Kunstlikud südameklapid

Kliiniliseks kasutamiseks saadaolevad tänapäevased bioloogilised tehisklapid, välja arvatud kopsu autotransplantaadid, on elujõuetud struktuurid, millel puudub kasvu- ja koe taastumispotentsiaal. See seab nende kasutamisele klapipatoloogia korrigeerimiseks olulisi piiranguid, eriti lastel. Koetehnoloogia on arenenud viimase 15 aasta jooksul. Selle teadussuuna eesmärk on luua tehistingimustes selliseid struktuure nagu tehisklapid tromboresistentse pinna ja elujõulise interstitsiumiga.

[ 1 ], [ 2 ]

Kuidas kunstlikke südameklappe arendatakse?

Koetehnoloogia teaduslik kontseptsioon põhineb ideel elusrakkude (fibroblastide, tüvirakkude jne) asustamisest ja kasvatamisest sünteetilises või looduslikus imenduvas karkassis (maatriksis), mis on kolmemõõtmeline klapistruktuur, samuti signaalide kasutamisel, mis reguleerivad siirdatud rakkude geeniekspressiooni, organisatsiooni ja produktiivsust rakuvälise maatriksi moodustumise perioodil.

Sellised tehislikud südameklapid integreeritakse patsiendi koega nende struktuuri ja funktsiooni lõplikuks taastamiseks ja edasiseks säilitamiseks. Sellisel juhul moodustub rakkude (fibroblastid, müofibroblastid jne) toimimise tulemusena algsele maatriksile uus kollageen-elastiini karkass ehk täpsemalt rakuväline maatriks. Selle tulemusena peaksid koetehnoloogia abil loodud optimaalsed tehislikud südameklapid olema anatoomilise struktuuri ja funktsiooni poolest lähedased algsele ning omama biomehaanilist kohanemisvõimet, võimet taastuda ja kasvada.

Koetehnoloogia abil arendatakse kunstlikke südameklappe, kasutades erinevaid rakukogumisallikaid. Seega saab kasutada ksenogeenseid või allogeenseid rakke, kuigi esimesed on seotud zoonooside inimestele edasikandumise riskiga. Allogeensete rakkude geneetilise modifitseerimise abil on võimalik vähendada antigeensust ja ennetada organismi äratõukereaktsioone. Koetehnoloogia nõuab usaldusväärset rakkude allikat. Selline allikas on autogeensed rakud, mis võetakse otse patsiendilt ja mis ei tekita reimplanteerimise ajal immuunreaktsioone. Tõhusad kunstlikud südameklapid toodetakse veresoontest (arteritest ja veenidest) saadud autoloogsete rakkude põhjal. Puhaste rakukultuuride saamiseks on välja töötatud meetod, mis põhineb fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimisel - FACS-il. Veresoonest saadud segatud rakupopulatsioon märgistatakse atsetüülitud madala tihedusega lipoproteiini markeriga, mis imendub selektiivselt endoteliotsüütide pinnale. Seejärel saab endoteelirakke hõlpsalt eraldada veresoontest saadud rakkude põhiosast, mis on silelihasrakkude, müofibroblastide ja fibroblastide segu. Rakkude allikas, olgu see siis arter või veen, mõjutab lõppkonstruktsiooni omadusi. Seega on venoossete rakkudega maatriksiga tehissüdameklapid kollageeni moodustumise ja mehaanilise stabiilsuse poolest paremad kui arteriaalsete rakkudega konstruktsioonid. Perifeersete veenide valimine näib olevat mugavam rakkude kogumise allikas.

Müofibroblaste saab koguda ka unearteritest. Veresoontest pärinevatel rakkudel on aga looduslikest interstitsiaalsetest rakkudest oluliselt erinevad omadused. Alternatiivse rakuallikana saab kasutada autoloogseid nabanööri rakke.

Tüvirakkudel põhinevad kunstlikud südameklapid

Viimastel aastatel on tüvirakkude uuringud soodustanud kudede inseneritöö arengut. Punaste luuüdi tüvirakkude kasutamisel on oma eelised. Eelkõige võimaldab biomaterjali kogumise ja in vitro kultiveerimise lihtsus koos järgneva diferentseerimisega erinevat tüüpi mesenhümaalseteks rakkudeks vältida tervete veresoonte kasutamist. Tüvirakud on rakuliinide pluripotentsed allikad ja neil on ainulaadsed immunoloogilised omadused, mis aitavad kaasa nende stabiilsusele allogeensetes tingimustes.

Inimese punase luuüdi tüvirakud saadakse rinnaku punktsiooni või niudeluuharja punktsiooni teel. Need eraldatakse 10–15 ml rinnaku aspiraadist, eraldatakse teistest rakkudest ja kultiveeritakse. Vajaliku rakkude arvu saavutamisel (tavaliselt 21–28 päeva jooksul) külvatakse (koloniseeritakse) need maatriksitele ja kultiveeritakse toitekeskkonnas staatilises asendis (7 päeva niisutatud inkubaatoris temperatuuril 37 °C 5% CO2 juuresolekul). Seejärel stimuleeritakse rakkude kasvu kuplikeskkonna abil (bioloogilised stiimulid) või luues füsioloogilised tingimused koe kasvuks isomeetrilise deformatsiooni ajal pulseeriva vooluga paljundusaparaadis – bioreaktoris (mehaanilised stiimulid). Fibroblastid on tundlikud mehaaniliste stiimulite suhtes, mis soodustavad nende kasvu ja funktsionaalset aktiivsust. Pulseeriv vool põhjustab nii radiaalsete kui ka ümbermõõduliste deformatsioonide suurenemist, mis viib asustatud rakkude orientatsioonini (pikenemiseni) selliste pingete suunas. See omakorda viib klappide orienteeritud kiuliste struktuuride moodustumiseni. Püsiv vool põhjustab seintele ainult tangentsiaalseid pingeid. Pulseeriv vool avaldab soodsat mõju rakkude morfoloogiale, proliferatsioonile ja rakuvälise maatriksi koostisele. Toitekeskkonna voolu iseloom, bioreaktori füüsikalis-keemilised tingimused (pH, pO2 ja pCO2) mõjutavad samuti oluliselt kollageeni tootmist. Seega suurendavad laminaarne vool ja tsüklilised pöörisvoolud kollageeni tootmist, mis viib mehaaniliste omaduste paranemiseni.

Teine lähenemisviis koestruktuuride kasvatamiseks on luua embrüonaalsed tingimused bioreaktoris, mitte simuleerida inimkeha füsioloogilisi tingimusi. Tüvirakkude baasil kasvatatud koebioklappidel on liikuvad ja painduvad klapid, mis on funktsionaalselt võimelised toimima kõrge rõhu ja füsioloogilisest tasemest suurema voolu korral. Nende struktuuride klappide histoloogilised ja histokeemilised uuringud näitasid maatriksi biodestruktsiooni aktiivsete protsesside olemasolu ja selle asendamist elujõulise koega. Kude on organiseeritud kihilise tüübi järgi, millel on natiivse koega sarnased rakuvälise maatriksi valkude omadused, I ja III tüüpi kollageeni ning glükosaminoglükaanide olemasolu. Klappide tüüpilist kolmekihilist struktuuri - vatsakeste, käsnja ja kiulise kihi - aga ei saadud. Kõigis fragmentides leitud vimentiini ekspresseerivatel ASMA-positiivsetel rakkudel olid müofibroblastidega sarnased omadused. Elektronmikroskoopia näitas rakulisi elemente, millel olid elujõulistele, sekretoorselt aktiivsetele müofibroblastidele iseloomulikud tunnused (aktiin/müosiinfilamendid, kollageeni niidid, elastiin) ja endoteelirakud koe pinnal.

Voldikutel tuvastati I ja III tüüpi kollageen, ASMA ja vimentiin. Koe- ja natiivsete struktuuride voldikute mehaanilised omadused olid võrreldavad. Koetehislikud südameklapid näitasid 20 nädala jooksul suurepärast jõudlust ning sarnanesid oma mikrostruktuuri, biokeemilise profiili ja valgumaatriksi moodustumise poolest looduslike anatoomiliste struktuuridega.

Kõik koetehnoloogia abil saadud tehisklapid implanteeriti loomadele kopsuasendis, kuna nende mehaanilised omadused ei vasta aordiasendis tekkivatele koormustele. Loomadelt eemaldatud koeklapid on struktuurilt lähedased natiivsetele, mis viitab nende edasisele arengule ja restruktureerimisele in vivo. Kas koe restruktureerimise ja küpsemise protsess jätkub füsioloogilistes tingimustes ka pärast tehisklappide implanteerimist, nagu loomkatsetes täheldati, näitavad edasised uuringud.

Ideaalsetel tehislikel südameklappidel peaks olema vähemalt 90% poorsus, kuna see on oluline rakkude kasvu, toitainete kohaletoimetamise ja rakkude ainevahetusproduktide eemaldamise jaoks. Lisaks biosobivusele ja biolagunevusele peaksid tehislikel südameklappidel olema keemiliselt soodne pind rakkude külvamiseks ja need peaksid vastama loodusliku koe mehaanilistele omadustele. Maatriksi biolagundamise tase peaks olema kontrollitav ja proportsionaalne uue koe moodustumise tasemega, et tagada mehaaniline stabiilsus aja jooksul.

Praegu töötatakse välja sünteetilisi ja bioloogilisi maatrikseid. Kõige levinumad bioloogilised materjalid maatriksite loomiseks on doonori anatoomilised struktuurid, kollageen ja fibriin. Polümeersetest tehislikest südameklappidest tehakse ettepanek biolaguneda pärast implanteerimist, kui implanteeritud rakud hakkavad tootma ja organiseerima oma rakuvälist maatriksivõrgustikku. Uue maatrikskoe moodustumist saab reguleerida või stimuleerida kasvufaktorite, tsütokiinide või hormoonide abil.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Doonori kunstlikud südameklapid

Maatriksitena saab kasutada inimestelt või loomadelt saadud ja rakulistest antigeenidest detsellulaarselt puhastatud doonor-südameklappe, et vähendada nende immunogeensust. Rakuvälise maatriksi säilinud valgud on aluseks külvatud rakkude järgnevale adhesioonile. Rakuliste elementide eemaldamiseks (atsellulaarselt puhastamiseks) on olemas järgmised meetodid: külmutamine, töötlemine trüpsiini/EDTA-ga, detergendid - naatriumdodetsüülsulfaat, naatriumdeoksükolaat, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, samuti mitmeastmelised ensümaatilised töötlusmeetodid. Sel juhul eemaldatakse rakumembraanid, nukleiinhapped, lipiidid, tsütoplasmaatilised struktuurid ja lahustuvad maatriksimolekulid, säilitades samal ajal kollageeni ja elastiini. Ideaalset meetodit pole aga veel leitud. Ainult naatriumdodetsüülsulfaat (0,03-1%) või naatriumdeoksükolaat (0,5-2%) põhjustas rakkude täieliku eemaldamise 24-tunnise töötlemise järel.

Loomkatses (koer ja siga) eemaldatud detsellulaarselt eemaldatud bioklappide (allograft ja ksenotransplantaat) histoloogiline uuring näitas retsipientide müofibroblastide osalist endoteeliseerumist ja sissekasvu klapipõhja, ilma kaltsifikatsiooni tunnusteta. Täheldati mõõdukat põletikulist infiltratsiooni. Detsellulaarselt eemaldatud SynerGraft™ klapi kliiniliste uuringute käigus tekkis aga varajane puudulikkus. Bioproteesi maatriksis tuvastati väljendunud põletikuline reaktsioon, mis oli algselt mittespetsiifiline ja millega kaasnes lümfotsütaarne reaktsioon. Bioproteesi düsfunktsioon ja degeneratsioon arenesid ühe aasta jooksul. Maatriksi rakkude koloniseerimist ei täheldatud, kuid tuvastati klappide kaltsifikatsioon ja preimplantaadi rakkude jäänused.

Endoteelirakkudega külvatud ja in vitro ning in vivo kultiveeritud rakuvabad maatriksid moodustasid klappide pinnale koherentse kihi ning natiivse struktuuriga külvatud interstitsiaalsed rakud näitasid oma võimet diferentseeruda. Bioreaktori dünaamilistes tingimustes ei olnud aga võimalik saavutada maatriksile vajalikku füsioloogilist rakkude koloniseerimise taset ning implanteeritud tehisklappidega kaasnes kiirenenud rakkude proliferatsiooni ja rakuvälise maatriksi moodustumise tõttu üsna kiire (kolm kuud) paksenemine. Seega on doonorrakkudevabade maatriksite kasutamisel nende rakkudega koloniseerimiseks selles etapis mitmeid lahendamata probleeme, sealhulgas immunoloogilised ja nakkuslikud; töö detsellulaarsete bioproteeside kallal jätkub.

Tuleb märkida, et kollageen on ka üks potentsiaalsetest bioloogilistest materjalidest biolagunemisvõimeliste maatriksite tootmiseks. Seda saab kasutada vahu, geeli või plaatide, käsnade ja kiudpõhise toorikuna. Kollageeni kasutamine on aga seotud mitmete tehnoloogiliste raskustega. Eelkõige on seda patsiendilt raske saada. Seetõttu on praegu enamik kollageenimaatrikseid loomset päritolu. Loomse kollageeni aeglane biolagundamine võib suurendada zoonoosidega nakatumise riski ning põhjustada immunoloogilisi ja põletikulisi reaktsioone.

Fibriin on veel üks kontrollitud biolagunevuse omadustega bioloogiline materjal. Kuna patsiendi verest saab valmistada fibriinigeele autoloogse maatriksi edasiseks tootmiseks, ei põhjusta sellise struktuuri implanteerimine selle toksilist lagunemist ega põletikulist reaktsiooni. Fibriinil on aga sellised puudused nagu difusioon ja leostumine keskkonda ning madalad mehaanilised omadused.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Sünteetilistest materjalidest valmistatud kunstlikud südameklapid

Kunstlikke südameklappe valmistatakse samuti sünteetilistest materjalidest. Mitmed klapimaatriksite valmistamise katsed põhinesid polüglaktiini, polüglükoolhappe (PGA), polüpiimhappe (PLA), PGA ja PLA kopolümeeri (PLGA) ning polühüdroksüalkanoaatide (PHA) kasutamisel. Väga poorset sünteetilist materjali saab saada punutud või punumata kiust ja soolade leostamise tehnoloogiat kasutades. Paljutõotav komposiitmaterjal (PGA/P4HB) maatriksite valmistamiseks saadakse polüglükoolhappe (PGA) punumata silmustest, mis on kaetud polü-4-hüdroksübutüraadiga (P4HB). Sellest materjalist valmistatud tehislikke südameklappe steriliseeritakse etüleenoksiidiga. Nende polümeeride silmuste märkimisväärne algne jäikus ja paksus, nende kiire ja kontrollimatu lagunemine, millega kaasneb happeliste tsütotoksiliste toodete vabanemine, nõuab aga edasist uurimist ja teiste materjalide otsimist.

Autoloogsete müofibroblastide koekultuuriplaatide kasutamine tugimaatriksite moodustamiseks karkassil, stimuleerides nende rakkude tootmist, on võimaldanud saada klapiproove aktiivsete elujõuliste rakkudega, mis on ümbritsetud rakuvälise maatriksiga. Nende klappide kudede mehaanilised omadused on aga implanteerimiseks veel ebapiisavad.

Loodava klapi nõutavat proliferatsiooni ja koeregeneratsiooni taset ei pruugita saavutada ainult rakkude ja maatriksi kombineerimisega. Rakkude geenide ekspressiooni ja koe moodustumist saab reguleerida või stimuleerida kasvufaktorite, tsütokiinide või hormoonide, mitogeensete faktorite või adhesioonifaktorite lisamisega maatriksitele ja karkassidele. Nende regulaatorite maatriksi biomaterjalidesse viimise võimalust uuritakse. Üldiselt on biokeemiliste stiimulite abil koeklapi moodustumise regulatsiooni kohta uuringutest märkimisväärselt puudus.

Sea ksenogeenne atsellulaarne kopsubioprotees Matrix P koosneb detsellulaarsest koest, mis on töödeldud AutoTissue GmbH spetsiaalse patenteeritud protseduuri abil, mis hõlmab töötlemist antibiootikumide, naatriumdeoksükolaadi ja alkoholiga. See Rahvusvahelise Standardiorganisatsiooni poolt heaks kiidetud töötlemismeetod elimineerib kõik elusrakud ja postrakulised struktuurid (fibroblastid, endoteelirakud, bakterid, viirused, seened, mükoplasma), säilitab rakuvälise maatriksi arhitektuuri, vähendab DNA ja RNA taset kudedes miinimumini, mis vähendab nullini sea endogeense retroviiruse (PERV) inimestele ülekandumise tõenäosust. Matrix P bioprotees koosneb ainult kollageenist ja elastiinist koos säilitatud struktuurilise integratsiooniga.

Lammaste katsetes registreeriti 11 kuud pärast Matrix P bioproteesi implanteerimist ümbritsevatest kudedest minimaalne reaktsioon koos hea ellujäämismääraga, mis oli eriti ilmne endokardi läikiva sisepinna puhul. Põletikulised reaktsioonid, klapilehtede paksenemine ja lühenemine praktiliselt puudusid. Samuti registreeriti Matrix P bioproteesi puhul madal kaltsiumisisaldus kudedes, mis oli statistiliselt oluline võrreldes glutaraldehüüdiga ravitud patsientidega.

Matrix P tehissüdameklapp kohandub iga patsiendi seisundiga mõne kuu jooksul pärast implanteerimist. Kontrollperioodi lõpus tehtud uuring näitas tervet rakuvälist maatriksit ja kokkuvallunud endoteeli. Matrix R ksenotransplantaat, mis implanteeriti 50-le kaasasündinud defektidega patsiendile Rossi protseduuri ajal aastatel 2002–2004, näitas paremat jõudlust ja madalamaid transvalvulaarse rõhu gradiente võrreldes krüokonserveeritud ja detsellulaarselt töödeldud SynerGraftMT allotransplantaatide ja glutaraldehüüdiga töödeldud karkassivabade bioproteesidega. Matrix P tehissüdameklapid on ette nähtud kopsuklapi asendamiseks parema vatsakese väljavoolutrakti rekonstrueerimise ajal kaasasündinud ja omandatud defektide korral tehtava kirurgilise sekkumise käigus ning kopsuklapi asendamise ajal Rossi protseduuri ajal. Need on saadaval neljas suuruses (siseläbimõõdu järgi): vastsündinutele (15–17 mm), lastele (18–21 mm), keskmistele (22–24 mm) ja täiskasvanutele (25–28 mm).

Koetehnoloogiliselt toodetud klappide väljatöötamise edusammud sõltuvad edusammudest klapirakkude bioloogias (sealhulgas geenide ekspressiooni ja regulatsiooni küsimustes), embrüogeense ja vanusega seotud klapi arengu uuringutest (sealhulgas angiogeensetest ja neurogeensetest teguritest), iga klapi biomehaanika täpsetest teadmistest, külvamiseks sobivate rakkude tuvastamisest ja optimaalsete maatriksite väljatöötamisest. Täiustatud koeklappide edasine arendamine nõuab põhjalikku arusaamist natiivsete klappide mehaaniliste ja struktuuriliste omaduste ning nende omaduste in vitro taasloomiseks vajalike stiimulite (bioloogiliste ja mehaaniliste) vahelisest seosest.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]