Rakkude siirdamise piirangud, ohud ja tüsistused

Regeneratiivne plastiline meditsiin põhineb embrüonaalsete ja eellasrakkude toti- ja pluripotentsete omaduste kliinilisel rakendamisel, mis võimaldavad in vitro ja in vivo luua spetsiifilisi rakuliine, mis taasasustavad haige inimese kahjustatud kudesid ja organeid.

Inimese embrüonaalsete tüvirakkude ja definitiivsete kudede tüvirakkude (nn täiskasvanud tüvirakkude) reaalne võimalikkus terapeutilistel eesmärkidel ei ole enam kahtluse all. USA Riikliku ja Meditsiiniakadeemia (Tüvirakud ja tulevane regeneratiivne meditsiin, National Academy Press) ning USA Riikliku Terviseinstituudi (Tüvirakud ja tulevased uurimissuunad, Nat. Inst, of Health USA) eksperdid soovitavad aga tüvirakkude omaduste üksikasjalikumat uurimist katsetes piisavate bioloogiliste mudelitega ja kõigi siirdamise tagajärgede objektiivset hindamist ning alles seejärel tüvirakkude kasutamist kliinikus.

On kindlaks tehtud, et tüvirakud on osa kõigi kolme idukihi koederivaatidest. Tüvirakke leidub võrkkestas, sarvkestas, naha epidermises, luuüdis ja perifeerses veres, veresoontes, hambapulbis, neerudes, seedetrakti epiteelis, kõhunäärmes ja maksas. Kaasaegsete meetodite abil on tõestatud, et närvitüvirakud lokaliseeruvad täiskasvanu ajus ja seljaajus. Need sensatsioonilised andmed äratasid teadlaste ja meedia erilist tähelepanu, kuna aju neuronid olid klassikaline näide staatilisest rakkude populatsioonist, mis ei taastu. Nii ontogeneesi varases kui ka hilises perioodis moodustuvad loomade ja inimeste ajus närvitüvirakkude tõttu neuronid, astrotsüüdid ja oligodendrotsüüdid (Tüvirakud: teaduslik progress ja tulevased uurimissuunad. Nat. Inst, of Health USA).

Normaalsetes tingimustes aga lõplike kudede tüvirakkude plastilisus ei avaldu. Definitiivsete kudede tüvirakkude plastilise potentsiaali realiseerimiseks tuleb need isoleerida ja seejärel kultiveerida tsütokiinidega (LIF, EGF, FGF) keskkonnas. Lisaks sellele siirduvad tüvirakkude derivaadid edukalt ainult siis, kui need siirdatakse nõrgenenud immuunsüsteemiga looma kehasse (γ-kiiritus, tsütostaatikumid, busulfaan jne). Praeguseks ei ole saadud veenvaid tõendeid tüvirakkude plastilisuse rakendamise kohta loomadel, kes ei ole kokku puutunud kiirguse või muude sügavat immunosupressiooni põhjustavate mõjudega.

Sellistes tingimustes avaldub ESC-de ohtlik potentsiaal eelkõige nende siirdamisel ektoopilistesse piirkondadesse - ESC-de subkutaanse süstimise ajal immuunpuudulikkusega hiirtele tekivad süstekohas teratokartsinoomid. Lisaks on inimese embrüo arengu ajal kromosomaalsete anomaaliate esinemissagedus suurem kui loomade embrüogeneesis. Blastotsüsti staadiumis koosneb ainult 20-25% inimese embrüotest normaalse karüotüübiga rakkudest ja valdav enamus in vitro viljastamise järgselt saadud varajastest inimese embrüotest omab kaootilist kromosomaalset mosaiiksust ning esineb väga sageli arvulisi ja struktuurilisi aberratsioone.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Tüvirakkude kasulik mõju

Kliiniliste uuringute esialgsed tulemused kinnitavad tüvirakkude kasulikku mõju patsiendile, kuid rakkude siirdamise pikaajalise mõju kohta teave puudub endiselt. Algselt domineerisid kirjanduses teated embrüonaalsete ajufragmentide siirdamise positiivsetest tulemustest Parkinsoni tõve korral, kuid seejärel hakkasid ilmuma andmed, mis eitasid patsientide ajju siirdatud embrüonaalse või loote närvikoe efektiivset terapeutilist toimet.

20. sajandi keskel avastati esmakordselt vereloome taastumine surmavalt kiiritatud loomadel pärast luuüdi rakkude intravenoosset transfusiooni ning 1969. aastal viis Ameerika teadlane D. Thomas läbi esimese luuüdi siirdamise inimestel. Doonori ja retsipiendi luuüdi rakkude immunoloogilise kokkusobimatuse mehhanismide kohta sel ajal puudulikud teadmised viisid kõrge suremuseni sagedase siirdamise ebaõnnestumise ja transplantaadi-peremehe reaktsiooni tekke tõttu. Peamise histosobivuskompleksi, mis hõlmab inimese leukotsüütide antigeene (HbA), avastamine ja nende tüpiseerimismeetodite täiustamine võimaldasid oluliselt suurendada elulemust pärast luuüdi siirdamist, mis viis selle ravimeetodi laialdase kasutamiseni onkohematoloogias. Kümme aastat hiljem tehti esimesed perifeersest verest leukafereesi abil saadud vereloome tüvirakkude (HSC) siirdamised. 1988. aastal kasutati Prantsusmaal nabanööri verd esmakordselt HSC-de allikana Fanconi aneemiaga lapse ravimiseks ning alates 2000. aasta lõpust on ajakirjanduses ilmunud teateid HSC-de võimest diferentseeruda erinevat tüüpi kudedeks, mis potentsiaalselt laiendab nende kliinilise rakenduse ulatust. Selgus aga, et siirdamismaterjal sisaldab koos HSC-dega märkimisväärsel hulgal erineva iseloomu ja omadustega mittehematopoeetilisi rakkude lisandeid. Sellega seoses töötatakse välja siiriku puhastamise meetodeid ja selle rakulise puhtuse hindamise kriteeriume. Eelkõige kasutatakse CD34+ rakkude positiivset immunoselektsiooni, mis võimaldab HSC-sid eraldada monoklonaalsete antikehade abil.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Tüvirakkude ravi tüsistused

Luuüdi siirdamise tüsistused on kõige sagedamini hematoloogilised ja seotud pikaajalise iatrogeense pantsütopeeniaga. Kõige sagedamini tekivad nakkuslikud tüsistused, aneemia ja hemorraagia. Sellega seoses on äärmiselt oluline valida optimaalne luuüdi kogumise, töötlemise ja säilitamise viis tüvirakkude maksimaalseks säilitamiseks, mis tagab vereloome kiire ja stabiilse taastamise. Siirdamise iseloomustamisel hinnatakse praegu tavaliselt järgmisi parameetreid: mononukleaarsete ja/või tuumaliste rakkude arv, kolooniat moodustavate ühikute arv ja CD34-positiivsete rakkude sisaldus. Kahjuks annavad need näitajad vaid kaudse hinnangu siirdamise tüvirakkude populatsiooni tegelikule vereloomevõimele. Tänapäeval puuduvad absoluutselt täpsed parameetrid, mis määraksid siirdamise piisavuse patsientide vereloome pikaajaliseks taastamiseks, isegi autoloogse luuüdi siirdamise korral. Üldiste kriteeriumide väljatöötamine on äärmiselt keeruline siirdamise töötlemise, krüokonserveerimise ja testimise rangete standardite puudumise tõttu. Lisaks on vaja arvestada kõigi teguritega, mis mõjutavad vereloome eduka taastamise parameetreid iga patsiendi puhul individuaalselt. Autoloogse luuüdi siirdamise puhul on olulisemad neist eelnevate keemiaravi kuuride arv, konditsioneerimisrežiimi omadused, haiguse periood, mille jooksul luuüdi koguti, ja kolooniaid stimuleerivate faktorite kasutamise skeemid siirdamisjärgsel perioodil. Lisaks ei tohiks unustada, et siirdamiseelsel keemiaravi võib luuüdi tüvirakkudele negatiivselt mõjuda.

Raskete toksiliste tüsistuste esinemissagedus suureneb allogeense luuüdi siirdamise ajal märkimisväärselt. Sellega seoses pakuvad huvi statistilised andmed allogeense luuüdi siirdamise kohta talasseemia korral. Euroopa Luuüdi Siirdamise Grupi aruanded on registreerinud umbes 800 luuüdi siirdamist talasseemia majoriga patsientidele. Allogeenset siirdamist talasseemia korral tehakse valdaval enamikul juhtudel HLA-identsetelt õdedel-vendadelt, mis on seotud raskete tüsistuste ja kõrge suremusega tüvirakkude materjali siirdamisel osaliselt ühilduvatelt sugulastelt või ühilduvatelt mitteseotud doonoritelt. Surmaga lõppevate nakkuslike tüsistuste riski minimeerimiseks paigutatakse patsiendid isoleeritud aseptilistesse kastidesse laminaarse õhuvooluga ja neile antakse madala või abakteriaalse dieedi. Soolestiku bakteriaalseks dekontaminatsiooniks määratakse suukaudselt antibiootikumide ja seenevastaste ravimite mitteresorbeeruvaid vorme. Profülaktikaks manustatakse amfoteritsiin B-d intravenoosselt. Süsteemsete infektsioonide ennetamist tugevdatakse amikatsiini ja tseftasidiimiga, mis määratakse siirdamisele eelneval päeval, jätkates ravi kuni patsiendi väljakirjutamiseni. Kõiki vereprodukte kiiritatakse enne vereülekannet annuses 30 Gy. Parenteraalne toitumine siirdamise ajal on vajalik tingimus ja algab kohe pärast toidu tarbimise piiramist loomulikul viisil.

Immunosupressiivsete ravimite kõrge toksilisusega kaasneb hulk tüsistusi, mis sageli põhjustavad iiveldust, oksendamist ja mukosiiti, neerukahjustusi ja interstitsiaalset kopsupõletikku. Üks keemiaravi raskemaid tüsistusi on maksa veno-oklusiivne haigus, mis viib surmani varases siirdamisjärgses perioodis. Maksa portaalsüsteemi veenide tromboosi riskifaktoriteks on patsientide vanus, hepatiidi ja maksafibroosi esinemine, samuti immunosupressiivne ravi pärast luuüdi siirdamist. Veno-oklusiivne haigus on eriti ohtlik talasseemia korral, millega kaasneb maksa hemosideroos, hepatiit ja fibroos - vereülekanderavi sagedased kaaslased. Maksa portaalsüsteemi veenide tromboos tekib 1-2 nädalat pärast siirdamist ja seda iseloomustab bilirubiini ja transaminaaside aktiivsuse kiire tõus veres, hepatomegaalia progresseerumine, astsiit, entsefalopaatia ja valu ülakõhus. Histoloogiliselt näitab lahkamismaterjal endoteeli kahjustusi, subendoteliaalseid hemorraagiaid, tsentrilobulaarsete hepatotsüütide kahjustusi, maksa veenide ja tsentraalsete veenide trombootilist obstruktsiooni. Talasseemiaga patsientidel on kirjeldatud tsütostaatikumide toksilise toimega seotud surmaga lõppenud südameseiskuse juhtumeid.

Siirdamiseelsel perioodil põhjustavad tsüklofosfamiid ja busulfaan sageli toksilis-hemorraagilist tsüstiiti koos uroepiteliaalrakkude patoloogiliste muutustega. Tsüklosporiin A kasutamisega luuüdi siirdamisel kaasneb sageli nefro- ja neurotoksilisus, hüpertensioonisündroom, vedelikupeetus organismis ja hepatotsüütide tsütolüüs. Seksuaal- ja reproduktiivfunktsiooni häireid täheldatakse sagedamini naistel. Väikelastel puberteedi areng pärast siirdamist tavaliselt ei mõjutatud, kuid vanematel lastel võib suguelundite arengu patoloogia olla väga tõsine - kuni steriilsuseni. Siirdamisega otseselt seotud tüsistuste hulka kuuluvad allogeensete luuüdirakkude äratõukereaktsioon, ABO kokkusobimatus, transplantaadi-peremehe vastu suunatud haiguse ägedad ja kroonilised vormid.

ABO-ühildumatu luuüdi siirdamise läbinud patsientidel toodetakse peremeesorganismi ja ABO-doonori isoaglutiniine 330–605 päeva pärast siirdamist, mis võib viia pikaajalise hemolüüsini ja suurendada dramaatiliselt vereülekannete vajadust. Seda tüsistust saab ennetada ainult 0. tüüpi punaste vereliblede ülekandega. Pärast siirdamist tekib mõnedel patsientidel autoimmuunne neutropeenia, trombotsütopeenia või pantsütopeenia, mille korrigeerimiseks on vaja splenektoomiat.

35–40%-l retsipientidest tekib äge transplantaadi-peremehe vastu haigus 100 päeva jooksul pärast allogeenset HLA-identset luuüdi siirdamist. Naha, maksa ja soolte haaratuse aste varieerub lööbest, kõhulahtisusest ja mõõdukast hüperbilirubineemiast kuni naha ketenduse, soolesulguse ja ägeda maksapuudulikkuseni. Talasseemiaga patsientidel on I astme ägeda transplantaadi-peremehe vastu haiguse esinemissagedus pärast luuüdi siirdamist 75% ning II ja kõrgema astme puhul 11–53%. Krooniline transplantaadi-peremehe vastu haigus süsteemse mitme organi sündroomina tekib tavaliselt 100–500 päeva jooksul pärast allogeenset luuüdi siirdamist 30–50%-l patsientidest. Kahjustatud on nahk, suuõõne, maks, silmad, söögitoru ja ülemised hingamisteed. Eristatakse piiratud vormi kroonilist transplantaadi-peremehe vastu haigust, kui kahjustatud on nahk ja/või maks, ja laialt levinud vormi, kui üldised nahakahjustused on kombineeritud kroonilise agressiivse hepatiidi, silmade, süljenäärmete või mõne muu organi kahjustustega. Surma põhjustavad sageli raske immuunpuudulikkuse tagajärjel tekkinud nakkuslikud tüsistused. Talasseemia korral esineb kerge vorm kroonilist transplantaadi-peremehe vastu suunatud haigust 12%-l, mõõdukat vormi 3%-l ja rasket vormi 0,9%-l allogeense HLA-ühilduva luuüdi retsipientidest. Luuüdi siirdamise raske tüsistus on siiriku äratõukereaktsioon, mis tekib 50–130 päeva pärast operatsiooni. Äratõukereaktsiooni sagedus sõltub ettevalmistavast raviskeemist. Eelkõige talasseemiaga patsientidel, kes said ettevalmistusperioodil ainult metotreksaati, täheldati luuüdi siirdamise äratõukereaktsiooni 26%-l juhtudest, metotreksaadi ja tsüklosporiin A kombinatsiooniga 9%-l juhtudest ja ainult tsüklosporiin A manustamisega 8%-l juhtudest (Gaziev jt, 1995).

Luuüdi siirdamise järgseid nakkuslikke tüsistusi põhjustavad viirused, bakterid ja seened. Nende teke on seotud sügava neutropeeniaga, mille on esile kutsunud keemiaravi ravimid konditsioneerimisperioodil, limaskestade kahjustusega tsütostaatikumide poolt ja transplantaadi-peremehe reaktsiooniga. Sõltuvalt arengu ajast eristatakse nakkuslike tüsistuste kolme faasi. Esimeses faasis (areneb esimesel kuul pärast siirdamist) domineerivad limaskestade kahjustused ja neutropeenia, millega sageli kaasnevad viirusinfektsioonid (herpes, Epsteini-Barri viirus, tsütomegaloviirus, Varicella zoster), samuti grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite, Candida seente ja aspergillide põhjustatud infektsioonid. Varasel siirdamisjärgsel perioodil (teisel ja kolmandal kuul pärast siirdamist) on kõige raskem infektsioon tsütomegaloviirus, mis sageli viib nakkuslike tüsistuste teises faasis patsientide surmani. Talasseemia korral tekib tsütomegaloviirusinfektsioon pärast luuüdi siirdamist 1,7–4,4%-l retsipientidest. Kolmas faas täheldatakse hilisel siirdamisjärgsel perioodil (kolm kuud pärast operatsiooni) ja seda iseloomustab raske kombineeritud immuunpuudulikkus. Sel perioodil on sagedased Varicella zosteri, streptokoki, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidise, Haemophilus influenzae ja hepatotroopsete viiruste põhjustatud infektsioonid. Talasseemia korral on patsientide suremus pärast luuüdi siirdamist seotud bakteriaalse ja seensepsisega, idiopaatilise interstitsiaalse ja tsütomegaloviiruse põhjustatud kopsupõletikuga, ägeda respiratoorse distressi sündroomiga, ägeda südamepuudulikkusega, südametamponaadiga, ajuverejooksuga, veno-oklusiivse maksahaigusega ja ägeda transplantaadi-peremehe vastu suunatud haigusega.

Praegu on saavutatud teatavat edu luuüdist vereloome tüvirakkude puhaste populatsioonide eraldamise meetodite väljatöötamisel. Nabanöörist lootevere saamise tehnikat on täiustatud ja loodud meetodid vereloome rakkude eraldamiseks nabaväädiverest. Teaduspressis on teateid, et vereloome tüvirakud on võimelised paljunema tsütokiinidega söötmes kasvatamisel. Spetsiaalselt loodud bioreaktorite kasutamisel vereloome tüvirakkude laiendamiseks suureneb luuüdist, perifeersest verest või nabanööriverest eraldatud vereloome tüvirakkude biomass märkimisväärselt. Hematopoeetiliste tüvirakkude laiendamise võimalus on oluline samm rakkude siirdamise kliinilise arengu suunas.

Enne vereloome tüvirakkude in vitro paljundamist on siiski vaja isoleerida homogeenne vereloome tüvirakkude populatsioon. Tavaliselt saavutatakse see markerite abil, mis võimaldavad vereloome tüvirakke selektiivselt märgistada monoklonaalsete antikehadega, mis on kovalentselt seotud fluorestsents- või magnetmärgisega, ja neid sobiva rakusorteerija abil isoleerida. Samal ajal pole vereloome tüvirakkude fenotüüpiliste omaduste küsimus lõplikult lahendatud. A. Petrenko ja V. Grishchenko (2003) peavad vereloome tüvirakkude kandidaatideks rakke, mille pinnal on CD34, AC133 ja Thyl antigeenid ning puuduvad CD38, HLA-DR või muud diferentseerumismarkerid (rakud CD34+Liir fenotüübiga). Liinide (Lin) markerite hulka kuuluvad glükoforiin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). CD34+CD45RalüW CD71low fenotüübiga rakke, aga ka CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low fenotüübiga rakke peetakse siirdamiseks paljulubavateks.

Probleemiks on endiselt hematopoeetiliste tüvirakkude piisava arvu olemasolu efektiivseks siirdamiseks. Praegu on hematopoeetiliste tüvirakkude allikateks luuüdi, perifeerne ja nabaväädi veri ning embrüonaalne maks. Hematopoeetiliste tüvirakkude laiendamine saavutatakse nende kultiveerimise teel endoteelirakkude ja hematopoeetiliste kasvufaktorite juuresolekul. Erinevates protokollides kasutatakse HSC proliferatsiooni esilekutsumiseks müeloproteiine, SCF-i, erütropoetiini, insuliinilaadseid kasvufaktoreid, kortikosteroide ja östrogeene. Tsütokiinide kombinatsioonide kasutamisel in vitro on võimalik saavutada HSC-de hulga märkimisväärne suurenemine, mille maksimaalne toodang saavutatakse teise kultiveerimisnädala lõpus.

Traditsiooniliselt kasutatakse nabaväädivere vereloome tüvirakkude siirdamist peamiselt hemoblastooside korral. Eduka nabaväädivere siirdamise jaoks vajalik vereloomerakkude minimaalne annus on aga 3,7 x 107 ^tuumaga rakku 1 kg retsipiendi kehakaalu kohta. Väiksema arvu nabaväädivere vereloome tüvirakkude kasutamine suurendab oluliselt siiriku ebaõnnestumise ja haiguse taastekke riski. Seetõttu kasutatakse nabaväädivere vereloome tüvirakkude siirdamist peamiselt laste hemoblastooside raviks.

Kahjuks puuduvad endiselt nabaväädivere vereloomerakkude hankimise standardid või standardiseeritud protokollid kliiniliseks kasutamiseks. Seega ei ole nabaväädivere tüvirakud ise seaduslikult tunnustatud vereloomerakkude allikaks siirdamiseks. Lisaks puuduvad välismaal eetilised või õiguslikud normid, mis reguleeriksid nabaväädiverepankade tegevust ja korraldust. Samal ajal tuleb ohutu siirdamise tagamiseks kõiki nabaväädivere proove hoolikalt jälgida. Enne rasedalt vere võtmist tuleb saada tema nõusolek. Iga rasedat tuleb uurida HBsAg kandluse, C-hepatiidi, HIV ja süüfilise viiruste vastaste antikehade olemasolu suhtes. Iga nabaväädivere proovi tuleb standardina testida tuumaliste rakkude arvu, CD34+ ja kolooniate moodustamise võime suhtes. Lisaks tehakse HbA tüpiseerimine, veregrupi määramine ABO järgi ja selle kuuluvuse määramine Rh-faktori järgi. Vajalikud testimisprotseduurid on bakterioloogiline kultiveerimine steriilsuse hindamiseks, seroloogilised testid HIV-1 ja HIV-2 infektsioonide, HBsAg, viirushepatiidi C, tsütomegaloviiruse infektsiooni, HTLY-1 ja HTLY-II, süüfilise ja toksoplasmoosi suhtes. Lisaks tehakse tsütomegaloviiruse ja HIV-nakkuste avastamiseks polümeraasi ahelreaktsiooni. Soovitatav on testimisprotokolle täiendada nabaväädivere GSC analüüsiga, et avastada selliseid geneetilisi haigusi nagu a-talasseemia, sirprakuline aneemia, adenosiindeaminaasi puudulikkus, Brutoni agammaglobulineemia, Hurleri ja Ponteri tõved.

Siirdamiseks ettevalmistamise järgmine etapp on vereloome tüvirakkude säilitamise küsimus. Rakkude elujõulisuse seisukohast on ettevalmistamise ajal kõige ohtlikumad protseduurid külmutamine ja sulatamine. Vereloomerakkude külmutamisel võib märkimisväärne osa neist kristallide moodustumise tõttu hävida. Rakkude surma protsendi vähendamiseks kasutatakse spetsiaalseid aineid - krüoprotektoreid. Kõige sagedamini kasutatakse krüoprotektorina DMSO-d lõppkontsentratsioonis 10%. Sellises kontsentratsioonis DMSO-le on aga iseloomulik otsene tsütotoksiline toime, mis avaldub isegi minimaalse kokkupuute korral. Tsütotoksilise toime vähenemine saavutatakse kokkupuuterežiimi nulltemperatuuri range säilitamisega, samuti materjali töötlemise eeskirjade järgimisega sulatamise ajal ja pärast seda (kõigi manipulatsioonide kiirus, mitmete pesuprotseduuride kasutamine). Alla 5% DMSO kontsentratsioone ei tohiks kasutada, kuna see põhjustab vereloomerakkude massilist surma külmutamise ajal.

Erütrotsüütide lisandite olemasolu vereloome tüvirakkude suspensioonisegus tekitab ohu erütrotsüütide antigeenide kokkusobimatusreaktsiooni tekkeks. Samal ajal, kui erütrotsüüdid eemaldatakse, suureneb vereloomerakkude kadu märkimisväärselt. Sellega seoses on välja pakutud vereloome tüvirakkude fraktsioneerimata eraldamise meetod. Sel juhul kasutatakse tuumaliste rakkude kaitsmiseks madalate temperatuuride kahjuliku mõju eest 10% DMSO lahust ja konstantse kiirusega jahutamist (GS/min) temperatuurini -80 °C, mille järel rakkude suspensioon külmutatakse vedelas lämmastikus. Arvatakse, et see krüokonserveerimismeetod põhjustab erütrotsüütide osalist lüüsi, seega ei vaja vereproovid fraktsioneerimist. Enne siirdamist rakkude suspensioon sulatatakse, pestakse vabast hemoglobiinist ja DMSO-st inimese albumiini lahuses või vereseerumis. Hematopoeetiliste prekursorite säilivus selle meetodi abil on tõepoolest suurem kui pärast nabanööri vere fraktsioneerimist, kuid ABO-ühildumatute erütrotsüütide ülekande tõttu vereülekande tüsistuste oht jääb püsima.

HLA-testitud ja tüpiseeritud HSC proovide säilitamiseks mõeldud pangandussüsteemi loomine võiks lahendada ülaltoodud probleemid. See nõuab aga eetiliste ja õiguslike normide väljatöötamist, mida praegu alles arutatakse. Enne pangandusvõrgu loomist on vaja vastu võtta hulk eeskirju ja dokumente HSC kogumise, fraktsioneerimise, testimise ja tüpiseerimise ning krüokonserveerimise protseduuride standardiseerimise kohta. HSC pankade tõhusa toimimise kohustuslik tingimus on arvutibaasi korraldamine suhtlemiseks Maailma Luuüdi Doonori Assotsiatsiooni (WMDA) ja Ameerika Ühendriikide Riikliku Luuüdi Doonori Programmi (NMDP) registritega.

Lisaks on vaja optimeerida ja standardiseerida in vitro HSC-de, eelkõige nabaväädivere hematopoeetiliste rakkude laiendamise meetodeid. Nabaväädivere HSC-de laiendamine on vajalik HLA-süsteemiga ühilduvate potentsiaalsete retsipientide arvu suurendamiseks. Nabaväädivere väikeste mahtude tõttu ei ole selles sisalduvate HSC-de arv tavaliselt võimeline tagama luuüdi taasasustamist täiskasvanud patsientidel. Samal ajal on mitteseotud siirdamiste tegemiseks vajalik juurdepääs piisavale arvule tüpiseeritud HSC-proovidele (10 000 kuni 1 500 000 retsipiendi kohta).

Hematopoeetiliste tüvirakkude siirdamine ei kõrvalda luuüdi siirdamisega kaasnevaid tüsistusi. Analüüs näitab, et nabaväädivere tüvirakkude siirdamise korral tekivad ägeda transplantaadi-peremehe vastu suunatud haiguse rasked vormid 23%-l ja kroonilised vormid 25%-l retsipientidest. Onkohematoloogilistel patsientidel on ägeda leukeemia ägenemisi esimesel aastal pärast nabaväädivere tüvirakkude siirdamist täheldatud 26%-l juhtudest.

Viimastel aastatel on perifeersete vereloome tüvirakkude siirdamise meetodid intensiivselt arenenud. HSC-de sisaldus perifeerses veres on nii väike (1 HSC 100 000 vereraku kohta), et nende eraldamine ilma spetsiaalse ettevalmistuseta pole mõttekas. Seetõttu tehakse doonorile esmalt luuüdi vereloomerakkude verre vabanemise stimuleerimise ravimkuur. Sel eesmärgil kasutatakse selliseid mitte-kahjutuid ravimeid nagu tsüklofosfamiid ja granulotsüütide kolooniat stimuleeriv faktor. Kuid isegi pärast HSC-de perifeersesse verre mobiliseerimise protseduuri ei ületa CD34+ rakkude sisaldus selles 1,6%.

Hematopoeetiliste tüvirakkude mobiliseerimiseks kliinikus kasutatakse kõige sagedamini S-SEC-i, mida iseloomustab suhteliselt hea taluvus, välja arvatud peaaegu loomulik luuvalu esinemine. Tuleb märkida, et tänapäevaste vereseparaatorite kasutamine võimaldab hematopoeetilisi tüvirakke tõhusalt isoleerida. Normaalsetes vereloome tingimustes tuleb aga läbi viia vähemalt 6 protseduuri, et saada piisav arv hematopoeetilisi tüvirakke, mille taasasustamisvõime on võrreldav luuüdi suspensiooniga. Iga selline protseduur nõuab separaatoril 10–12 liitri vere töötlemist, mis võib põhjustada trombotsütopeeniat ja leukopeeniat. Eraldusprotseduur hõlmab doonorile antikoagulandi (naatriumtsitraadi) sissetoomist, mis aga ei välista trombotsüütide kontaktaktivatsiooni kehavälise tsentrifuugimise ajal. Need tegurid loovad tingimused nakkuslike ja hemorraagiliste tüsistuste tekkeks. Meetodi teine puudus on mobiliseerimisreaktsiooni oluline varieeruvus, mis nõuab HSC-de sisalduse jälgimist doonorite perifeerses veres, mis on vajalik nende maksimaalse taseme määramiseks.

Erinevalt allogeensest siirdamisest välistab vereloome tüvirakkude autogeenne siirdamine täielikult äratõukereaktsiooni tekke. Hematopoeetiliste tüvirakkude autotransplantatsiooni oluliseks puuduseks, mis piirab selle rakendamise näidustuste ringi, on leukeemiliste kloonrakkude taasinfusiooni suur tõenäosus siirdamisega. Lisaks suurendab immuunvahendatud "transplantaadi versus kasvaja" efekti puudumine oluliselt pahaloomuliste verehaiguste retsidiivide sagedust. Seetõttu on müelodüsplastiliste sündroomide korral ainus radikaalne meetod neoplastilise klonaalse vereloome kõrvaldamiseks ja normaalse polüklonaalse vereloome taastamiseks intensiivne polükemoteraapia koos allogeense vereloome siirdamisega.

Kuid isegi sel juhul on enamiku hemoblastooside ravi suunatud ainult patsientide elulemuse pikendamisele ja nende elukvaliteedi parandamisele. Mitmete suurte uuringute kohaselt saavutatakse pikaajaline retsidiivivaba elulemus pärast HSC-de allotransplantatsiooni 40%-l onkohematoloogilistest patsientidest. HLA-ga ühilduva õe-venna tüvirakkude kasutamisel on parimad tulemused täheldatud noortel patsientidel, kellel on lühike haiguse anamnees, blastrakkude arv kuni 10% ja soodne tsütogeneetika. Kahjuks on HSC-de allotransplantatsiooni protseduuriga seotud suremus müelodüsplastiliste haigustega patsientidel endiselt kõrge (enamikus aruannetes - umbes 40%). USA riikliku luuüdidoonorluse programmi 10-aastase töö tulemused (510 patsienti, keskmine vanus - 38 aastat) näitavad, et retsidiivivaba elulemus kahe aasta jooksul on 29%, kusjuures retsidiivi tõenäosus on suhteliselt madal (14%). Siiski on HSC-de allotransplantatsiooni protseduuriga seotud suremus mitteseotud doonorilt äärmiselt kõrge ja ulatub kahe aasta jooksul 54%-ni. Sarnaseid tulemusi saadi ka Euroopa uuringus (118 patsienti, mediaanvanus - 24 aastat, kaheaastane retsidiivivaba elulemus - 28%, retsidiiv - 35%, suremus - 58%).

Intensiivsete keemiaravikuuride ajal, millele järgneb vereloome taastamine allogeensete hematopoeetiliste rakkudega, tekivad sageli immunohematoloogilisi ja transfusioonikomplikatsioone. Need on suuresti tingitud asjaolust, et inimese veregrupid päranduvad MHC molekulidest sõltumatult. Seega, isegi kui doonor ja retsipient on peamiste HLA antigeenide osas ühilduvad, võivad nende erütrotsüütidel olla erinevad fenotüübid. Eristatakse „suurt“ kokkusobimatust, kui retsipiendil on eelnevalt olemas antikehad doonori erütrotsüütide antigeenide vastu, ja „väikset“ kokkusobimatust, kui doonoril on antikehad retsipienti erütrotsüütide antigeenide vastu. Võimalikud on „suure“ ja „väiksema“ kokkusobimatuse kombinatsiooni juhtumid.

Hemoblastooside korral luuüdi ja nabaväädivere vereloome tüvirakkude allotransplantatsiooni kliinilise efektiivsuse võrdleva analüüsi tulemused näitavad, et lastel pärast nabaväädivere vereloome tüvirakkude allotransplantatsiooni on transplantaadi-peremehe reaktsiooni tekkimise risk oluliselt vähenenud, kuid neutrofiilide ja trombotsüütide arvu taastumine kestab kauem ning 100-päevase siirdamisjärgse suremuse esinemissagedus on suurem.

Varajase suremuse põhjuste uurimine võimaldas selgitada allogeense HSC siirdamise vastunäidustusi, millest kõige olulisemad on:

• tsütomegaloviiruse infektsiooni positiivsete testide olemasolu retsipiendil või doonoril (ilma ennetava ravita);
• äge kiiritushaigus;
• patsiendil esineva seeninfektsiooni olemasolu või isegi kahtlus selle esinemises (ilma süsteemse varajase profülaktikata fungitsiidsete ravimitega);
• hemoblastoos, mille puhul patsiendid said pikaajalist ravi tsütostaatikumidega (suure äkilise südameseiskuse ja mitme organi puudulikkuse tõenäosuse tõttu);
• siirdamine HLA-mitteidentsetelt doonoritelt (ilma ägeda transplantaadi-peremehe reaktsiooni profülaktikata tsüklosporiin A-ga);
• krooniline viirushepatiit C (maksa venoosse oklusioonihaiguse tekke kõrge riski tõttu).

Seega võib HSC siirdamine põhjustada tõsiseid tüsistusi, mis sageli lõppevad surmaga. Varasel (kuni 100 päeva pärast siirdamist) perioodil on nende hulka nakkuslikud tüsistused, äge transplantaadi-peremehe vastu suunatud haigus, transplantaadi äratõukereaktsioon (doonori HSC-de ebaõnnestumine), veno-oklusiivne maksahaigus, samuti konditsioneerimisrežiimi toksilisusest tingitud koekahjustused, mida iseloomustab kõrge ümberehituse määr (nahk, veresoonte endoteel, sooleepiteel). Hilise siirdamisjärgse perioodi tüsistuste hulka kuuluvad krooniline transplantaadi-peremehe vastu suunatud haigus, põhihaiguse ägenemised, laste kasvupeetus, reproduktiivsüsteemi ja kilpnäärme talitlushäired ning silmakahjustused.

Hiljuti seoses luuüdi rakkude plastilisust käsitlevate publikatsioonidega on tekkinud idee kasutada HSC-sid südameatakkide ja teiste haiguste raviks. Kuigi mõned loomkatsed toetavad seda võimalust, vajavad luuüdi rakkude plastilisuse kohta tehtud järeldused kinnitamist. Seda asjaolu peaksid arvesse võtma need teadlased, kes usuvad, et siirdatud inimese luuüdi rakud transformeeruvad kergesti skeletilihaste, müokardi või kesknärvisüsteemi rakkudeks. Hüpotees, et HSC-d on nende organite loomulik rakuline regeneratsiooni allikas, vajab tõsiseid tõendeid.

Eelkõige avaldati V. Belenkovi (2003) avatud randomiseeritud uuringu esimesed tulemused. Selle eesmärk oli uurida C-SvK (st autoloogsete HSC-de mobiliseerimine verre) mõju mõõduka kuni raske kroonilise südamepuudulikkusega patsientide kliinilisele, hemodünaamilisele ja neurohumoraalsele seisundile, samuti hinnata selle ohutust standardravi (angiotensiini konverteeriva ensüümi inhibiitorid, beetablokaatorid, diureetikumid, südameglükosiidid) taustal. Uuringu tulemuste esimeses avaldamises märgivad programmi autorid, et ainus argument O-SvK kasuks on ühe patsiendi ravi tulemused, kellel selle ravimiga ravi taustal täheldati kõigi kliiniliste ja hemodünaamiliste parameetrite vaieldamatut paranemist. Siiski ei leidnud kinnitust HSC-de mobiliseerimise teooria vereringesse koos järgneva müokardi regeneratsiooniga infarktijärgses tsoonis - isegi positiivse kliinilise dünaamikaga patsiendil ei näidanud dobutamiiniga tehtud stress-ehhokardiograafia elujõuliste müokardi tsoonide ilmumist armi piirkonnas.

Tuleb märkida, et praegu on asendusrakuteraapia laialdaseks rakendamiseks igapäevases kliinilises praktikas soovitamiseks selgelt ebapiisavalt andmeid. Regeneratiivse rakuteraapia erinevate võimaluste efektiivsuse kindlakstegemiseks, selle näidustuste ja vastunäidustuste väljatöötamiseks ning regeneratiiv-plastilise ravi ja traditsioonilise kirurgilise või konservatiivse ravi kombineeritud kasutamise juhiste väljatöötamiseks on vaja hästi kavandatud ja kvaliteetseid kliinilisi uuringuid. Küsimusele, milline konkreetne luuüdirakkude populatsioon (tüvivereloome- või stroomarakud) võib anda alust neuronitele ja kardiomüotsüütidele, pole endiselt vastust ning samuti on ebaselge, millised tingimused sellele in vivo kaasa aitavad.

Töö nendes valdkondades käib paljudes riikides. USA Riiklike Tervishoiuinstituutide ägeda maksapuudulikkuse sümpoosioni kokkuvõttes märgitakse paljulubavate ravimeetodite hulgas lisaks maksasiirdamisele ka kseno- või allogeensete hepatotsüütide siirdamist ja bioreaktorite ekstrakorporaalset ühendamist maksarakkudega. On otseseid tõendeid selle kohta, et ainult võõrad funktsionaalselt aktiivsed hepatotsüüdid suudavad retsipiendi maksa tõhusalt toetada. Isoleeritud hepatotsüütide kliiniliseks kasutamiseks on vaja luua rakupank, mis vähendab oluliselt aega rakkude eraldamise ja nende kasutamise vahel. Isoleeritud hepatotsüütide panga loomise kõige vastuvõetavam meetod on maksarakkude krüokonserveerimine vedelas lämmastikus. Selliste rakkude kasutamisel kliinikus ägeda ja kroonilise maksapuudulikkusega patsientidel on ilmnenud üsna kõrge terapeutiline toime.

Vaatamata maksarakkude siirdamise optimistlikele ja julgustavatele tulemustele katsetes ja kliinilises praktikas on endiselt palju probleeme, mis on kaugel lahendamisest. Nende hulka kuuluvad piiratud arv organeid, mis sobivad isoleeritud hepatotsüütide saamiseks, ebapiisavalt tõhusad meetodid nende eraldamiseks, standardiseeritud meetodite puudumine maksarakkude säilitamiseks, ebaselged ettekujutused siirdatud rakkude kasvu ja proliferatsiooni reguleerimise mehhanismide kohta, piisavate meetodite puudumine allogeensete hepatotsüütide siirdamise või hülgamise hindamiseks. See hõlmab ka siirdamisimmuniteedi olemasolu allogeensete ja ksenogeensete rakkude kasutamisel, kuigi vähem kui ortotoopilise maksa siirdamise korral, kuid nõuab immunosupressantide kasutamist, isoleeritud hepatotsüütide kapseldamist või nende spetsiaalset töötlemist ensüümidega. Hepatotsüütide siirdamine põhjustab sageli retsipiendi ja doonori vahel immuunkonflikti hülgamisreaktsiooni vormis, mis nõuab tsütostaatikumide kasutamist. Selle probleemi üheks lahenduseks võib olla polümeersete mikropoorsete kandjate kasutamine maksarakkude eraldamiseks, mis parandab nende ellujäämist, kuna kapsli membraan kaitseb hepatotsüüte tõhusalt hoolimata peremeesorganismi immuniseerimisest.

Ägeda maksapuudulikkuse korral on selline hepatotsüütide siirdamine aga ebaefektiivne, kuna maksarakkudel kulub uues keskkonnas kohanemiseks ja optimaalse funktsioneerimise staadiumi saavutamiseks suhteliselt pikk aeg. Võimalikuks piiranguks on sapi sekretsioon isoleeritud hepatotsüütide ektoopilise siirdamise ajal ning bioreaktorite kasutamisel on oluliseks füsioloogiliseks barjääriks inimese valkude ja ksenogeensete hepatotsüütide poolt toodetud valkude liikide mittevastavus.

Kirjanduses on teateid, et luuüdi strooma tüvirakkude lokaalne siirdamine hõlbustab luudefektide tõhusat korrigeerimist ning luukoe taastumine toimub sel juhul intensiivsemalt kui spontaanse reparatiivse regenereerimise korral. Mitmed prekliinilised uuringud eksperimentaalsete mudelite kohta näitavad veenvalt luuüdi stroomarakkude siirdamise võimalikkust ortopeedias, kuigi nende meetodite optimeerimiseks isegi kõige lihtsamatel juhtudel on vaja täiendavat tööd. Eelkõige ei ole veel leitud optimaalseid tingimusi osteogeensete stroomarakkude ex vivo laienemiseks ning nende ideaalse kandja (maatriksi) struktuur ja koostis on endiselt välja arendamata. Luu mahuliseks regenereerimiseks vajalike rakkude minimaalset arvu ei ole kindlaks määratud.

On tõestatud, et mesenhümaalsed tüvirakud omavad transgermaalset plastilisust, st võimet diferentseeruda rakutüüpideks, mis fenotüübiliselt ei ole seotud algse liini rakkudega. Optimaalsetes kultiveerimistingimustes taluvad polüklonaalsed luuüdi strooma tüvirakkude liinid in vitro enam kui 50 jagunemist, mis võimaldab saada miljardeid stroomarakke 1 ml luuüdi aspiraadist. Mesenhümaalsete tüvirakkude populatsioon on aga heterogeenne, mis avaldub nii kolooniate suuruse varieeruvuses, nende moodustumise erinevas kiiruses kui ka rakutüüpide morfoloogilises mitmekesisuses, alates fibroblastide sarnastest spindlikujulistest kuni suurte lamedate rakkudeni. Fenotüübilist heterogeensust täheldatakse juba 3 nädala pärast strooma tüvirakkude kultiveerimist: mõned kolooniad moodustavad luukoe sõlmi, teised moodustavad adipotsüütide klastreid ja teised, haruldasemad, moodustavad kõhrekoe saari.

Embrüonaalse närvikoe siirdamist kasutati algselt kesknärvisüsteemi degeneratiivsete haiguste raviks. Viimastel aastatel on embrüonaalse ajukoe asemel siirdatud närvitüvirakkudest saadud neurosfääride rakulisi elemente (Poltavtseva, 2001). Neurosfäärid sisaldavad neuronite ja neuroglia pühendunud eellasrakke, mis annab lootust kaotatud ajufunktsioonide taastumisele pärast nende siirdamist. Pärast hajutatud neurosfäärirakkude siirdamist roti aju striatumi piirkonda täheldati nende proliferatsiooni ja diferentseerumist dopamiinergilisteks neuroniteks, mis kõrvaldas eksperimentaalse hemiparkinsonismiga rottidel motoorse asümmeetria. Mõnel juhul arenesid neurosfäärirakkudest aga kasvajad, mis viisid loomade surmani (Bjorklund, 2002).

Kliinikus viidi läbi kahe patsientide rühma hoolikad uuringud, mille käigus ei patsiendid ega neid jälgivad arstid teadnud (topeltpime uuring), et ühele patsientide rühmale siirdati dopamiini tootvate neuronitega embrüonaalne kude ja teisele patsientide rühmale tehti näiv operatsioon, ning tulemused olid ootamatud. Patsiendid, kellele siirdati embrüonaalne närvikude, ei tundnud end paremini kui kontrollrühma patsiendid. Lisaks tekkis 5-l 33-st patsiendist 2 aastat pärast embrüonaalse närvikoe siirdamist püsiv düskineesia, mida kontrollrühma patsientidel ei esinenud (Tüvirakud: teaduslik areng ja tulevased uurimissuunad. Nat. Inst, of Health. USA). Aju närvitüvirakkude kliinilise uuringu üheks lahendamata probleemiks on endiselt nende derivaatide siirdamise tegelike väljavaadete ja piirangute analüüs kesknärvisüsteemi häirete korrigeerimiseks. On võimalik, et pikaajalise krambiaktiivsuse poolt esile kutsutud hipokampuse neuronogenees, mis viib selle struktuurilise ja funktsionaalse reorganiseerumiseni, võib olla epilepsia progresseeruva arengu teguriks. See järeldus väärib erilist tähelepanu, kuna see viitab küpses ajus uute neuronite tekkimise ja nende poolt aberrantsete sünaptiliste ühenduste moodustumise võimalikele negatiivsetele tagajärgedele.

Ei tohiks unustada, et tsütokiinidega (mitogeenidega) keskkondades kultiveerimine lähendab tüvirakkude omadusi kasvajarakkude omadele, kuna neis toimuvad sarnased muutused rakutsükli regulatsioonis, mis määravad piiramatu jagunemise võime. Embrüonaalsete tüvirakkude varajaste derivaatide siirdamine inimesele on hoolimatu, kuna sel juhul on pahaloomuliste kasvajate tekke oht väga suur. Palju ohutum on kasutada nende pühendunumaid järglasi, st diferentseerunud liinide eellasrakke. Praegu ei ole aga veel välja töötatud usaldusväärset tehnikat soovitud suunas diferentseeruvate stabiilsete inimrakkude liinide saamiseks.

Molekulaarbioloogia tehnoloogiate kasutamine päriliku patoloogia ja inimeste haiguste korrigeerimiseks tüvirakkude modifitseerimise teel pakub praktilisele meditsiinile suurt huvi. Tüvirakkude genoomi omadused võimaldavad välja töötada ainulaadseid siirdamisskeeme geneetiliste haiguste korrigeerimiseks. Selles valdkonnas on aga mitmeid piiranguid, mis tuleb enne tüvirakkude geenitehnoloogia praktilist rakendamist ületada. Esiteks on vaja optimeerida tüvirakkude genoomi ex vivo modifitseerimise protsessi. On teada, et tüvirakkude pikaajaline (3-4 nädalat) proliferatsioon vähendab nende transfektsiooni, seega on nende geneetilise modifitseerimise kõrge taseme saavutamiseks vaja mitut transfektsioonitsüklit. Peamine probleem on aga seotud terapeutilise geeniekspressiooni kestusega. Praeguseks ei ole üheski uuringus modifitseeritud rakkude siirdamise järgne efektiivse ekspressiooni periood ületanud nelja kuud. 100% juhtudest väheneb transfekteeritud geenide ekspressioon aja jooksul promootorite inaktiveerimise ja/või modifitseeritud genoomiga rakkude surma tõttu.

Oluline küsimus on rakutehnoloogiate kasutamise maksumus meditsiinis. Näiteks on hinnanguline aastane vajadus rahastada ainult luuüdi siirdamise osakonna ravikulusid, mis on kavandatud 50 siirdamise tegemiseks aastas, umbes 900 000 USA dollarit.

Rakutehnoloogiate arendamine kliinilises meditsiinis on keeruline ja mitmeastmeline protsess, mis hõlmab konstruktiivset koostööd multidistsiplinaarsete teadus- ja kliiniliste keskuste ning rahvusvahelise üldsuse vahel. Samal ajal vajavad erilist tähelepanu rakuteraapia valdkonna uuringute teadusliku korralduse küsimused. Neist olulisemad on kliiniliste uuringute protokollide väljatöötamine, kliiniliste andmete usaldusväärsuse kontroll, riikliku uuringute registri moodustamine, mitmekeskuseliste kliiniliste uuringute integreerimine rahvusvahelistesse programmidesse ja tulemuste rakendamine kliinilises praktikas.

Rakusiirdamise probleemide sissejuhatuse lõpetuseks tahaksin avaldada lootust, et Ukraina juhtivate spetsialistide jõupingutuste ühendamine erinevatest teadusvaldkondadest tagab märkimisväärse edu eksperimentaalsetes ja kliinilistes uuringutes ning võimaldab lähiaastatel leida tõhusaid viise elundi-, koe- ja rakusiirdamist vajavate raskelt haigete inimeste abistamiseks.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]