Molekulaargeneetilised meetodid pärilike haiguste diagnoosimiseks

DNA-tehnoloogia meetodeid kasutatakse mutantse geeni lokaliseerimise määramiseks konkreetses kromosoomis, mis vastutab teatud päriliku patoloogia vormide tekke eest. Kuna geen on DNA lõik ja geenimutatsioon on DNA primaarse struktuuri kahjustus (mutatsiooni all mõistetakse kõiki DNA järjestuse muutusi, olenemata nende lokaliseerimisest ja mõjust indiviidi elujõulisusele), siis on päriliku haigusega patsiendi metafaasikromosoomide preparaatide sondeerimise teel võimalik kindlaks teha patoloogilise geeni lokaliseerimine. Molekulaargeneetilised meetodid loovad võimalusi haiguste diagnoosimiseks muutunud DNA struktuuri tasandil, need võimaldavad meil määrata pärilike häirete lokaliseerimist. Molekulaargeneetilised meetodid suudavad tuvastada mutatsioone, mis on seotud isegi ühe aluse asendamisega.

Geeni identifitseerimise kõige olulisem etapp on selle eraldamine. DNA-d saab eraldada igat tüüpi kudedest ja rakkudest, mis sisaldavad tuuma. DNA eraldamise etapid hõlmavad järgmist: rakkude kiire lüüs, rakuliste organellide ja membraanide fragmentide eemaldamine tsentrifuugimise teel, valkude ensümaatiline lagundamine ja nende ekstraheerimine lahusest fenooli ja kloroformi abil, DNA molekulide kontsentreerimine sadestamise teel etanoolis.

Geneetikalaborites eraldatakse DNA kõige sagedamini vere leukotsüütidest, mille jaoks võetakse patsiendilt 5-20 ml venoosset verd steriilsesse katseklaasi antikoagulandi lahusega (hepariin). Seejärel eraldatakse leukotsüüdid ja töödeldakse neid vastavalt ülaltoodud etappidele.

Uurimismaterjali ettevalmistamise järgmine etapp on DNA "lõikamine" fragmentideks rangelt spetsiifilise alusjärjestusega piirkondades, mis viiakse läbi bakteriaalsete ensüümide - restriktsiooniendonukleaaside (restriktsiooniensüümide) abil. Restriktsiooniensüümid tunnevad kaheahelalises DNA molekulis ära spetsiifilised 4-6, harvemini 8-12 nukleotiidi järjestused ja jagavad selle fragmentideks nende järjestuste asukohtades, mida nimetatakse restriktsioonisaitideks. Saadud DNA restriktsioonifragmentide arvu määrab restriktsioonisaitide esinemise sagedus ja fragmentide suuruse määrab nende saitide jaotus algse DNA molekuli pikkuses. Mida sagedamini restriktsioonisaidid asuvad, seda lühemad on DNA fragmendid pärast restriktsiooni. Praegu on teada üle 500 erinevat tüüpi bakteriaalse päritoluga restriktsiooniensüümi ja igaüks neist ensüümidest tunneb ära oma spetsiifilise nukleotiidjärjestuse. Tulevikus saab restriktsioonisaite kasutada DNA geneetiliste markeritena. Restriktsiooni tulemusel moodustunud DNA fragmente saab pikkuse järgi järjestada elektroforeesi abil agaroos- või polüakrüülamiidgeelis ja seega saab määrata nende molekulmassi. Tavaliselt identifitseeritakse geelis olev DNA spetsiifilise värvimise (tavaliselt etiidiumibromiidiga) ja geeli vaatlemise teel läbivas ultraviolettvalguses. DNA lokalisatsioonikohad on värvitud punaseks. Inimestel aga, kui DNA-d töödeldakse mitme restriktsiooniensüümiga, moodustub nii palju erineva pikkusega fragmente, et neid ei saa elektroforeesiga eraldada, st elektroforeesil ei ole võimalik visuaalselt tuvastada üksikuid DNA fragmente (saadakse ühtlane värvumine kogu geeli pikkuses). Seetõttu kasutatakse soovitud DNA fragmentide identifitseerimiseks sellises geelis märgistatud DNA-sondidega hübridisatsioonimeetodit.

Iga üheahelaline DNA või RNA lõik on võimeline seonduma (hübridiseeruma) komplementaarse ahelaga, kusjuures guaniin seondub alati tsütosiiniga ja adeniin tümiiniga. Nii moodustub kaheahelaline molekul. Kui kloonitud geeni üheahelaline koopia märgistatakse radioaktiivse märgisega, saadakse sond. Sond on võimeline leidma komplementaarse DNA segmendi, mida seejärel saab autoradiograafia abil hõlpsasti tuvastada. Venitatud kromosoomide preparaati lisatud radioaktiivne sond võimaldab geeni lokaliseerida kindlale kromosoomile: DNA-sondi abil saab Southern blot'i abil tuvastada spetsiifilisi piirkondi. Hübridisatsioon toimub juhul, kui testitav DNA lõik sisaldab normaalset geeni. Juhul, kui esineb ebanormaalne nukleotiidjärjestus, st vastavad kromosoomistruktuurid sisaldavad mutantset geeni, hübridisatsiooni ei toimu, mis võimaldab määrata patoloogilise geeni lokaliseerimist.

DNA-sondide saamiseks kasutatakse geenikloonimise meetodit. Meetodi põhiolemus seisneb selles, et kloonimisosakesse, tavaliselt bakteriaalsesse plasmiidi (bakterirakkudes esinev ja antibiootikumiresistentsuse geene kandev rõngakujuline ekstrakromosomaalne DNA), sisestatakse geenile või geeni osale vastav DNA fragment ning seejärel paljundatakse sisestatud inimese geeniga plasmiidiga baktereid. Tänu plasmiidis toimuvatele sünteesiprotsessidele on võimalik saada miljardeid koopiaid inimese geenist või selle lõigust.

Saadud DNA koopiaid, mis on märgistatud radioaktiivse märgise või fluorokroomidega, kasutatakse seejärel sondidena, et otsida uuritud DNA molekulide hulgast komplementaarseid järjestusi.

Praegu on geenimutatsioonide diagnoosimiseks DNA-sondide abil palju erinevaid meetodeid.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]