Restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismi analüüs

Erinevate restriktsiooni endonukleaaside laiaulatuslik kasutamine kromosomaalse DNA analüüsimisel näitas inimese genoomi tohutut varieeruvust. Isegi väikesed muutused struktuurigeenide kodeerivates ja reguleeritavates piirkondades võivad viia teatud valgu sünteesi lõppemiseni või inimese keha funktsiooni kadumiseni, mis tavaliselt mõjutab patsiendi fenotüüpi. Kuid ligikaudu 90% inimese genoomist koosnevad mittekodeerivatest järjestustest, mis on muutlikumad ja sisaldavad palju nn neutraalseid mutatsioone või polümorfisme ja neil ei ole fenotüüpilist ekspressiooni. Selliseid polümorfseid saite (loci) kasutatakse geneetiliste markeritena pärilike haiguste diagnoosimiseks. Polümorfsed lookused esinevad kõigis kromosoomides ja on seotud geeni spetsiifilise piirkonnaga. Olles kindlaks teinud polümorfse lookuse lokaliseerimise, on võimalik kindlaks teha, millise genoomi suhtes on seostatud mutatsioon, mis põhjustas haiguse patsiendil.

DNA polümorfsete piirkondade isoleerimiseks kasutatakse bakteriaalseid ensüüme - restriktsiooniensüüme, mille produktiks on restriktsioonisaidid. Polümorfsetes kohtades esinevad spontaansed mutatsioonid muudavad need resistentseks või vastupidi tundlikuks konkreetse restriktsiooniensüümi toimel.

Restriktsioonisaitide mutatsiooniline varieeruvus võib tuvastada piiratud DNA fragmentide pikkuse muutmisega, eraldades need elektroforeesi abil ja sellele järgneva hübridiseerimisega spetsiifiliste DNA-sondidega. Kui polümorfses kohas pole piiranguid, tuvastatakse elektroforegrammidel üks suur fragment ja kui see on olemas, siis esineb väiksemat fragmenti. Restriktsioonisaidi olemasolu või puudumine identsetes homoloogsete kromosoomide loosides võimaldab usaldusväärselt märgistada mutantset ja normaalset geeni ja jälgida selle edasilükkamist järglastele. Seega, patsientide DNA uuringus polümorfses piirkonnas esineb mõlemas kromosoomis, mille restriktsioonisait esineb, ilmnevad elektrofoorigrammis lühikesed DNA fragmendid. Polümorfse restriktsioonisaidiga modifitseerivate mutatsioonide homosügootsetel patsientidel tuvastatakse suurema pikkusega fragmendid ja heterosügootsetel fragmentidel tuvastatakse lühikesed ja pikad fragmendid.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]