust. PGE2 ja misoprostool, kuid mitte PGE2 _, pärssisid kollagenaasi mRNA akumuleerumist vastusena OFA kristallidele.

MG McCarty ja H. Cheung (1994) uurisid OFC-vahendatud rakkude aktiveerimise mehhanismi PGE poolt. Autorid näitasid, et PGE, mis on rakusisese cAMP võimsam indutseerija kui PGE2 _, ja PGE, pärsivad OFC-indutseeritud mitogeneesi ja MMP tootmist cAMP-sõltuva signaaliülekande raja kaudu. On võimalik, et OFC kristallide poolt indutseeritud PGE tootmise suurenemine nõrgestab nende teisi bioloogilisi efekte (mitogeneesi ja MMP tootmist) tagasisidemehhanismi kaudu.

Kristallide põhjustatud põletik

Kaltsiumi sisaldavaid kristalle leidub osteoartroosiga patsientide sünoviaalvedelikus sageli, kuid ägeda põletiku episoodid koos leukotsütoosiga on nii osteoartroosi kui ka kristallidega seotud artropaatiate (näiteks Milwaukee õla sündroom) korral haruldased. Kristallide flogistilisi potentsiaale võivad muuta mitmed inhibeerivad tegurid. R. Terkeltaub jt (1988) näitasid vereseerumi ja plasma võimet oluliselt pärssida neutrofiilsete granulotsüütide reaktsiooni kaltsiumfosfaadi aluselistele kristallidele. Sellist inhibeerimist põhjustavad tegurid on kristalle siduvad valgud. Ühe sellise valgu, ₂ -HS glükoproteiini (AHSr) uuring näitas, et AHSr on neutrofiilsete granulotsüütide reaktsiooni OFC kristallidele kõige tugevam ja spetsiifilisem inhibiitor. AHSr on maksa päritolu seerumivalk; on teada, et võrreldes teiste seerumivalkudega leidub seda suhteliselt suurtes kontsentratsioonides luudes ja mineraliseeruvates kudedes. Lisaks esineb AHSr "mittepõletikulises" sünoviaalvedelikus ja seda on tuvastatud ka kaltsiumfosfaadi aluselistel kristallidel natiivses sünoviaalvedelikus. Seega ei saa välistada võimalust, et AHSr moduleerib kaltsiumfosfaadi aluseliste kristallide flogogeenset potentsiaali in vivo.

Kõigi ülaltoodu kokkuvõtteks esitame kaks osteoartriidi patogeneesi skeemi, mille on välja pakkunud WB van den Berg jt. (1999) ja M. Carrabba et al. (1996), mis ühendavad mehaanilisi, geneetilisi ja biokeemilisi tegureid.