Tuberkuloosi laboratoorsed diagnoosid

Tuberkuloos on haigus, mida on tänapäevastes tingimustes ja teaduslikes saavutustes lihtne diagnoosida. Tuberkuloosi laboratoorsed diagnoosid on teiste diagnostiliste meetodite keskmes, teine ainult röntgenikiirte uurimismeetodid.

[1], [2], [3], [4],

Kliiniline vereanalüüs

Tuberkuloos muutustega üldises vere analüüsil ei ole haigusele. Piiratud ja mitteaktiivsete vormid tuberkuloosi hypochromia iseloomulik erütrotsüütide nende normaalne kogus. Kui massiivne infiltraat või juustjas kopsupõletik, samas levimus juustjas lümfadeniidi konkreetsed soolekahjustusi, samuti suuremõõtmeliste kopsu- või operatsioonijärgsed veritsust ja teadmiseks erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrotsütoosi, ja veelgi enam poikilotsütoosi palju haruldasem, tavaliselt raske aneemia. Number retikulotsüütide etapis tuberkuloosi kompenseeritakse vahemikke 0,1-0,6%, kusjuures subcompensated - 0,6-1,0% ja 1% iseloomustab dekompenseerimata retikulotsüütides.

Kui tuberkuloosi mõnedel juhtudel võib mõõdukalt leukotsütoos (kuni 15000 leukotsüütide.), Vähem kiirgust, mis esinevad 2-7% patsientidest piiratud ja lihtne protsess esinevate vormide ja 12,5% - destruktiivne ja progressiivne kopsutuberkuloosi .

Leukotsüütide valemis esinevad kõige sagedamad nihked. Märkige nii suhteline kui ka absoluutne neutrofiilia, leukotsüütide valemi mõõdukas nihkumine promüelotsüütide vastu vasakule. Müelotsüüdid on komplitseerunud tuberkuloosi korral väga haruldased. Arvu suurendamine neutrofiilid ebanormaalse tera hemogramm tuberkuloosihaigete alati näitab protsessi kestusest: raskekujulise tuberkuloosi peaaegu kõik Neutrofiilid sisaldavad ebanormaalset teravilja. Kui tuberkuloosne puhang lakkab, muutub tuumade muutus suhteliselt kiiresti normaalseks. Neutrofiilide patoloogiline granulaarsus püsib tavaliselt kauem kui muud hemogrammi muutused.

Eosinofiilide sisaldus perifeerses veres varieerub sõltuvalt protsessi faasist ja organismi allergilisest seisundist. Nende arv väheneb kuni aneozinofiliya raske ja pikaajaline haiguspuhang ning vastupidi, suureneb resorptsiooni infiltraati pleuraefusioon, samuti varase vormid esmane tuberkuloos.

Enamiku esmaste tuberkuloosi vormide kõrval on lümfopeenia, mida mõnikord täheldatakse juba mitu aastat, isegi pärast konkreetsete muutuste armistumist. Tõsisev faasi sekundaarne tuberkuloos, sõltuvalt protsessi raskusastmest, võib olla seotud kas normaalse arvu lümfotsüütidega või lümfopeeniaga.

See eriline koht määratakse kindlaks erütrotsüütide settereaktsiooni lisakatsed hindama tuberkuloossete protsessi (ESR), mille väärtus ringluse hindamiseks tuberkuloosi protsessi ja identifitseerimiseks selle aktiivseid vorme. Suurenemine ESR olemasolu näitab patoloogilist protsessi (nakkusliku põletikuvastane, mädane septiline hemoblastosis, Hodgkini jt.) Ning see viitab selle tõsidusest, kuid normaalne tase ESR viita alati puudumisel patoloogiat. Kiirendus erütrotsüütide sadestumise kaasa tõusu veres globuliinid, fibrinogeen, kolesterooli ja vähendavad vere viskoossust. Erütrotsüütide settimise aeglustumine on iseloomulik seisunditele, millega kaasneb hemikontsentratsioon, albumiini ja sapphapete sisalduse suurenemine.

Hemorraam tuberkuloosiga patsientidel muutub ravi ajal. Hematoloogilised nihked kaovad, seda kiiremini, seda teravamal sekkumist on edukamad. Siiski tuleb silmas pidada erinevate antibakteriaalsete ravimite mõju hemopoeesile. Need põhjustavad sageli eosinofiiliat, mõnel juhul leukotsütoosi ja sagedamini leukopeeniat kuni agranulotsütoosi ja lümfoid-retikulaarse reaktsiooni. Saadud andmete süstemaatiline hematoloogiline kontroll ja korrektne analüüs on olulised patsiendi kliinilise seisundi, protsessi dünaamika ja kasutatud ravi tõhususe hindamisel.

[5], [6], [7], [8], [9],

Uriini kliiniline analüüs

Kuseteede tuberkuloosiga on peamine labori diagnostiline meetod uriinianalüüs. Leukotsütopeenia, erütrotsütuurid, proteinuuria, hüpoisostuunia, tuberkuloosi mycobacterium, mittespetsiifiline bakteriuuria võib täheldada.

Leukotsütturia on kuseteede tuberkuloosi kõige sagedasem sümptom enne spetsiifilist kemoteraapiat ja seda ei esine ainult erandjuhtudel, näiteks kuseteede luumenuse täielikul hävitamisel. Nechyporenko test (määramine leukotsüütide arv 1 ml uriini) aitab objektiivsemalt hinnata, mil määral leukocyturia nefrotuberkuloze, ja mõnel juhul selgitada seda tavalise uriinianalüüsi. Siiski tuleb arvestada, et leukotsütüria võib esineda ägedal ja kroonilisel püelonefriidil, tsüstiitil, uretriidil, neeru- ja kuseteede kividel.

Erütrotsütuuria. Samuti leukotsüturiat. Peetakse üheks kõige sagedasemaks laboratoorsed sümptomaaktilise tuberkuloosi sümptomid. Hematuria sagedus sõltub protsessi levimusest, see suureneb, kui hävitav tuberkuloosiprotsess areneb neerud. Neeruttuubuloosi varajastes staadiumides on tüüpiline leukotsütopeenia erütrotsütuuria. Hematuria, mis ületab leukotsütriat, on oluliseks argumendiks neeru tuberkuloosi kasuks selle eristamisel mittespetsiifilisest püelonefriidist.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biokeemiline vereanalüüs

Tuberkuloosi korral mõne biokeemilise parameetri muutused sõltuvad peamiselt protsessi faasist, tüsistustest ja mitmesugustest kaasnevatest haigustest. Kopsu ja teiste elundite inaktiivse tuberkuloosi põdevatel patsientidel ei muutu vereseerumi kogu valgu- ja valgufraktsioon muutumatul kujul ja määratakse nende normaalne sisaldus.

Haiguse ägedate vormide, samuti tuberkuloosi krooniliste vormide ägenemise ja progresseerumise tõttu väheneb albumiini-globuliini koefitsient.

Eeterlikud hindamisel funktsionaalse seisundi Orgaaniline kahjustus ja maksas tuberkuloos ja selle tüsistuste on määrata seerumi täielikust otsesest bilirubiini, AST (ACT), (ALAT). Aminotransferaaside taseme dünaamiline määramine. Tuberkuloosi põdevate patsientide ravis, eriti rasketes vormides, on bilirubiin tuberkuloosi põdevate patsientide biokeemilise uuringu kohustuslik komponent ja seda tehakse kord kuus.

Neerude funktsionaalse seisundi hindamine hõlmab seerumi kreatiniini määramist ja glomerulaarfiltratsiooni kiiruse arvutamist vastavalt Cockcroft-Gault valemile. Glomerulaarfiltreerimiskiiruse arvutamine Rebergi proovi abil annab vähem täpset tulemust.

Tuberkuloosihaigete dünaamiliste biokeemiliste uuringute põhieesmärk on jälgida protsessi kulgu, ravimite kõrvaltoimete õigeaegset avastamist ja sellest tulenevaid homöostaatilisi häireid.

[17], [18], [19]

Uurimise biokeemiliste meetodite rakendamine ekstrapulmonaalse tuberkuloosi korral

Kõige informatiivsem indikaator on tuberkulostearhappe sisaldus bioloogilistes vedelikes, kuid selle määratlus on seotud tehniliste raskustega (gaasikromatograafia ja massispektromeetria vajadus).

Mõõdukas adenosiindeaminaasi aktiivsuse mõõtmine - ensüüm, mis määratakse vedelikes: sünoviaal-, perikardi-, astsiidiline või seljaaju. Adenosiindeaminaasi peamised tootjad on lümfotsüüdid ja monotsüüdid. Määramine adenosiindeaminaas aktiivsuse bioloogilistes vedelikes hõlbustab diagnoosimiseks tuberkuloossete liigesepõletik, tuberkuloos lümfisõlmede, tuberkuloossete meningiit, tuberkuloossete serozity.

Mõned biokeemilised näitajad, mis on tingitud nende mittespetsiifilisusest, määratakse ainult bioloogilistes vedelikes, mis on haiguskontsentratsiooni lähedal. Mõõda indikaatorite tase tuberkuliini subkutaanseks või intradermaalseks süstimiseks (tavaliselt enne ja 48 ja 72 tundi pärast seda). Seejärel arvutatakse markeri taseme juurdekasv (protsentides) algtaseme suhtes.

Transmnidaasi organispetsiifilise ensüümi aktiivsuse uriinis optimaalne määramine, mille välimus on täheldatud erinevate looduslike neerude mõjutamisel. Transamidiraasi uuring on õigustatud ainult tuberkuliini subkutaanse süstimise tingimustes, et süvendada kohalikku põletikulist protsessi. Esmalt määrake transamidiini aktiivsus uriinis ja 24-72 tundi pärast 50 TE tuberkuliini sissetoomist. Fermentia laiendamine 2 korda ja rohkem võimaldab 82% juhtudest eristada neeruprobleemide aktiivset tuberkuloosi alates kroonilise püelonefriidi ägenemisest.

Naiste suguelundite tuberkuloosiga määratakse provotseeriva tuberkuliiniproovi tingimustes haptoglobiini ja maloni dialdehüüdi kontsentratsioon veres. Subkutaanselt süstitud tuberkuliin annuses 50 TE ja 72 tundi hiljem tegi teise biokeemilise uuringu. Tuberkuloosi etioloogia puhul on haptoglobiini taseme tõus vähemalt 28% ja malondialdehüüdi tase on 39% või rohkem. Samuti kasutatakse Douglasi ruumis saadud peritoneaalses vedelikus adenosiindeaminaasi aktiivsuse määramist. Punkti on uuesti uuritud 72 tundi pärast tuberkuliini intradermaalset manustamist 0,1 TE ja 0,01 TE annuse puhul sisepõiekeste eesmise sisepõletike projektsioonile. Tuberkuloosiprotsessi kasuks on adenosiindeaminaasi aktiivsuse tõus võrreldes esialgsega 10% või rohkem.

Kui silm on kahjustatud, uuritakse silmas peetavat fokaalakti vastuseks antigeensele stimulatsioonile. Ebasoovitav on arendada väljendunud vastust koos visuaalsete funktsioonide vähenemisega. Kuna hindamine minimaalse fookuskaugusega reaktsioonid on sageli raske soovitada järeldusele objektistamise on orienteeritud paralleelselt ja astmest tõusu seerumis haptoglobuliin või adenosiindeaminaas.

Kõik biokeemilised uuringud tuleks läbi viia koos teiste meetoditega.

[20], [21], [22], [23],

Vere hüübimissüsteemi uuringud

Asjakohasus teadus staatuse vere hüübimise süsteemi TB on põhjustatud juuresolekul patsientide arv kopsutuberkuloosi veriköha või kopsuverejooks, samuti hemocoagulation komplikatsioone kirurgilise ravi tuberkuloosi. Lisaks sellele mõjutab tuberkuloosiga looduslikult kaasnev intravaskulaarse hemokoagulatsiooni latentne voog haiguse kulgu ja keemiaravi efektiivsust.

Patsientidel kopsutuberkuloosi levimus eksudatiivsete põletiku komponent tingimustes vähenes veres antikoagulatsooni. Nendel patsientidel, kellel esinevad harva konkreetse kahjustuse kopsudes ülekaal produktiivne hemocoagulation intravaskulaame põletikuline komponent väljendatakse veidi. Patsientidel kopsutuberkuloosi koos hemoptysis ja kopsu hemorraagia olekus vere hüübimise süsteemi on erinevad: seerumi madala verekaotuse haripunktis gemoptoe või kohe pärast selle lõpetamist on järsk tõus vere hüübimine võime tõttu tõsiseid intensiivistamine trombinoobrazovaniya säilitades suurenenud "struktuurne" hüübimist. Patsientidel, kellel on massiivne verekaotus vähenemisele hüübimisvõimet arvelt kontsentratsiooni vähendamist fibrinogeeni. XIII faktori aktiivsus, trombotsüütide arv. Staadiumis kirurgilist ravi patsientidel piiratud vormide kopsutuberkuloosi märkimisväärse rikkumisi süsteemi homeostaasi esineb. Patsiendid, kellel on levinud protsessi täitmise pnevmon- või plevropnevmonektomii sageli arendada DIK, mis võib olla "teine haigus."

Seisundi jälgimiseks verehüübesüsteemi patsientidel kopsutuberkuloosi peaks toimuma määramiseks aktiveeritud osalise tromboplastiini aja (APTT), fibrinogeen, trombiin aega, protrombiini indeks ja veritsusaja ja hüübimisajast.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonaalsed uuringud

Hiljutised eksperimentaalsed ja kliinilised tähelepanekud näitavad juuresolekul hormonaalse seisundi muutused konkreetses tuberkuloossete kopsupõletikku. On tõestatud, et korrektsiooni düsfunktsioneerimise ajuripatsi-neerupealiste, ajuripatsi-kilpnäärme süsteemid ja kõhunäärme funktsiooni koos anti-TB ravi kaasa aktiveerimist fibrogenees ja remonditööd lookuses põletikule.

Funktsionaalse seisundi ajuripatsi-kilpnäärme süsteem hinnati sisu vereseerumis trijoodtüroniini (T ₃ ), türoksiini (T ₄ ), ajuripatsi kilpnääret stimuleeriv hormoon (TSH). Selgus, et subkliinilise hüpotüreoidism avastatakse 38-45% patsientidest kopsutuberkuloos, ja enamasti on diagnoositud levinud ja fibroseroossed haigutav vormid protsessi. Nendel samal kujul kõige märgatavamalt vähendatud nii T ₃ ja T ₄ ja sealt tuleb tasakaalutus need hormoonid vormis suhte suurendamisega T ₄ / T _s.

Adrenokortikaalsete funktsiooni hinnati kortisooli vereseerumis ning endokriinses kõhunääre - kontsentratsioon immuun-reaktiivse insuliini. Nakkushaiguse akuutses faasis suureneb endogeense kortisooli ja insuliini vajadus. Hüperinsuliinhüpeemia näitab ka keha kudede insuliiniresistentsust, mis on tüüpiline mis tahes aktiivse põletikulise protsessi puhul, eriti spetsiifiline. Määramine glyukokortiko idnoy-neerupealise funktsiooni aktiivse kopsutuberkuloosi paljastab juuresolekul Cushing enamikul patsientidest. Normaalne Kortisooli kontsentratsioonis veres patsiendile põletikkudega akuutses perioodi tuleks pidada suhtelise ebaedu glükokortikoidi funktsioonina neerupealise koores, mis võib olla aluseks hoidmiseks annused piisavad asendusravi glükokortikoidide.

Peaaegu kolmandik patsientidest, kes põevad kopsutuberkuloosi, suudavad tõestada, et nende insuliiniumide tase on üsna madal ja läheneb normi alumise piirini, samas kui 13-20% leiab märkimisväärset hüperinsulinismi. Mõlemad suhtelised hüpogeenne ja hüperinsulinism on kõrge riskitegurid mitmesuguses ulatuses süsivesikute ainevahetuse häirete tekkeks. Need muutused kõhunäärme B-rakkude funktsionaalses tegevuses vajavad regulaarset glükeemia jälgimist tuberkuloosi põdevatel patsientidel ja suhkurtõve õigeaegseks ennetamiseks. Lisaks sellele see on täiendav põhjendus insuliini füsioloogiliste annuste kasutamise otstarbekusele tuberkuloosi kompleksravis.

Üldiselt madalam kilpnäärme hormoonid ja nende tasakaalust hüperkortisoleemiat ja hyperinsulinism suurima katvusega raskekujulise käigus tuberkuloosi protsessi, kellel on ulatuslikud kopsukahjustusi ja raske tuberkuloosi sümptomid mürgistuse.

Tuberkuloosi mikrobioloogiline diagnoosimine

Mikrobioloogilised uuringud on vajalikud, et selgitada patsientide tuberkuloos, kontrollida diagnoosimiseks, jälgimiseks ja keemiaravi korrigeerimise hindamise ravitulemuste, teisisõnu, kuna registreerimine patsiendi tuberkuloosi enne eemaldamist register.

Kõik epidemioloogilised programmid ja projektid põhinevad bakteriaalsete excretatorite arvu hindamisel, mida ei saa teha, kui ei kasutata laboratoorseid meetodeid mükobakterite tuberkuloosi avastamiseks. Niinimetatud organiseerimata populatsiooni uuringus jõuab bakterite sissetungijate protsent 70-ni või rohkem, mis muudab laboratoorsete meetodite seas selle rühma kuuluvate tuberkuloosihaigete identifitseerimiseks piisavalt tõhusaks vahendiks.

Tavalised mikrobioloogilised meetodid tuberkuloosi diagnoosimiseks on bakterioskoopilised ja kultuuriuuringud. Kaasaegsed meetodid arvestavad mükobakteri tuberkuloosi kasvatamist automatiseeritud süsteemides, PCR-i seadistamist. Kuid kõik need meetodid on tingimata ühendatud klassikaliste bakterioloogiliste meetoditega.

Diagnostiliste materjalide kogumine

Laboratoorsete uuringute tõhusus sõltub suurel määral diagnostilise materjali kvaliteedist. Diagnostiliste materjalide kogumise, säilitamise ja transportimise eeskirjade järgimine ning patsiendi hindamise algoritmi täpne rakendamine mõjutab otseselt tulemust ja tagab bioloogilise ohutuse.

Tuberkuloosi testimisel kasutatakse erinevaid materjale. Tulenevalt asjaolust, et TB logkih- Kõige levinumaks TUBERKULOOSNE kahjustuste algmaterjali uurimistöö kaaluda röga ja teist liiki eemaldatavad trahheobronhiaalse: ülemiste hingamisteede eritiste saadi pärast aerosooli sissehingamise: bronhiaal- pesud; bronhoalveolaarne loputus; Materjali saadakse bronhoskoopia ja intrapulmonaarseks transtrahheaalset biopsiat bronhiaalhaiguse aspiraatidest kõri- tampoonid, eksudaatides haavad ja määrdub al.

Uuringute tõhusus suureneb, kui patsiendilt kontrollitakse materjali kogumist. Selleks eraldatakse spetsiaalselt varustatud ruum või ostetakse erikabiine. Materjalide kogumine on ohtlik protseduur, seetõttu on vaja koguda materjali teadusuuringuteks, järgides nakkusohutuse eeskirju.

Mycobacterium tuberculosis'e testimise materjal kogutakse tihedalt kruvitud korgidesse, et vältida keskkonna saastumist ja kaitsta kogutud materjali saastumise eest.

Diagnostikumaterjali kogumiseks ettenähtud viaalid peavad vastama järgmistele nõuetele:

• peavad olema valmistatud löögikindlast materjalist;
• peaks autoklaavimise ajal hõlpsalt sulama;
• piisava koguse (40-50 ml):
• röga kogumiseks on lai ava (läbimõõt vähemalt 30 mm);
• olema hõlpsasti käsitsetav, läbipaistev või poolläbipaistev, nii et saaksite hinnata kogutud proovi kogust ja kvaliteeti ilma kaane avamata.

Optimaalsete uurimistulemuste saamiseks tuleb järgida järgmisi tingimusi:

• Koguge materjal enne keemiaravi alustamist;
• uuringu materjal tuleb koguda enne hommikust toidu ja ravimite tarbimist;
• teadusuuringute jaoks on soovitatav koguda vähemalt 3 hommikust flegmi proovi. Koguge röga 3 järjestikuse päeva jooksul;
• kogutud materjal tuleb laboratooriumisse võimalikult kiiresti kätte toimetada:
• kui materjali viivitamatult võimatu tarnida laborisse, säilitatakse see külmkapis temperatuuril 4 ° C mitte rohkem kui 48 tundi;
• Materjali transportimisel tuleb hoolikalt jälgida viaalide terviklikkust.

Õige kogutud röga on limaskest või limaskestad. Uuritud röga optimaalne maht on 3-5 ml.

Mälu kogutakse meditsiinitöötaja järelevalve all. Röga kogumise eest vastutavad isikud peavad järgima teatud reeglite rakendamist:

• patsiendile tuleb selgitada uuringu eesmärki ja vajadust seedeelundite või ninaverejooksude lima köha, kuid sügavate hingamisteede sisu. See saavutatakse tulemusliku köha tulemusena, mis tekib pärast mitu (2-3) sügavat hingetõmmet. Samuti on vajalik hoiatada patsiendi, et ta peaks loputama suud keedetud veega, et eemaldada suuõõnes kasvav mikrofloor ja peamine osa, mis takistab röga uurimist;
• röga kogumisel osalev meditsiinitöötaja lisaks hommikumantlile ja mütsile peab kandma maski, kummikindaid ja kummist põlle;
• Patsiendi taha seismisel on soovitatav hoida pudel võimalikult lähedal oma huultele ja kohe eraldada selle kõhuna flegma ning tuleb tagada, et õhuvool suunatakse tervishoiutöötaja poole:
• Röga kogumise lõppedes peab tervishoiutöötaja hoolikalt sulgema viaali kaanega ja hindama kogutud röga kogust ja kvaliteeti. Seejärel pudel märgistatakse ja asetatakse laborisse transportimiseks spetsiaalsesse biksisse.

Kui patsient ei tooda flegma, õhtul ja varahommikul päeval materjali kogumist vajalikuks anda talle Köha :. Ekstrakt juured vahukommi (mukaltin), broomheksiinhüdrokloriid, ambroksoolile jne - või kohaldada ärritavad sissehingamise teel, kasutades paigaldatud ruumi koguda flegm. Sel viisil kogutud materjal ei kuulu kaitse alla ning seda tuleks uurida kogumise päeval. Selleks, et vältida oma "tagasilükkamise" laboris suunas tuleks anda erimärgistus.

Kui selles rajatises mikrobioloogilisi uuringuid ei toimu, tuleb kogutud diagnostiline materjal laborisse tarnida tsentraalselt, tingimusel, et seda materjali säilitatakse külmkapis kasutatavate tarnete vaheliste ajavahemike järel või säilitusainetega. Saada transpordikarbidesse materjali laborisse, mida saab kergesti desinfitseerida. Igale proovile tuleb lisada asjakohane silt ja kogu partii tuleb täita kaasasoleva vormiga.

[29], [30], [31],

Patsientide uurimise viisid ja sagedus

Esimesel, niinimetatud diagnoosimisel, patsiendi uurimisel tuberkuloosile, on vaja uurida vähemalt 3 röga osast 2 või 3 päeva jooksul. Kogutud meditsiinipersonali järelevalve all, mis suurendab mikroskoopia efektiivsust.

Tuberkuloosi peamine sõeluuring peaks toimuma kõikides tervishoiusüsteemi meditsiinilise diagnostika asutustes. Hiljuti on kliiniliste diagnostiliste laborite baasil organiseeritud nn mikroskoobi keskused, mis on varustatud tänapäevaste mikroskoopidega ja epideemiaohutuse vahenditega, et parandada esialgse eksami tõhusust.

Anti-TB rajatistes kasutatakse sõelkatset, mis sisaldab rögaeksamit või muud diagnostilist materjali vähemalt 3-kordselt 3 päeva jooksul. Ravi ajal tehakse mikrobioloogilisi uuringuid regulaarselt vähemalt kord kuus intensiivse kemoteraapia faasi jooksul. Ravi faasile üleminekul viiakse uuringud läbi harvemini - 2-3-päevase intervalliga, samal ajal kui uuringu sagedust vähendatakse kaheks.

Extrapulmonaalse tuberkuloosi diagnostiliste materjalide kogumise tunnused

Tunnusjooneks patoloogilise materjali ekstrapulmonaalse vormid TB - Mycobacterium tuberculosis madala kontsentratsiooniga see, mis nõuab palju tundlikum meetodeid mikrobioloogilised uuringud, peamiselt külvamist tehnikaid keskmise.

Kuseprobleemide tuberkuloosiga on uriin kõige kättesaadavam õppematerjal. Uriini kogumine peab toimuma spetsiaalselt väljaõppe saanud meditsiiniõde.

Väliseid suguelundeid pestakse vee ja seebi või nõrga kaaliumpermanganaadi lahusega. Ureetra välimine ava tuleb hoolikalt töödelda. Steriilses viaalis kogutakse keskmise osa hommikust uriinist: meestel, loomulikult naistel, kasutades kateetrit. Neerude vaagist pärinev uriin kogutakse steriilsetesse tuubidesse, kusjuures kateteriseeritakse üks või kaks neerud, viimasel juhul - tingimata eraldi igast neerudest. Väike kogus seda uriini tsentrifuugitakse, setit uuritakse.

Meeste spermatosoidide, puntrastaalsete munandite korral viiakse eesnäärme saladus tsentrifuugimise teel sademe saamiseks. Mis tahes suguelundite spetsiifilise protsessi lokaliseerimine meestel võib eesnäärme massaaži abil edendada mükobakteri tuberkuloosi sisaldavate sekretsioonide sekretsiooni.

Naiste menstruaalveri kogutakse imemiseks või Kafka korki kasutades. Saadud materjal vabastatakse punavereliblede hulgast, pesta destilleeritud veega, millele järgneb tsentrifuugimine. Sade uuritakse.

Emaka emakakaela kanaleid eraldatakse mõnes Kafka mahus või korkis, see tähendab, et on soovitav koguda 1-2 ml patoloogilist materjali.

Neerude, suguelundite operatiivse sekkumise teel saadud materjal. Biopsiatega, endomeetriumi sabreid homogeniseerige. Selleks pannakse see steriilsele mört ja põhjalikult purustatud steriilsete kääridega. Sellele läga lisati steriilse jõeliiv koguses võrdne selle massi ja seejärel laetuna 0,5-1.0 ml isotooniline naatriumkloriidi lahus, ja kõike hõõruti kuni pastalaadse lisandiga isotooniline naatriumkloriidi lahus (4-5 ml). Seejärel lastakse massil seista 1-1,5 minutit, supernatanti uuritakse.

Luu ja liigeste tuberkuloos. Steriliseeritud süstlaga saadud punktsioon (abstsessivähk) asetatakse steriilsetesse anumatesse ja viiakse koheselt laboratooriumisse. Steriilne pipett, mis on varem niisutatud steriilset isotoonilist naatriumkloriidi lahust, võetakse 2-5 ml poolit, viiakse pudeli helmestega ja lisatakse veel 2-3 ml isotoonilist naatriumkloriidi lahust. Pudel suletakse korgiga ja loksutatakse jutustaja seadmega 8-10 minutit. Homogeenitud suspensiooni uuritakse.

Osteoartikulaarse tuberkuloosi fistuloossete vormide korral võetakse fistulast pool. Kogukas kogus kogutakse otse katseklaasi. Piide vähese eritumise korral pestakse fistul steriilset isotoonilist naatriumkloriidi lahust ja uuringusse suunatakse proovivõtutorustikus kogutud pesuvedelik või tups, mis on immutatud vaha.

Kirurgiliste sekkumiste käigus saadud luu ja liigeste ajal saadud kirurgiline materjal võib koosneda pelleerivast-nekrootilistest massidest, granulatsioonidest, armide kudedest, luukudest, sünoviaalmembraanidest ja muudest substraatidest. Selle ravi toimub nagu neerude tuberkuloosiga.

Koobumise vältimiseks tehakse vahetult pärast punktsioonimist sünoviaalvedeliku mikrobioloogiline uuring 3% naatriumtsitraadi lahuses (suhe 1: 1).

Lümfisõlmede tuberkuloos. Uuritakse ka lümfisõlmede punktsiooniga ekstraheeritud põlve. Kui abstsessi pool. Kirurgiliste sekkumiste, biopsiate käigus saadud lümfisõlmede kudesid uuritakse nagu teisi tuberkuloosi vorme.

Mycobacterium tuberculosis'e väljaheidete masside uuring on väga positiivsete tulemuste puudumise tõttu äärmiselt haruldane.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium mikroskoopia

Röpi mikroskoopia on suhteliselt kiire, lihtne ja odav meetod, mida tuleks kasutada kõigil tuberkuloosi kahtlusega juhtumitel. Lisaks sellele viiakse see uuring läbi, et hinnata kemoteraapia efektiivsust ja tõestada ravi taastumist või ebaõnnestumist, kui puudub kultuuriskeem.

Kasutatakse kahte mikroskoopilise uurimise meetodit:

• otsemikroskoopia meetod, kui määrdega valmistatakse otse diagnostilist materjali;
• Kultiveeritud puhastatud materjalist valmistatud setete mikroskoopia meetod.

Esimest meetodit kasutatakse nendes laborites, kus tehakse ainult mikroskoopilisi uuringuid (üldise meditsiinilise võrgu kliinilised ja diagnostilised laboratooriumid).

Mikroskoopilise uurimise parimad tulemused saadakse diagnostika materjali kontsentreerimisel (näiteks tsentrifuugimisega).

Mikroskoopia läbiviimiseks 50% -lise müokobakteri tuberkuloosi avastamiseks peaks 1 ml rögast sisaldama enam kui 5000 mikroobset rakku. Tuberkuloosi kopsuvormidega patsientide röga sisaldab tavaliselt märkimisväärses koguses happeaktiivseid baktereid, mis võimaldab neid usaldusväärselt tuvastada bakterioskoopia abil. Selle meetodi diagnostilist tundlikkust on võimalik parandada, uurides ühest patsiendist mitu rögaproovi. Bakterioskoopilise uurimise negatiivne tulemus ei välista tuberkuloosi diagnoosimist, kuna mõnedel patsientidel on röga vähem mükobaktereid, kui mikroskoopia abil tuvastada. Raskema rämpsposti nõrk ettevalmistus võib põhjustada ka bakterioskoopilise uuringu negatiivse tulemuse.

Kõige tavalisem happekindlate mükobakterite tuvastamiseks mustuses on värvus vastavalt Tsiol-Nelsenile. Meetod põhineb karboolse fuksiini sisenemisel mikroobikarakteris membraaniga, mis sisaldab vaha-lipiidikihi, samal ajal kuumutades ja tugevat fenooliga söövitavat toimet. Lahuse värvimuutus 25% väävelhappe või 3% vesinikkloriidhappe lahusega muudab värvuse muutuse kõigi mittehappeliste struktuuride värvimuutusena. Määrdunud värvunud elemendid värvitakse 0,3% metüleensinise lahusega. Mükobakterid ei tunne tavalisi aniliinvärvaineid, mille tulemusena happelised mükobakterid on värvitud punakaspruun ja muud mikroobid ja rakulised elemendid - sinisega.

Suhe määrdub värviti Ziehl-Nelsenu kasutada valgust binokulaarmikroskoobiga koos õliimmersioonis läätse (90- või 100-kordne tõus) ja okulaar 7- või 10-kordse suurendusega. Avastage 100 vaatevälja, mis on piisav üksikute mükobakterite tuvastamiseks määrdumisel. Juhul, kui sellise uuringu tulemus on negatiivne, on kinnitamiseks soovitatav vaadata veel 200 vaatevälja. Record tulemused, näidates tuvastatud happe kiire bakterid (KUM) arvu.

Lisaks sellele tehnikale kasutatakse luminestsentsmikroskoopia jaoks värv fluorokroom, mis võimaldab saavutada parimaid tulemusi. Selle meetodi kasutamine suurendab mikroskoopia efektiivsust 10-15% võrra. Mükobakterite töötlemisel luminestsentsvärvidega (auramiin, rodamiin jne) seostavad need ained ka mikroobiriku vahataoliste struktuuridega. Kui värviliste rakkude kiirgamine põneva valgusallikaga (teatud ultraviolettkiirguse spekter) hakkab vilkuma oranži või eredalt punase valgusega mustal või tumerohelisel taustal. Tänu nähtava kuju suurele heledusele ja kontrastsusele saab mikroskoobi üldist suurendust 4-10 korda vähendada, vaateväli laieneb ja preparaadi vaatamise aeg väheneb. Sellega seoses võite uuringu mugavuse tõttu suurendada ka sügavust.

Kui sama pindala vaatamiseks kasutatakse fluorestsentsmikroskoopiat, kulub maatriks märkimisväärselt vähem aega kui Tsiol-Nelseni värvimise valguse mikroskoopiaga. Kui tööpäeva puhul uurib mikroskoop umbes 20-25 sellist määrdumist, siis saab fluorestsentsmikroskoopia abil uurida samal ajal rohkem kui 60-80 proovi. Kogenud mikroskoopistid teavad, et auramiini ja rodamiini seguga rakkude värvus on mingil moel spetsiifiline happeliste bakterite suhtes, mis antud juhul näevad välja nagu kuldsed pulgad. Saprophyte värvitakse rohekas värvusega.

Teine oluline eelis meetodi Fluorestsentsmikroskoopiauuring - võimet tuvastada muutunud Mycobacterium, kaotas mõjul kahjustav tegur, sealhulgas intensiivset keemiaravi, kislotousotoychivosti vara ja ei avastata oleva käesoleva värvimisega Ziehl-Nelsenu.

Fluorestsentsmikroskoopia meetodi puudused hõlmavad mikroskoobi suhteliselt kõrget maksumust ja selle toimimist. Kuid tsentraliseeritud või muudes suurtes laborites, kus koormus ületab kolme tavalise mikroskoobiga töötava laboratooriumi normi, on odavam kasutada selle asemel ühte fluorestsentsmikroskoopi.

Bakterioskoopilised meetodid on üsna kõrge spetsiifilisusega (89-100%). Umbes 97% positiivsetest tulemustest, mis on saadud mis tahes mikroskoobi meetodil, kinnitatakse külvi tulemustega ühemõtteliselt.

Tuleb märkida, et patoloogilise materjali äravoolu mikroskoopilise uurimise korral ei ole võimalik kindlaks määrata kindlaksmääratud happelisest mükobakterist kuuluvaid liike. Mikroskoopia meetod võimaldab esitada arvamus ainult juuresolekul või puudumisel hapet valmistamiseks mikroorganismide, mida saab seletada olemasolu milline arvukate morfoloogiliselt sarnased tuberkuloossete mükobakterite kompleksi nontubercular happekindlatest mikroorganismid.

Mikroskoobi tulemusi hinnatakse poolkvantitatiivsete ühikutes.

Selleks, et oleks võimalik võrrelda erinevate mikroskoopiliste meetodite tulemusi, võetakse kasutusele empiirilised koefitsiendid. Näiteks selleks, et võrrelda tulemusi määrdub värviti fluorestsentsvärvainetega andmed teadus- valgusmikroskoop (1000 kordne suurendus), on vaja jagada mitmeid happe batsillide poolt avastatud fluorestsentsmikroskoobile, saadi vastavad koefitsient 250-kordse suurendusega - kuni 10, 450 korda - kuni 4, 630-kordselt - kuni 2-ni.

Vähi-tuberkuloosi mikroskoopia tunnused

Tehakse otsene mikroskoopia, samuti pärast rikastamist valmistatud määrde mikroskoopia, millele järgneb Tsiol-Nelseni värvimine või luminestsentsvärvained. Määrdiste otsene mikroskoopia on ebatõhus mikobakterite madala kontsentratsiooni tõttu materjalis, mistõttu on ratsionaalsem kasutada rikastamise meetodeid. Kõige tõhusam on tsentrifuugimine. Kui bioloogilise materjali on viskoosne, tsentrifuugimine kantakse samaaegsete vedeldamise ja homogeenne materjal, mis viiakse läbi, kasutades suure kiirusega tsentrifuugide tsentrifugaaljõud 3000 g ja hüpokloritilahuste. Bioloogiliselt ohtlike aerosoolide tekke tõttu ei kasutata praegu teisi rikastamise meetodeid, nagu mikroflotation.

[37], [38],

Tuberkuloosi diagnoosimise kultuurimeetod

Külvamismeetod või kultiveerimismeetod on tundlikumad kui määrdunud mikroskoopia ja sellel on mitmeid eeliseid. See võimaldab katsematerjalil tuvastada kümneid elujõulisi mükobaktereid ja neil on suur diagnostiline väärtus. See on eriti oluline, kui uurite materjali äsja diagnoositud või ravitud patsientidelt, kes vabastavad väikese koguse mükobaktereid.

Võrreldes mikroskoopiaga võimaldab kultuuriuuenduste abil suurendada rohkem kui 15-25% -ga diagnoositud tuberkuloosihaigete arvu ning kontrollida tuberkuloosi varasematel etappidel, kui haigus on veel ravitav. Kultuuritesti väga oluline eelis on võimalus hõivastaja kultuuri saamiseks, mida saab identifitseerida ja uurida ravimite tundlikkuse, virulentsuse ja teiste bioloogiliste omaduste suhtes.

Viljelusmeetodite puudused hõlmavad nende kestust (materjalide ooteaeg jõuab 10 nädalani). Kõrgem hind, diagnostilise materjali töötlemise keerukus.

Diagnostilise materjali ravi eelseisundi põhimõtted

Tuberkuloosi uuringute läbiviimiseks ei saa kasutada tavapäraseid mikrobioloogilisi meetodeid. See on tingitud asjaolust. Et mükobakteri tuberkuloos kasvab väga aeglaselt ja enamik kliinilisi proove sisaldavad kiiresti kasvavaid püogeenseid ja putrefaktiivseid mikroorganisme, seeni. Rikaste toitainete keskmine kiire kasv soodustab mükobakterite arengut ja ei võimalda tuberkuloosi tekitajat isoleerida, mistõttu enne seedimist tuleb diagnoosimaterjali eelnevalt töödelda. Peale selle ümbritsevad patsiendi hingamisteedest vabanenud mükobakterid suures koguses lima, mistõttu on nende kontsentreerimine keeruline. Seoses sellega, enne istutamist röga ja muud sarnased materjalid, nende veeldamine, saastest vabastamine on vajalik.

Kõik pesuvahendid ja dekontamiinid mõjutavad mükobaktereid rohkem või vähem. Töötlemise tulemusena võib kuni 90% mükobakteritest surra. Et hoida piisavalt Mükobakteriaalse elanikkonnast, säästes vajadust kasutada töötlemise tehnikaid, mis võimaldavad ühelt poolt, et tõkestada kiiresti kasvav püogeenne bakterite ja roiskunud ja teiselt - säilitada elujõulisus mükobakterite materjalis.

Sõltuvalt materjalist, selle homogeensusastmeni ja reostuse eeltöötlemiseks kasutades erinevaid saasteärastajaga: röga - 4% naatriumhüdroksiidi lahusega, lahused trohzameschonnogo naatriumfosfaadi 10%, bensalkooniumkloriidi, Trinaatriumfosfaadi, NALC-NaOH (N-atsetüül-L-tsüsteiin naatriumhüdroksiidi) lõppkontsentratsioonis 1% NaOH, uriini ja muud vedelad materjalid - väävelhappelahust 3%, kui saastunud proove, rasva sisaldavaid materjale - oblikhappe kuni 5%. Lisaks kasutatakse mõnel juhul ensüüme, pindaktiivseid aineid (detergente). Tweeni ja mõnede teiste pesuvahendite kasutamisega kaasneb mükobakteriaalsete rakkude väiksem surm (40-50% elulemusest). Kuid neid saab kasutada ainult vedelate materjalide jaoks. Suurim levik maailmas oli NALC-NaOH. Toodetud komplektides. See meetod võimaldab jaotada rohkem kui 85% mükobakteriaalsete rakkude populatsioonist. Saasteärastamise tkanesoderzhaschih kuivainete raskem ära arvata, kuna erinevaid hajumist homogeniseerimisel raske. Näiteks võib lümfisõlmede biopsiaga ravi sageli kaasneda kõrvaliste taimede saastumise sagedus. Sellisel juhul võib kasutada 1% etooniumi.

Mittehomogeenne materjal homogeniseeritakse klaashelmestega puhastusainete juuresolekul. Vedelaid aineid eelnevalt tsentrifuugitakse ja töödeldakse ainult sade.

Külvi- ja inkubatsioonitehnikad

Pärast eeltöötlemist tsentrifuugitakse materjali, seeläbi sadestades mükobaktereid ja suurendades nende sisaldust settes ("sette rikastamine"). Saadud sade neutraliseeritakse ja inokuleeritakse (inokuleeritakse) tiheda toitainekeskkonna või vedelate (poolvedelate) söötmetega torude abil. Ülejäänud setetest valmistatakse määrdeid mikroskoopilise uurimise jaoks. Külvitehnik peaks vältima diagnostilise materjali ristsaastumist.

Mikrobioloogilise uuringu tulemuste usaldusväärseks kliiniliseks tõlgendamiseks tuleb järgida järgmist reeglit: mikroskoopia ja kultuuri uuringud tuleb läbi viia paralleelselt diagnostilise materjali samast proovist.

Inokuleeritud tuubid asetatakse horisontaalasendisse 2 päeva temperatuuril 37 ^° C termostaadiga . See tagab materjali ühtlasema absorbeerimise kultuurisöötmes. 2 päeva pärast viiakse katseklaasid vertikaalsesse asendisse ja hermeetiliselt suletakse kummi või silikoonpistikuga, et vältida külvimaterjali kuivatamist.

Kultuurid inkubeeritakse 37 ^umbes C 10-12 nädalat regulaarset iganädalast vaatamist. Iga eelvaate jaoks salvestatakse järgmised parameetrid:

• visuaalselt täheldatud ajavahemik alates külvipügi päevast;
• kasvutempo (CFU-de arv);
• saagi saastumine väliste mikroorganismide floora või seentega (sellised tuubid eemaldatakse);
• nähtava kasvu puudumine. Torud jäävad termostaati kuni järgmise vaatamiseni.

Toitained

Mükobakterite kasvatamiseks kasutatakse mitmesuguseid toitainekeskmeid; tihe, poolvedel, vedel. Siiski ei ole üheski teadaoleval toitainekeskkonnas omadusi, mis tagaksid kõigi mükobakterite rakkude kasvu. Seoses sellega soovitatakse efektiivsuse suurendamiseks samaaegselt kasutada 2-3 erineva koostisega toitainekeskkonda.

WHO soovitab Levensteini-Jenseni keskkonda tuberkuloosi tekitaja esmasel eraldamisel ja selle ravimite tundlikkuse kindlaksmääramiseks kasutataval standardkandjal. See on tihe munakeskkond, kus mükobakterite kasv kasvab 20.-25. Päeval pärast bakterioskoopiliselt positiivse materjali külvamist. Bakterioskoopiliselt negatiivse materjali põllukultuurid vajavad pikemat inkubatsiooni perioodi (kuni 10-12 nädalat).

Meie riigis pakkus E.R. Finn-muna keskkond Finn-II. See erineb selle poolest, et L-asparagiini asemel kasutab ta naatriumglutamaati, mis käivitab mükobakterite aminohapete teisi viise. Kasv esineb selles keskkonnas mõnevõrra varem ja mükobakterite eraldamise sagedus on 6-8% kõrgem kui Lowensteini-Jenseni keskkonnas.

Välistorptilise tuberkuloosi bakterioloogilise diagnoosimise tõhususe parandamiseks on soovitatav lisada modifitseeritud soome-II meedia toitainekeskkonna kompleksi. Kasvu kiirendamiseks lisatakse Soome-II toitainekeskkonnale täiendavalt 0,05% naatriumtioglükolaati, mis vähendab hapniku kontsentratsiooni. Et kaitsta ensüümi Mycobacterium süsteemide mürgiseid aineid lipiidide peroksüdatsiooni toitelahusesse Finn-II manustada antioksüdant α-tokoferoolatsetaadi kontsentratsioonis 0,001 mcg / ml. Diagnostilise materjali külvamine viiakse läbi standardmenetluse kohaselt.

Venemaa tuberkuloosivastases laboris kasutatakse ka teisi tiheda toitainekeskkonna modifikatsioone; pakkus G.G. Mordoviia toitainekeskkond "Uus", väljatöötatud V.A. Anicic toitainete söötmed A-6 ja A-9 jne

Tulenevalt asjaolust, et selles protsessis kemoteraapia on kahju erinevate metaboolsete süsteemide mikroobirakkude mõned mükobakteriaalse elanikkonnast kaotab võime normaalselt areneda tavapärases toitekeskkonnas ja nõuab osmootselt tasakaalustatud (või poolvedel) söötmed.

Diagnostilise materjali külvutulemuste hindamine ja registreerimine

Mõned tüved ja mükobakterite liigid kasvavad aeglaselt, kasv võib ilmneda isegi 90. Päevaks. Selliste põllukultuuride arv on väike, kuid see võimaldab taluda põllukultuure termostaadis 2,5-3 kuud.

Mycobacterium tuberculosis'e virulentkultuurid kasvavad tavaliselt mitmesuguste suuruste ja liikide R-kujuliste kolooniate kujul tihedas munakeskkonnas. Kolooniad kuivad, kortsus, elevandiluu, kergelt pigmenteerunud. Teises keskkonnas võib mükobakteri tuberkuloosi koloonus olla niiskem. Pärast keemiaravi või ravi ajal võib eraldada sujuvaid kolooniaid niiske kasvuga (S-vormid).

Põllukultuuride isoleerimiseks kasutatakse Mycobacterium tuberculosis'e mittetuuberkuloossete mükobakterite ja happekindlate saprofüütide eristamiseks eriuuringuid.

Positiivne vastus antakse pärast värvitud Tsiol-Nelseni määrde kohustuslikku mikroskoopilist uurimist kasvatatud kolooniatest. Mükobakterite kasvu korral määrdudes tuvastatakse eredad punased pulgad, mis asuvad üksi või grupis, mis moodustavad klambrid vildist või punutisest. Noortel kultuuride, eriti isoleeriti pikaajalist ravi patsientide keemiaravi, mükobakterite erinevad avaldunud polümorfismi, kuni haigusetekitaja kepikesekujulised koos lühikese peaaegu Kokoidsel või pikliku versioonid, mis meenutavad seeneniidistiku.

Mükobakterite kasvukiirust tähistab järgmine skeem: (+) - 1-20 cfu in vitro (vähene bakterite eritumine); (++) - 20-100 CFU in vitro (mõõdukas bakterite eritumine); (+++) -> 100 CFU in vitro (rikkalik bakteriaalne eritumine). Tuberkuloosi laboratoorses diagnoosimisel ei piisa, et vastata, kas mükobakteri tuvastatakse ühe või teise meetodi abil. On üksikasjalikult arusaadav mükobakterite populatsiooni ulatuse ja olemuse, selle koostise ja omaduste kohta. Need andmed võimaldavad meil õigesti tõlgendada protsessi seisundit, planeerimistaktikat ja õigeaegset ravi.

Viimastel aastatel on välja pakutud mükobakterite kasvu kiirendamiseks välja pakutud toitainekeskkond agaril põhineva koostisega erinevate lisandite ja spetsiaalse gaasisegu kasutamisega. Mükobakterite kasvu saamiseks nendes söötmetes tekib kasvatamise ajal suure süsinikdioksiidi (4-7%) sisaldus. Sel eesmärgil kasutatakse spetsiaalseid CO ₂ -inkubaatoreid. Kuid kõige rohkem välja töötatud automatiseeritud süsteemid mükobakterite kasvatamiseks: MGIT-BACTEC-960 ja MB / Bact.

Üks selline süsteem - MGIT süsteemi (mükobakterite kasvu näitab katseklaas), mis viitab kõrgtehnoloogilise tööstuse arenguks ja mõeldud kiirete tuberkuloosi mikrobioloogilise diagnostika ja Mycobacterium vastuvõtlikkust esmavaliku ravimid ja mõned teise rea ravimid. MGIT keskendub selle kasutamisele VASTES-960 seadme osana. Mikroorganismid kasvatatakse spetsiaalsetes torudes vedela toitainekeskkonnaga, mis põhineb modifitseeritud Middlebrook-7H9 söötmel. Mükobakterite kasvu stimuleerimiseks ja võõrkehade mikrofloora kasvu pärssimiseks kasutatakse MGIT kasvu lisa ja PANTA antibakteriaalsete ravimite segu.

Mikroorganismide kasv on salvestatud optiliselt. See põhineb fluorestsentsil, mis tekib siis, kui kasvu ajal tarbib mükobaktereid hapnikku. Hapnikuvastane fluorokroomne värvaine asub spetsiaalse katseklaasi põhjas ja kaetud silikoonikihiga. Kopeerimine mükobakterite viib langus summas hapniku toru ja kontsentratsiooni alandamine, mis põhjustab fluorestsentsi tõusu, mis muutub nähtavaks kiirituse tingimustes ultraviolettvalguse torudesse ja registreeritakse automaatselt valgusandurina sisseehitatud külmutusseade VASTES-960. Luminestsentsi intensiivsus registreeritakse kasvuühikutes (GU-kasvuühikud). Kasvuandmed salvestatakse arvutisse, kus neid saab automaatselt salvestada. Arvuti analüüs kasvukõvera võib anda teavet juuresolekul erinevaid Mycobacterium basseinid, sealhulgas nontubercular ja aitab hinnata kasvuomadustest mükobakterite.

Selliste süsteemide kasutuselevõtu tulemusena vähenes märkimisväärselt mükobakterite kasvu aeg, keskmiselt 11 päeva VASTES-960 ja 19 päeva MB / Bact'iga võrreldes 33 päeva tavalisel tihedas toitainekeskkonnas. Tuleb märkida, et need süsteemid nõuavad kõrgelt kvalifitseeritud personali. Materjali külvamiseks vedelas keskkonnas kaasneb tingimata külv Levensteini-Jenseni söötmes, mis mängib varukoopia rolli juhtudel, kui mükobakterite tuberkuloos ei põhjusta teistsugust keskkonda.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Mükobakterite ravitundlikkuse kindlaksmääramine

Määramine valikule ja tundlikkuse aste mükobakterite kuni tuberkuloosiravimitega on oluline kliiniline mõju, samuti epidemioloogilise hindamine ravimresistentse tuberkuloosi. Lisaks sellele on ravimiresistentsuse jälgimine võimalik hinnata tuberkuloosiprogrammi kui terviku efektiivsust, mis on tuberkuloosivastaste tegevuste kõikide komponentide tulemuslikkuse lahutamatu näitaja.

Ravitundlikkuse mitmekordsus ja ajastus:

• enne ravi alustamist, et määrata strateegia ja ravi taktika:
• Erinevate materjalide (röga, BAL-vedelik, uriin, eksudaadid, vedelikud jms) isoleeritud erinevate kultuuride puhul uuritakse kõiki isoleeritud tüvesid:
• ravi intensiivse faasi lõpus kliinilise ja radioloogilise dünaamika puudumisel:
• kui on vaja raviskeemi muuta järgmistel juhtudel:
  • röga rasva puudumine;
  • kultuuri uuesti eraldamine pärast röga-röga negatiivset;
  • esmakordse languse järel libisemiskindla kemoteraapia arvu järsult suurenemine. On hästi teada, et tuberkuloosihaigetelt materjalist eraldatakse tuberkuloosi tüved, mis on ravimite tundlikkuse seisukohast heterogeensed. Tüvede tundlikkus tuberkuloosivastastesse ravimitesse võib ravimite spektris, resistentsuse sageduses ja esinemissageduses erineda.

Aste ravimiresistentsuse Mycobacterium tuberculosis määrati vastavalt kehtestatud kriteeriumidele, mis on keskendunud kliiniline tähtsus ja stabiilsus sõltuvad aktiivsust TB-vastast ravimit, tema farmakokineetikat, kontsentratsioon haiguskolde. Maksimaalne raviaine ja nii edasi.

Mükobakterite ravimite tundlikkuse määramine toimub praegu mikrobioloogiliste meetodite abil:

• Absoluutsed kontsentratsioonid (lahjendusmeetod tihedas või vedelas toitainekeskkonnas),
• proportsioonid
• resistentsuse koefitsient.

Tavaliselt stabiilsust avaldub visuaalselt jälgitavad kolooniate teket Mycobacterium tuberculosis, kuid seal on tehnikaid, mis indutseerivad algstaadiumis kasvu jagunevad rakud Mycobacterium vormis värvusreaktsiooni abil. Need meetodid lühendavad katseaega 3-4 kuni 2 nädalat.

Unified Venemaa on pikendatud, WHO soovitatud komitee keemiaravi meetod absoluutne kontsentratsioon, mis on metoodilise seisukohast on kõige lihtsam, kuid see nõuab suurt täpsust ja standardimise laboratoorsed protseduurid. Ravimitundlikkuse test koosneb katseklaasidest, mille toitainesisaldus on modifitseeritud anti-TB ravimitega. Komplekt koosneb 2-3 torud erinevates kontsentratsioonides iga kasutatavad ravimid, üks juhttorudega ilma ravimita keskkonda ja ühe tuubi, mis sisaldas 1000 mcg / ml naatriumkloriidi Sali tsilovokislogo või 500 ug / ml paranitrobenzoynoy happe nontubercular avastamiseks mükobakterite kasvu.

Valmististe komplekti valmistamiseks kasutatakse modifitseeritud Levensteini-Jenseni söödet (ilma tärklist), mis valatakse kolbides. Igas kolvis lisatakse antituberkuloosse preparaadi sobiv lahjendusruum. Kolbide sisu segatakse põhjalikult, valatakse torudesse ja volditakse kallutatud asendis 40 minutit temperatuuril 85 ° C. Soovitatav on sööde mähitud elektriturul automaatselt temperatuuri reguleerimiseks. Kolmapäeval anti-TB ravimitega

1. Seeriat võib külmkapis hoida temperatuuril 2-4 ° C 1 kuu jooksul, teise rea preparaatidega - mitte rohkem kui 2 nädalat. Säilitamine söödet toatemperatuuril preparaatidega on vastuvõetamatu. Tuberkuloosivastaste ravimite lahuste valmistamisel võetakse arvesse nende aktiivsust, arvutades preparaadi mittespetsiifilise osa molekulmassiga kohandatud kontsentratsiooni, puhtus jne. Uimastitundlikkuse määramiseks kasutatakse ainult keemiliselt puhtaid aineid.

Meetodi põhimõte on määrata tuubulise ravimi kontsentratsioon, mis pärsib märkimisväärse osa mükobakterite populatsiooni kasvu. Kui seda õigesti tehakse, on sellel meetodil hea usaldusväärsus.

Enne testi tuleb kontrollida, et isoleeritud mycobacterium tuberculosis'e kultuuril ei oleks kõrvalist mikrofloorat. Mükobakterite kultuuris 0,9% naatriumkloriidi lahuses valmistatakse homogeenne suspensioon, mis sisaldab 500 miljonit mikroobset keha ml kohta (optilise hägususe standard on 5 ühikut). Saadud suspensiooni lahjendatakse 0,9% naatriumkloriidi lahusega (1: 10) ja igasse kultuurisöötme tuubi lisatakse 0,2 ml suspensiooni. Nakatunud tuube paigutati inkubaatorisse temperatuuril 37 ° C ja hoitakse horisontaalasendis 2-3 päeva kaldus pinna keskmise inokuleeriti ühtlaselt suspensiooniga Mycobacterium tuberculosis. Seejärel viiakse tuub vertikaalsesse asendisse ja inkubeeritakse 3-4 nädalat. Tulemused registreeritakse 3-4 nädala pärast.

Kuna ajastus agendi vabastamise kliinilise materjali toitekeskkonnale koosnema vähemalt 1-1,5 kuu ravimitundlikkuse võib saada see meetod ei ole varem kui 2-2,5 kuud pärast idumaterjalita. See on üks meetodi peamistest puudustest.

Mükobakterite ravitundlikkuse kindlaksmääramise tulemuste tõlgendamine teatavate kriteeriumide alusel. Tahketes kasvukeskkondades peetakse tundlik ravimi kontsentratsioon, mis on keskkonnas sisalduvate, kui kolooniate arvu mükobakterite in vitro kasvatatud selle ravimiga ei ole rohkem kui 20 rohke kasvu juhttoru ilma narkootikume. Ainult rohkem kui 20 koloonia juuresolekul on kultuur, mis on selle kontsentratsiooni suhtes resistentne. Praktikas kasvatamise tulemuste saamiseks pannakse katseklaasid peaaegu 20 cfu-ni. Tuleb kliinilises üksuses teatada, et tundlikkus või resistentsus on antud juhul piiritletud, kuna mõnikord võib see seletada kliiniliste näitajate fuzzy dünaamikat.

Erinevate ravimite jaoks on kindlaks määratud teatav kontsentratsioon, mille puhul täheldatakse mükobakterite populatsiooni kriitilise osa reproduktsiooni. Neid kontsentratsioone nimetatakse kriitiliseks. Stabiilsuse kriteeriumina kasutatakse mükobakterite populatsiooni kasvu preparaadis sisalduva toitainekeskkonna jaoks kriitilise kontsentratsiooniga.

Siseriikliku tuberkuloosi tava puhul ei piirdu ravimi resistentsuse kindlaksmääramisel ainult kriitiliste kontsentratsioonide määramisega. See on tingitud asjaolust. Et laiem määratlus tase ravimiresistentsuse võimaldab arstil täpsemini positsioneerida taktikat keemiaravi lehe teadmised toime tugevdamiseks ravimikombinatsioonidele Ristikkäin oodata resistentsus või kohaldada tõhusamate ravimite rühma, mida kasutatakse tuberkuloosiravimitega.

Absoluutne kontsentratsioonimeetod on kõige lihtsam, kuid see on kõige tundlikum, kui seda tehakse, kui seda tehakse. Proportsioonide meetod on usaldusväärsem, eriti teise rida ravimite tundlikkuse määramisel ja väljaspool Venemaad. Selles võetakse arvesse absoluutsete kontsentratsioonide meetodi puudujääke, kuid täideviimisel on see töömahukam.

See meetod on väga sarnane absoluutse kontsentratsioonimeetodiga. Proovide valmistamine ravimitega toimub samamoodi. Nagu absoluutse kontsentratsioonimeetodi puhul. Kuid mycobacterium tuberculosis'e suspensiooni seemneannet vähendatakse 10 korda. Mis kõrvaldab Mycobacterium tuberculosis'e teatud tüvede spontaanse resistentsuse sageduse sellistele ravimitele nagu etambutool, protionamiid, kapreomütsiin. Kontrollina kasutatakse 2 või 3 katseklaasi, mis on katseklaasides võrdne 10 ja 100 korda. Stabiilsuse kriteeriumiks on mükobakteri tuberkuloosi visuaalselt täheldatud kasvu osakaal. Narkootikumide 1. Liin stabiilsuse kriteerium on üle kasvu 1% esialgsest populatsioonist jaoks preparaadid 2. Seeria - kasv 1 või rohkem kui 10% esialgsest, sõltuvalt valitud kriitiline kontsentratsioon.

1997. Aastal töörühma, kes ja Rahvusvahelise Liidu heade tuberkuloosi TB ravimiresistentsuse teinud muudatusi nende kriteeriumide, pakkudes resistentsed mükobakteriteta mis kasvavad tahke muna meedia Lowensteini-Jensen järgmiste kontsentratsioonide juures:

• dihüdrostreptomütsiin - 4 ug / ml;
• isoniasiid 0,2 μg / ml:
• rifampitsiin 40 ug / ml:
• Etambutool - 2 μg / ml.

2001. Aastal pakuti järgmiste teisejärguliste ravimite jaoks (kriitilise osa puhul 1%) kriitilisi kontsentratsioone:

• kapreomütsiin - 40 mikrogrammi / ml;
• protionamiid - 40 mikrogrammi / ml;
• kanamütsiin - 30 ug / ml;
• viomütsiin - 30 mikrogrammi / ml;
• tsükloseriin 40 μg / ml;
• aminosalitsüülhape - 0,5 ug / ml;
• ofloksatsiin - 2 μg / ml.

Kasvu-tulemusi hinnatakse 4 nädala jooksul esialgselt ja pärast 6-nädalast kasvatamist - viimane.

Uuritavaks tundlikuseks pürasiinamiidi suhtes, mida tuberkuloosi kaasaegses kemoteraapias kasutatakse laialdaselt, on soovituslik kriitiline kontsentratsioon 200 μg / ml. Kuid siiani ei ole üldiselt aktsepteeritud meetodit selle ravimi resistentsuse kindlaks määramiseks tahkes toitainekeskkonnas, kuna selle antibakteriaalne aktiivsus avaldub ainult happelises keskkonnas (pH <6), mida on tehniliselt raske säilitada. Peale selle kasvavad paljude mükobakterite tuberkuloosi kliinilised kultuurid vastumeelselt happelise keskkonna munarakkudes.

Kvaliteedi hindamiseks tulemuste ravimi tundlikkustestile Mycobacterium, soovitatakse iga uue partii keskmise LJ kontrollida paralleelselt määramiseks tundlikkust standard muuseumi tüve H37Rv. Lisaks sellele on olemas teatavad mikrobioloogilised kriteeriumid, mida tuleb säilitada, et tehnikad annaksid hästi reprodutseeritava ja õigesti tõlgendatud tulemuse. Nendeks eluvõime Mycobacterium tuberculosis, eeskirjad tekib ühtlane suspensioon ja suspensioonikultuuridele selektsiooni reeglite Mycobacterium tuberculosis Esindavusuuring valitud bakterite hulga. Raviresistentsuse määramise usaldusväärsus väheneb bakterite vabanemisega väga vähesel määral.

Hiljuti peeti lootustandvaks meetodit, mis määrab ravimitundlikkuse määramise automatiseeritud süsteemide abil. Selles valdkonnas on kõige sobivamad VASTES MGIT-960 põhinevad arengud. Sellisel juhul määratakse mükobakteri tuberkuloosi ravitundlikkus kindlaks vastavalt proportsioonide modifitseeritud meetodile. Määramisprotsessi käigus võrreldakse tuberkuloosi müokobakteri kasvukiirust kontrolltopsis ja katseklaasides ravimitega. Et määrata tundlikkus streptomütsiini, isoniasiid, korallrahudel pitsinu ja etambutool kasutatakse rikastav lisaainete ja antibiootikumidega komplektis SIRE kit. Pürasiinamiidi tundlikkuse määramiseks kasutage PZA komplekti. Käigus suspension test Mycobacterium tuberculosis inokuleeritud katseklaasidesse narkootikume, samuti kontrolli torud valmissuspensiooni 100 korda kõikide ravimite arvatud pyrazinamide, kusjuures vedrustus on lahjendus 10 korda. Stabiilsuse kriteeriumiks on mükobakterite kasvukiirus 100 GU, kui kasvuprotsent saavutatakse kontrolltrassil 400 GU (vt "Kultuurimeetodid mükobakterite eraldamiseks"). Tulemuste arvestus ja tõlgendamine toimub automaatselt ning need määravad sisend või valitud programm.

Nagu on kriitilised kontsentratsioonid, kasutatakse lõpp-kontsentratsiooni katseklaasis vedelate toitainetega. Praegu on kriitilised kontsentratsioonid välja töötatud nii esimese kui ka teise rühma ravimite jaoks. Tuleb märkida, et mükobakterite tuberkuloosi tundlikkus tsükloseriini ja aminosalitsüülhappe suhtes määratakse ainult munade toitainekeskkonnas.

Töötada tööd kirjeldatud protokollile süsteem võimaldab uurida ravimtundlikkus nagu pühendatud kultuuri (Paks toitekeskkond) ja kasutatakse esmase Mycobacterium MGIT-kasvu in vitro. Viimane võimalus vähendab oluliselt aega kultuur, mis võimaldab teil saada täielikke tulemusi kultuuri Mycobacterium tuberculosis (sealhulgas teave ravimtundlikkus) pärast 3 nädalat alates materjali kogumist, samas kui traditsiooniline meetod on võimalik saada ainult 3. Kuul. Aja jooksul saab saadud tulemused, kui patsient on intensiivse ravi faasis, kompenseerida uuringute suhteliselt kõrget hinda.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Mükobakterite diferentseerimine

Võttes arvesse, et kasutatud toitainekeskkond ei ole rangelt selektiivne. Eraldatud mükobakterite hilisemat eristamist peetakse kohustuslikuks. Vajadus diferentseerumist mükobakterite on tingitud mitmete funktsioonide patoloogiliste protsesside poolt põhjustatud perekonnast: teise käigu ja tulemuste tuberkuloos ja mükobakterioosi, oleva loomuliku ravimiresistentsuse mõningal tuberkuloosiravimitega.

Tõdetakse, et esmane tuvastamine Mycobacterium tuberculosis kompleksi M. Nontubercular mükobakteriteta teostatakse järgmised omadused: kasvukiirust tahkel toitekeskkonnale, pigmentatsioon Koloonia morfoloogia, esinemine happekindlus ja temperatuuri optimaalse kasvu.

Kahjuks puudub ühtne laborimeetodit usaldusväärselt eristada M. Tuberculosis complex mükobakterite teistele happe batsillide siiski kombinatsiooni ülalkirjeldatud funktsioonid tulemustega toodud allpool mitmete biokeemiliste testidega võimaldab tuvastada Mycobacterium tuberculosis kompleksi M. Tõenäoliselt 95%.

Eristamise Mycobacterium kompleksi M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti'st, M. Canettii jt) alates aeglase kasvuga mükobakterite kasutatud nontubercular biokeemilised testid, mis tuvastavad juuresolekul järgmistest sümptomitest:

• võime toota nikotiinhapet (niatsiini test):
• nitraadi reduktaasi aktiivsus;
• termostabiilne katalaas;
• kasvu keskkonnas naatriumsalitsülaadiga (1 mg / ml).

Täiendavate testitena võib kasutada ka kasvu keskkonnas, mis sisaldab 500 ug / ml paranitrobensoehapet või 5% naatriumkloriidi.

Paljud bakterioloogilised laborid tuvastavad need mikroorganismid ainult kompleksi tasandil, mis tuleneb laborite piiratud võimekusest ja spetsialistide metoodilisest võimekusest.

Enamikul juhtudel on aga praktikas eristamisel M. Tuberculosis ja M. Bovis piisab järgmised katsed: niatsiin, esinemise nitraati, juuresolekul registreerimine ja pirazinamidazy kasvu sisaldavas keskkonnas 2 ug / ml hüdrasiidiga tiofeen-2-karboksüülhape. Arvatakse, et M. Tuberculosis kompleksi mükobaktereid iseloomustavad järgmised tähemärgid:

• aeglane kasv (üle 3 nädala);
• kasvutemperatuur vahemikus 35-37 ^o C;
• pigmentatsiooni puudumine (elevandiluu);
• märgistatud happe kiire värv;
• positiivne niatsiini test;
• positiivne nitraadi reduktaasi test;
• termostabiilse katalaasi puudumine (68 ^° C).
• Kasvu puudumine Levensteini-Jenseni söötmes, mis sisaldab:
  • 1000 ug / ml naatriumsalitsülaati,
  • 500 ug / ml paranitrobensoehapet
  • 5% naatriumkloriid:
• kasv 1-5 ug / ml tiofeen-2-karboksüülhappe juuresolekul.

Isoleeritud mükobakterite eristamise olulisus suureneb märkimisväärselt tuberkuloosi või mükobakterioosiga seotud HIV / AIDS-i juhtude sageduse suurenemisega. Praegu ei ole absoluutselt kindel praktiliste piirkondlike laborite valmisolek selle töö mahu õigeks teostamiseks.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Tuberkuloosi immunoloogiline diagnoos

On olemas mitmeid universaalseid nähtusi, ravimid ja immunoloogilised testid, mis esialgu leiti täpselt tuberkuloosist või mükobakterite immuunvastuse mudelist. Nendeks BCG Tuberculin selline nähtus nagu naha DTH (tuberkuliini - Pirquet ja Mantoux reaktsioon), reaktsiooni nahaaluse tuberkuliini tundlikuks loomad (Koch nähtus). Tuberkuloosist leiti ka üks esimesi nakkushaiguste antikehi. Muidugi, sügavamat arusaamist hea tuberkuloosi puutumatuse mehhanismid ja nende geneetilise kontrolli, seda suurem võib olla immunoloogiliste meetodite ja ravimeid, mis mõjutavad immuunsüsteemi, et lahendada praktilisi probleeme TB.

Praegu peetakse kõige olulisemat ja keerulisemat praktilist probleemi tuberkuloosi avastamiseks rahvastiku massilisel sõelumisel. Kuid hoolimata arvukatest "edukate" aruannete (piiratud materjalist) puudumisel ei ole sobivat immunoloogilist meetodit (mis on reprodutseeritav "igasugustes kätes") ja selleks sobiv ravim.

Kliinilises praktikas kasutatakse väga laialdaselt immunoloogilisi meetodeid, eriti seroloogilisi uuringuid (antigeenide määramine, antikehad) ja tuberkuliin provotseerivaid katseid.

Esiteks on diferentsiaaldiagnostikas kasutatavate immunoloogiliste uuringute hulgas olemas seroloogilised meetodid - antigeenide ja antikehade määramine organismi erinevates keskkondades.

Mükobakterite tuberkuloosi antikehade spetsiifilisus sõltub immuunanalüüsis kasutatud antigeenidest. Esitatakse märkimisväärne kogus antigeene, millest esimene on tuberkuliini PPD:

• PAP ja muud komplekspreparaadid kultuuri vedelikust;
• ultraheli lagunemine;
• Tritoniekstrakt ja muud raku seina komplekssed preparaadid;
• 5-antigeen (Daniel);
• 60-antigeen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• nöörifaktor (trehaloos-6,6-di-mikolaat);
• fenool ja muud glükolipiidid;
• lipopolüsahhariidid;
• fibronektiini siduv antigeen;
• valgud (enamasti rekombinantsed); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA jne

Selle tulemusena aastat uurimistööd Venemaa ja välismaa teadlased on näidanud põhilisi seadusi ja tõhusust antikeha seroloogiliste tuberkuloosi diagnoosimiseks: keerulisem antigeeni, seda suurem tundlikkus ja madalam spetsiifilisus test. Eripära erinevates riikides varieerub sõltuvalt populatsioonist M. Tuberkuloosiinfektsiooni ja nontubercular mükobakterite veavad BCG vaktsineerimise ja teised. Lastel infosisaldust serodiagnoosi on väiksem kui täiskasvanutel. Esmasel tuberkuloosil (sagedamini lastel) on IgM-i määratlus informatiivsem. Sekundaarse IgG-ga. HIV-infektsiooniga patsientidel vähendatakse antikehade määramisel seradiagnostika informatiivset väärtust. Kasutegur antikehade määramisel sõltub mitmeid "kliinilised aspektid": protsessi aktiivsust (olemasolu või puudumine "isolatsiooni" mükobakterite juuresolekul lagunemine õõnsusi, aste infiltratsiooni), levimus protsessi kestuse voolusuunda.

Ensüümimeetodi (ELISA) meetodi tundlikkus on umbes 70%. Uuringu ebapiisav efektiivsus tuleneb selle madalast spetsiifilisusest. Varem kaaluti võimalust kasutada seroloogilist skriinimist kõrge riskiga rühmades, eriti patsientidel, kellel on pärast tuberkuloosi muutused kopsudes.

ELISA spetsiifilisuse suurendamiseks jätkatakse spetsiifiliste antigeenide, sealhulgas geenitehnoloogiaga saavutatud tulemuste otsinguid: ESAT-6 jne (vt eespool). Rangelt spetsiifiliste antigeenide kasutamine (38 kDa, ESAT) suurendab spetsiifilisust. Kuid vähendab oluliselt analüüsi tundlikkust. Koos IFA (eksperimentaalne laborikatset süsteeme. Nt Pathozyme ELISA komplekti) näeb samuti ette kits koos külgmiste immunokromatograafilisel filtreerides (Mycodot), samuti teisi sarnaseid teste (dot-analüüsi membraanid) visuaalhindamise katsetulemuse. Nende testide ajal viiakse analüüs läbi 10-30 minutit; nad ei nõua spetsiaalset varustust, nad vajavad visuaalset tulemuste hindamist, mis on seotud teatud subjektiivsusega. Nendel meetoditel on ligikaudu samasugused tundlikkuse ja spetsiifilisuse näitajad (vastavalt 70% ja 90-93%) kui traditsiooniline ELISA.

Kasutamise immunoanalüüsimeetoditega on teatud väärtuse täiendava kompleks arvestada meetodites, eristusdiagnoosis TB, eriti diagnoosi Kopsuvälise vorme ta. Kõige tõhusam ELISA meetod on tuberkuloosi meningiidi diagnoosimisel tserebrospinaalvedeliku uuringus. Sellisel juhul on analüüsi tundlikkus 80-85% ja spetsiifilisus 97-98%. Tuberkuloosset uveiidi diagnoosimisel on andmed rebenenud vedelike mükobakterite tuberkuloosi antikehade avastamise efektiivsuse kohta.

Gamma interferooni sünteesi induktsioon in vitro

Gamma interferoon (IFN-y) on spetsiifiline immuunkaitsefaktor, mis on realiseeritud aktiveerides makrofaagide ensüümi süsteeme. Sensibiliseeritud T-lümfotsüütide IFN-γ sünteesi induktsioon põhjustab nende interaktsiooni mükobakterite antigeenidega.

Antigeenidena kasutatakse tuberkuliini PPD-d. Ja spetsiifiliste antigeenide saadud geenitehnoloogia, eelkõige antigeenide ESAT-6 (varase eritatud antigeeni molekulmassiga 6 kDa) ja CFP-10 (kultuuri filtraati valku 10 kDa). Geneetiline tehnika või rekombinantsed antigeenid puuduvad BCG vaktsiini ja teiste mükobakterite rakkudes. Tuberkuliini kasutamisel on induktsiooni testi IFN-γ tulemused võrreldavad tuberkuliini nahakatsetuse tulemustega (otsene korrelatsioon). Geneetiliselt muundatud antigeenide kasutamisel on testi tulemused täpsemad ja ei sõltu BCG eelnevast vaktsineerimisest. Kui testiti vaktsineeritud inimesi, kes ei olnud kontaktis tuberkuloosi nakkusega, on testi spetsiifika 99%. Katse tundlikkus tuberkuloosihaigete puhul on 81 ... 89%.

Katsed ja diagnostilised vahendid on välja töötatud põhineb lühiajalise rakkude kultiveerimiseks või täisverd mononukleaarsed rakud verest eraldatud antigeenidega Mycobacterium tuberculosis in vitro koos järgneva määramiseks IFN-γ kontsentratsiooni või loendades T-lümfotsüütide, mis sünteesivad IFN-γ. Kontsentratsioon interferooni sünteesitakse in vitro määrati ELISA meetodil, kasutades monokloonseid antikehi siduva IFN-γ. Seejärel määratakse standardse IFN-γ kalibreerimise teel selle kontsentratsioon plaadi katseklaasis või süvendites.

Elisopti testi läbiviimisel arvutati IFN-γ sünteesiva T-lümotsüütide arv. Loendatakse IFN-γ antikehadega kaetud plaadi pinnale.

Arendajad DIAGNOSTICUM IFN-γ in vitro induktsiooni kaudu, mis on heaks kiidetud Ravimiamet ja USA tooteid, väidavad, et test on võimatu eristada varjatud TB nakkuse aktiivne tuberkuloos. Seetõttu on kõrge nakatumisega piirkondades katse otseselt diagnoosimata. Kuid meie riigis saab seda kasutada tuberkuloosi infektsiooni eristamiseks vaktsineerimisjärgse allergia järgselt lastel ja spetsiifilise immuunsuse taseme hindamisel raviprotsessis.

Praegu uuritakse sisemist katsesüsteemi in vitro spetsiifiliste tuberkuloosivastaste antigeenide IFN-γ sünteesi indutseerimise määramiseks.

Immuunseisund ja tuberkuloosi liik, immunokorrektsioon

Inimestel esineva tuberkuloosi ravis muutuvad antigeenium ja immuunsüsteemi seisund.

Andmed muutuste kohta eksudatsioonides ja kudedes on suures osas vastuolulised. Ainus asi, mida on hästi põhjendatud, on see, et tuberkuloossete granuloomide puhul on reeglina tuvastatud märkimisväärne arv aktiveeritud T-lümfotsüüte.

Mõistlik on ka veel kaks sätet, mis on vajalikud, et mõista immunoloogiliste mehhanismide rolli inimeste tuberkuloosi ravis:

• AIDS-i patsientidel esineb eriti palju ravimiresistentsust;
• mitme ravimiresistentsusega (ja HIV-nakkuse puudumisel) on immuunhaigused (eriti T-rakkude seos) eriti olulised.

Kui tuberkuloosi laialdaselt rakendada erinevaid meetodeid immunomodulatsiooni: see on eelkõige ravimid, mis toimivad peamiselt T-rakuline immuunsus ja süsteemi ühetuumalised fagotsüüdid (tüümuse hormoonid, isoforoon, likopid, polioksidony jt.). Samuti terved (nõrgestatud) mükobakterid ja nende komponendid.

Tuberkuloosi molekulaar-bioloogiline diagnoosimine

Molekulaarbioloogilisteks meetodeid diagnoosimisel nakkushaigused hõlmavad peamiselt meetodeid, mis põhinevad manipuleerides genoomse materjali bakteriaalsete ja viiruslike patogeenide selgitada spetsiifilise geneetilise materjali - DNA segmendid, mille nukleotiidjärjestus on spetsiifilised teatud tüüpi või patogeeni tüvesid analüüsida konkreetsete DNA järjestused geenides, mis määravad patogeeni tundlikkuse teatud raviainete suhtes, samuti funktsionaalse analüüsi jaoks patogeenide teatud geenide aktiivsus. Molekulaarbioloogilisi meetodeid olid laialdaselt teadusuuringute ja praktiline kohaldamine diagnoosimine ja jälgimine erinevate bakteriaalsete ja viiruslike infektsioonide pärast avamist 1985. Aastal, Carrie Myullisom (Nobeli preemia. 1989) polümeraasi ahelreaktsiooni.

Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhimõtted ja võimalused

PCR võimaldab mitmel korral mitu korda korduvalt in vitro amplifitseerida nukleotiidjärjestust (patogeeni DNA fragmenti). Reaktsioon ühe DNA ahela juuresolekul määrab testi väga kõrge tundlikkuse.

DNA ahela teatud piirkondade nukleotiidjärjestus määrab kindlaks mikroorganismi geneetilise identiteedi, mis seletab PCR-i kõrget spetsiifilisust.

Selle väärtus meetodikat avastamise ja uurimisega omadused põhjustatud Mycobacterium tuberculosis bioloogilisi omadusi mikroorganismi, milles väga aeglase kasvuga: kahekordistumise aeg Mycobacterium tuberculosis DNA kui kultiveeritakse 12-24 tundi.

PCR-meetodi põhimõte seisneb võimendamises - mitu korda, miljoneid kordi. Korrutades spetsiifilise DNA järjestuse sektsioone tuubi mikrovolutsioonis järgmiste kolme reaktsioonietapi tsüklilise kordumise ajal, millest igaüks läbib erinevat temperatuuri režiimi:

• I etapp - kaheahelalise DNA denatureerimine kuumutamisel selle ketide lahknemisega;
• II staadium - praimerite (kruntivate oligonukleotiidide) komplementaarne seondumine (hübridiseerimine) rangelt spetsiifiliste ahelate otsmiste sektsioonidega, mis on valitud DNA fragmendi paljundamiseks;
• III etapp - DNA fragmendi ahela lõpuleviimine termostabiilse DNA polümeraasi abil.

In vitro amplifikatsiooniks peavad olema maatriks-DNA molekulid. Neli tüüpi deoksünukleosiidi trifosfaate (nukleotiide), mis sisaldavad vastavaid lämmastikku sisaldavaid aluseid: adeniin (A), tümiin (T), guaniin (D), tsütosiin (C); kunstlikult sünteesitud praimimis-oligonukleotiidid (praimerid), mis koosnevad 18-20 aluspaarist; Termostabiilset DNA polümeraasi ensüümi optimaalne temperatuur 68-72 ^aasta C ja magneesiumioonid.

PCR-spetsiifilisus sõltub DNA fragmendi valikust. Vastavalt sellele sünteesitakse külgeseemnete oligonukleotiide. DNA ahela hübridiseerimise ja valmimise eripära tuleneb järgmiste lämmastikaluste paaride adenün-tümiini, guaniini-tsütosiini komplementaarsuse põhimõttest.

Et määrata genoomse tuberkuloossete mükobakterite kompleksi tõhusaim sihtmärgi amplifikatsiooni enamikus testsüsteeme valitud DNA fragment IS6110, mis enamikel tüvede Mycobacterium tuberculosis genoomi on oluline arv (10-20) korduste, mis sätestab, koos spetsiifilisus, kõrge testi tundlikkuse. Samal ajal, Mycobacterium tuberculosis tüvedega kirjeldatud väikese korduste arvu või üldse IS6110 fragment.

DNA molekulide eraldamine bioloogilisest proovist

PCR läbiviimiseks tuleks patogeeni DNA molekulid eraldada bioloogilisest materjalist minimaalses mahus minimaalse hulga mittespetsiifilise DNA ja ensüüm-DNA polümeraasi erinevate inhibiitoritega.

Proovide ettevalmistamine peaks toimuma tingimustel, mis hoiavad ära eraldatud DNA molekulide proovide ristsaastumise. Selleks on vaja kloori sisaldavate lahustega ruumi eelpuhastamist ultraviolettkiirguse, põrandate ja tööpindadega lauadest ja seadmetest. Ka kohustuslike kindlate kindade, ühekordsete katseklaaside ja näpunäidete kasutamine kohustuslike pipettide jaoks.

Eraldati DNA Mycobacterium tuberculosis kliinilistest proovidest (tserebrospinaalvedelik, bronhiaalsetest pesu) ei sisalda suur hulk rakke, rakujäägiga või selle sooli, millest piisab tsentrifuugida proovi 3-4000. Pöörlemissagedusprofiil, lisama muda 20-30 ul 2% lahuse triton X-100 ja soojendati temperatuuril 90 ^umbes C juures 30 min.

Valmistamiseks rögaproovides peab olema tõhus veestamisel mida üldiselt kasutatakse 4% naatriumhüdroksiidi lahus ja N-atsetüül-L-tsüsteiin (NALC) koguses 50-80 mg proovi kohta - sõltuvalt proovi viskoossus. NALC lahust tuleb valmistada ex tempore'ist või NALC pulbrit saab otse proovist kuivada. Pärast vedeldamist tuleks proovid tsentrifuugida 15 minutit kiirusel 3,5-4000 pööret minutis (3000 g) 50 ml viaalides, kus on kruvikorgid, E. Samadel tingimustel, mis on soovitatavad flegma ettevalmistamiseks.

Ekstraheerimiseks DNA sademest meetodit kasutatakse enamasti põhineb kasutamist 5-6 molaarset guanidiinisotiotsüanaati lüüsireagendi nagu Mikropoorsest osakesed ja ränioksiidi ( "diatomiitmuld") sorteerimisel DNA molekuli. Mittespetsiifiline ained, sealhulgas inhibiitorid võimalik, siis pesta 2,5 molaarset guanidiinisotiotsüanaadiga ja etanooli lahusega, misjärel DNA molekuli desorbeerima veega ning neid proove teostamiseks kasutatud PCR. DNA ekstraheerimise tehnoloogia lihtsustamiseks asendatakse sageli diatomiitmuld ränioksiidiga kaetud magnetiliste mikroosakestega. Sellisel juhul kasutatakse osakeste sadestamiseks tsentrifuugimise asemel mikrotuubide jaoks spetsiaalset magnetvälja.

Venemaal töötati välja originaalne meetod mükobakterite immunomagnetilise eraldamise jaoks, millele järgnes patogeeni DNA ekstraheerimine. Suhe Mycobacterium tuberculosis immuunmagnetilised lahutamisega, kasutades ferroparticles suurus 3-5 mikronit, mis on kaetud ränidioksiidi, millele on kinnitunud keemilise sideme polüklonaalse (küülik) antikehade Mycobacterium tuberculosis. Röpi proovid pärast leeliselist lüüsi neutraliseeritakse happelise tris-HCI lahusega ja inkubeeritakse immunomagneetilises sorbendis. Seejärel kogutakse immunoferroosakesed magnetvardaga, millel on vahetatav ots, kantakse mikrotuubile ja sadestatakse. Lisada 20-30 μl 2% Triton X-100 lahust ja soojendada 30 minutit 90 ^° C juures. Supernatanti kasutatakse PCR analüüsiks DNA mallina.

Raske probleem on mükobakterite tuberkuloosi DNA eraldamine biopsiaproovidest. Ensüümi biopsia jaoks kasutatakse ensüümi proteinaasi K lõppkontsentratsioonil 200-500 mg / l 56 ^° C juures üleöö. Lisaks kasutatakse üht tuntud meetodit. Biopsiate PCR analüüsis ülemäärane mittespetsiifiline DNA põhjustab sageli reaktsiooni pärssimist, mis nõuab DNA korduvat ekstraktsiooni.

Tulemuste avastamise meetodid

Pärast reaktsiooni lõppemist tuvastatakse patogeeni amplifitseeritud DNA fragmendid mitmesuguste meetoditega.

Geeli elektroforeesimeetod on hästi teada. Saadud DNA fragmendi identifitseeritakse positiivne kontroll, mis sisaldab soovitud spetsiifilist DNA fragmenti või vastavalt tuntud suurusele (nukleotiidipaari arv), mis määratakse standardmolekulaarset markerit kasutades.

Spetsiifilise värvaine juuresolekul sisaldub etiidiumbromiid kaheahelalise DNA-ga. Sünteesitud DNA-fragment tuvastatakse ultraviolettkiirguse mõjul luminofooriks.

DNA-fragmendi suurus, mis on kindlaks määratud elektroforeesiga algusest kaugusest, peab vastama tuntud molekulmassi markerile või positiivsele kontrollile.

Muud määramisviiside PCR tulemused põhinevad hübridiseerumisega üheahelalised PCR produktid oligonukleotiidi sellega komplementaarne - DNA sond on märgistatud biotiiniga, millele järgnes kaudu tuvastamiseks ensüümreaktsioonide näiteks seostudes streptavidiiniga biotiin leeliseline fosfataas.

Seda tüüpi avastuste põhjal on loodud PCR-analüsaatorid, milles PCR-tulemuste tuvastamine toimub automaatselt, kui proovide optilist tihedust lugetakse pärast ensümaatilise reaktsiooni ilmnemist.

Nende meetodite puudused on DNA-molekulide suhteliselt lühikeste fragmentidega tehtavad intralatoorse saastumise võimalused. Kui molekulid sisestavad uued proovid, muutuvad nad PCR-i maatriksiks ja põhjustavad valepositiivseid tulemusi.

Sellega seoses võetakse valepositiivsete tulemuste vältimiseks kasutusele rangeid reegleid ruumide eraldamiseks ja eraldamiseks: DNA eraldamiseks bioloogilistest proovidest; ruumid tulemuste avastamiseks (elektroforees) puhta tsooni kohta. Need ruumid on tõenäolise saastumise tsoon. Teine isoleeritud piirkond on puhas ruum katseklaamides katsetatavate DNA proovide tutvustamiseks PCR reaktsiooniseguga. Lõpuks eeldatakse, et peamine seade - DNA-võimendi - tuleb asetada eraldi, tõenäoliselt kontorisse.

Selleks, et vältida toodete saastumist eelnevale reaktsioone - mõned Likon-amp PCR süsteemi katse asemel dezoksinukleozidtimidina sisaldada dezoksinukleoziduridin mis pärast in vitro süntees vooluringi ühendatud asemel õigesse asendisse, st Natiivses DNA-s sisalduva tümiini lämmastiku alus on asendatud uratsiiliga. Uratsiil DNA glükosülaasi lisatakse reaktsioonisegu analüüsitava hävitab ainult saastavate fragmendid deoksüuirdiiniga, kuid mitte DNA native analüüsiti. ; Järgnev kuumutamine temperatuuril 94 ^° C inaktiveerib seda ensüümi ja ei sega PCR amplifikatsiooni.

On olemas testi süsteem, mis põhineb rRNA isotermilisel amplifikatsioonil, mille puhul toimub kõigepealt DNA molekulide pöördtranskriptsioon ja süntees. Mis omakorda on RNA molekulide järgneva sünteesi maatriks. Reaktsioonitoru lahuses hübridiseerumisel tuvastatakse RNA amplikonid, kasutades akridiiniga värvitud DNA-sondit. Sellel meetodil on lisaks suurele tundlikkusele eeliseks ühe toru analüüsimine, mis takistab saastumist. Autorite sõnul on selle meetodi tundlikkus hingamisproovides 90%, spetsiifilisusega 99-100%.

Uued avastamismeetodid rakendatakse reaalajas PCR-is. Need meetodid erinevad peamiselt selle PCR-i meetodil ja selle tulemuste tuvastamine viiakse läbi ühe suletud toruga üheaegselt. See mitte ainult tehnoloogiliselt lihtsustab analüüsimeetodit, vaid takistab ka laboratooriumide ruumide ja prooviproovide saastumist eelmise PCR-i toodetega.

In reaalaja PCR avastamis- tulemused on tingitud fluorestsents ajal esinevast fluorogeensete hübridiseerimissondi DNA amplifitsi Rui-PCR käigus spetsiifilise DNA fragment. Struktuur fluorogeensete DNA sondide ehitatud nii, et fluorestsentsmarkerit vabaneb tulemusena ensüümreaktsiooni või distantseeritud kustutiga molekuli fluorestsentsi ainult konkreetsetel hübridisatsiooni soovitud DNA molekuli võimendub PCR. Nagu mitmed sondimolekulidega ristati fluorestsentsi tõusu on võrdeline tuvastasime taseme molekulide arvu võimendatud toodet. Kuna igal tsükli arv PCR fragment DNA molekuli korrutatakse poole, tsükli arvu, mille juures fluorestsentsi määratakse ja suurendab pöördvõrdeline mitmeid DNA molekule algvalimiga. Kui reaktsioon on tutvustada nii kalibraatoriks mitme erineva tuntud kontsentratsioone molekulid, mis DNA fragment Mycobacterium tuberculosis, kasutades arvutiprogrammi saab arvutada ja summa genoomse DNA test materjalist.

Iga standardproovi dubleeritakse. Kvantitatiivne kriteerium on kindlaksmääratud fluorestsentsi alguse ja kasvu jaoks vajalik minimaalne PCR-tsüklite arv. Abstsiss - tsüklite arv; ordinaat on fluorestsentsi väärtus. DNA kontsentratsioon on pöördvõrdeline fluorestsentsi vältimiseks vajalike tsüklite arvuga. Parempoolses veerus (21-32) märgitakse vastavate kontsentratsioonide tsüklilised numbrid. Erinevused DNA fragmentide 10-kordses kontsentratsioonis 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 tsüklit. Kahe patsiendi puhul oli IS6110 fragmentide kontsentratsioon ligikaudu 10 ³ / ml ja 10 ⁴ / ml. Arvestades Mycobacterium tuberculosis genoomis analüüsitud fragmentide kordusi (6-20), on kliinilistes proovides mükobakterite arv vastavalt umbes 100 ja 1000 rakku.

PCR kasutamine tuberkuloosi diagnoosimisel

PCR meetodit kasutatakse enamasti tuberkuloosi kiirendatud diagnoosimiseks - mükobakteri tuberkuloosi avastamine kliinilistes proovides: röga. Bronhide õhetus, pleura eksudaat, uriin, tserebrospinaalvedelik, osteolüüsipunktuur, naiste suguelundite aspiratsioonid ja mitmesugused biopsiaproovid. Uuringus Hollandis umbes 500 röga ja bronhiaallümfisõlmed lavaažrakkudes proove 340 patsienti diagnoosiga kopsutuberkuloosi uuriti võrdlemiseks tundlikkust PCR meetodeid, mikroskoopia ja kultuuriõpinguid määrdub. Analüüsi tundlikkus oli vastavalt 92,6,88,9 ja 52,4%. Kõigi meetodite spetsiifilisus oli umbes 99%.

Võrdleti Mycobacterium tuberculosis'e tuvastamist smearmikroskoopia abil, Levenstein-Jenseni söötme külvamist, VASTES-i katsesüsteemi ja PCR analüüsi. PCR näitas tundlikkust 74,4%, mikroskoopiat 33,8%, külvamist tihedas keskkonnas 48,9% ja VASTES 55,8%. Levenstein-Jenseni keskmise külvamise keskmine avastamisaeg on 24 päeva. VASTID - 13 päeva, PCR - 1 päev.

Arutletakse ka võimalused kasutada PCR-i tundliku ja kiire meetodina tuberkuloositõrje efektiivsuse jälgimiseks.

Tuvastamine Mycobacterium tuberculosis DNA PCR tõhusa kemoteraapia määrati pikema aja - keskmiselt 1,7 kuud võrreldes äigepreparaadina määratletud Fluorestsentsmikroskoopiauuring ja 2,5 kuud võrreldes bakterioloogilist uurimist.

Tuberkuloosi ekstrapulmonaalsete vormide diagnoosimine

Väärtus tundlikuks PCR meetod on eriti suur ekstrapulmonaale vorme, sest see moodustab nendes kliiniliste ja röntgenileiu meetodid tavalised bakterioloogiliste meetodite määramise Mycobacterium tuberculosis diagnostiliste materjalide ebaefektiivne.

Uurimise käigus uriiniproove PCR tulemused olid positiivsed 16 patsiendil 17-st aktiivse TB ja negatiivsed kuseteede 4 patsienti mitteaktiivsete neeru- tuberkuloos ja 39 patsienti Kuseelundkonna haiguse nontubercular.

Tuberkuloosi kahtluse korral on tõestatud PCR-analüüsi efektiivsus teadmata päritolu palavikuga patsientidel luuüdi aspireaatide uuringus. Tuberkuloosse lümfadeniidi diagnoosimisel uuriti lastel lastel 102-ne punktientset aspiraati ja 67-l olevat tuberkuloosset lümfadeniiti sisaldava biopsiaproovi. Saadud positiivsed tulemused: 71,6% reaalajaline PCR-i. Fluorestsentsmikroskoopia - 46,3%. Kultuuriuuringud - 41,8%. Kõigil tulemustel oli 50 lümfisõlmede biopsia uuringus "kass-scratch" haigusega patsientidel negatiivne tulemus. Seega demonstreeriti PCR analüüsi 100% spetsiifilisust. Samas töös lümfisõlmede punktsioonibiopsiast ilmnes M. Avium avastamise võimalus.

Nagu on teada, on naiste suguelundite viljatuse tuberkuloosi diagnoosimine üks raskemaid diagnoosi probleeme. Kui uuriti PCR biopsiat endomeetriumi endomeetriumi aspiraatidest vedeliku proovide Douglas ruumi 14 (56%) 25 uuritud patsiendi laparoskoopiliselt tuberkuloosi kahtlusega, positiivseid tulemusi saadi. Määrdunud mikroskoopia ja kultuuri abil saadi vastavalt 1 ja 2 tulemust. Need juhtumid olid ka PCR-positiivsed. Enamik PCR-positiivseid tulemusi oli seotud histoloogilises uuringus tuberkuloosi iseloomulike tunnustega juhtudega; väiksem arv - tuberkuloosi kahtlus vastavalt laparoskoopilistele andmetele. Tuberkuloosi laparoskoopiliste andmete puudumisel saadi ainult üks PCR-analüüsi positiivne tulemus.

Tuberkuloosi ekstrapulmonaalsete vormide diagnoosimisel on arstitel sageli küsimus vereproovide kontrollimisel patogeeni tuvastamise võimaluse kohta PCR-meetodil. Kirjanduses esitatud andmed näitavad, et vereproovidest pärineva Mycobacterium tuberculosis'e DNA avastamine on võimalik kaugeleulatuvate HIV-nakkuse vormidega. Mycobacterium tuberculosis'e DNA avastati ainult transplanteeritud neeruga patsientide ja immunosupressiooniga patsientide erinevate organite üldise tuberkuloosi korral.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Mükobakterite liikide identifitseerimine

PCR meetodil võib olla üsna tõhusad kiirelt tuvastada mükobakterite tuberkuloosi keeruline ja mõnede liikide mükobakterite nontubercular pärast nende esmase kasvufaasi. Sellisel juhul võib PCR kasutamine säästa 7-10 päeva, mis on vajalik positiivse tulemuse järgneva kultuurilise identifitseerimise jaoks. PCR-test on tehniliselt väga lihtne, kuna see ei nõua kliinilise materjali keerukat proovi ettevalmistamist, et saavutada kõrge tundlikkus. Uuringus 80 positiivset selles testis süsteemi (MB Vasto. Organon firma) kõigi positiivsete kultuuride PCR olid rangelt konkreetne ja hoitakse 1 päev. Selgitada teiste liikide mükobakterite valmistuses DNA patogeeni kultuuri hübridiseeritakse spetsiifilise DNA sondide märgistati acridine ja venitused tuvastasime ilmumine Kemoluminetsentsi via chemiluminometer või nitrotselluloosribad koos visuaalhindamise ristamisel. Kasutades sellist kit välja piiratud arvu liikidega: Mycobacterium tuberculosis kompleksi. M. Avium, M. Avium kompleks, M. Kansasii ja M. Gordonae.

A.Telenti et al. Arendanud ka suhteliselt lihtne ja odav meetod liikide tuvastamiseks kliiniliselt olulise mükobakterite liiki PCR ja järelravi kahe restriktaase (ensüümid, mille omadused on lõigatud DNA molekuli kindlates kohtades). DNA fragment amplifitseeritakse. Kodeerib kuumašokivalguga (65 kDa) ja seejärel töödeldakse saadud PCR DNA fragment 439 nukleotiidipaari eraldi kahe ensüümi - Bste II ja Hae III. Siis analüüsiti agaroosgeelelektroforeesiga saadakse kaks toodet, et määrata kindlaks nende suurus (aluspaaride arv) kasutades standardsete DNA fragmente (molekulaarne DNA-markerite) pikkusega 100-1000 aluspaari. Iga teatud liiki (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii M.fortuitum) tuvastab kaks või kolm DNA fragmendid erineva suuruse iga restriktaasi. Erinevate DNA suuruste kombinatsioon võimaldab neid liike omavahel eristada.

Töötatakse välja bioloogilise DNA mikrokiirte tehnoloogia. Mis aitab ühes uuringus tuvastada rohkem kui 100 mükobakteri liiki.

Liigi identifitseerimist saab läbi viia ka 16S rRNA muutliku piirkonna PCR amplifikatsiooniga, millele järgneb amplikoni järjestus võrreldes vastava primaarstruktuuriga, mis võimaldab identifitseerida enam kui 40 mükobakteri liiki.

PCR abil saab läbi viia ka liigi identifitseerimise Mycobacterium tuberculosis kompleksis, kaasa arvatud M. Bovis ja M. Bovis BCG diferentseerumine. Selleks analüüsitakse mõnede geenide olemasolu või puudumist RD1 genoomsetel aladel. RD9 ja RD10. RD1 puudub M. Bovis BCG-is, kuid esineb virulentsetel liikidel, sealhulgas M. Bovis.

Mycobacterium tuberculosis'i ravitundlikkuse määramine PCR abil

Eesmärgid molekulaargeneetilised meetodid ravimitundlikkuse või Mycobacterium tuberculosis vähendada mutatsioonide identifitseerimiseks konkreetsetes nukleotiidijärjestused tuntud geenidega. Põhimeetodid põhinevad kas otseselt prochityvanii (sekveneerimise) nende järjestuste pärast võimendamist või hübridiseerimine biotiiniga märgistatud DNA fragmente võimendatud ajal PCR DNA sondide. Mõlemad alternatiivid hõlmavad identifitseerimiseks nukleotiidide asendused järjestusi, mis DNA-proovide viia puudumisel või mittetäieliku hübridisatsiooni nitrotselluloosmembraanile lehe ensüümikonjugaadi (streptavidiiniga aluseline fosfataas) - meetod LIPA-Rif-TB.

Mõõtmismeetod fluorestsentsi lokaalselt fikseeriti microsections DNA sondid komplementaarne tuntud mutatsioonid amplifitseeritakse geenipiirkondade resistentsuse eest vastutava või ravimtundlikkus, nimetatakse mikrobiochipov meetodit. Peamine algoritm selle uuringu läbiviimiseks on järgmine. Pärast eraldamist DNA eraldamine kliinilisest proovist või kultuuri mükobakterite on vaja läbi viia PCR amplifikatsiooni asjakohaste fragmendid rpoB eest vastutav geen ravimtundlikkus kuni rifampitsiin või katG ja Inha valke kodeerivate geenide Mycobacterium vastutavad tundlikkus Isoniasiid. PCR Tulemusi hinnati agaroosgeelelektroforeesiga, milles vastuvõtmist kinnitada sobivate DNA fragmente soovitud pikkuses. Seejärel viiakse PCR-i teine voor DNA-le fluorestsentsmärgise sisestamiseks. PCR-i tulemused kinnitatakse uuesti geel-elektroforeesiga. Seejärel hübridisatsiooni viidi läbi (üleöö inkubatsiooni), järgneb pesemine saadud materjal biokiibil, milleks on suur hulk fikseeritud väikeses klaasplaat lühike DNA ahelate (sondid), mis on komplementaarsed nukleotiidijärjestusteks ravimit tundlikum Mycobacterium tuberculosis hetkel aspekti võimalike mutatsioone. Samuti ravimiresistentsuse eest vastutavad mutantsed järjestused. Asukoht DNA sondide plaadil - rangelt määratletud ning täheldatava fluorestsentsi hübridiseerimisel tulemuse kindlaks määramiseks kasutatakse spetsiaalset lugemisseadet on paigaldatud. Seoses sellega määratakse analüüsi tulemused kindlaks spetsiaalse arvutiprogrammi abil.

Viimastel aastatel on välja töötatud alternatiivsed meetodid mükobakterite tuberkuloosi ravimitundlikkuse määramiseks reaalajalise PCR-tehnoloogia põhjal, mis võimaldab neid uuringuid läbi viia suletud katseklaasis.

Joonisel fig. 13-13 näitab analüüsi tulemusena kliiniliselt isoleeritud Mycobacterium tuberculosis määramisel resistentsuse rifampitsiin PCR reaalajas: 218 - kontrollproov (tundlik rifampitsiin); 93 - Ser-Trp TCG-TGG mutatsiooni positiivne kontroll; 4482 - positiivne kontroll Ser-Leu TCG-TTG mutatsioonide jaoks; 162-322 - eksperimentaalsed proovid. 4-kanalil amplifitseerimise kineetilise kõvera arvutamise tulemus: kanal 1: 393 - Ser-Trp TCG-TGG mutatsiooni positiivne kontroll; kanal 2: 4482 - Ser-Leu TCG-TTG mutatsiooni positiivne kontroll; 162, 163, 172, 295 - eksperimentaalsed proovid; kanal 4: eksperimendis osalevate kõigi proovide amplifitseerimise kineetilised kõverad. Amplifitseerimisreaktsiooni positiivne kontroll. Järeldused: analüüsi tulemuste põhjal leiti järgmised rifampitsiini resistentsust määravad mutatsioonid: proovides 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. Sama põhimõtet kasutati resistentsuse määramiseks isoniasiidi jaoks geenide katG ja inhA puhul, mis määrab kõige sagedasemad mutatsioonid.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Mycobacterium tuberculosis'i tüvede identifitseerimine

Paremini uuritud identifitseerimisviis tüvede Mycobacterium tuberculosis on tehnikat nimega restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismi (RFLP RFLP. Või eestikeelse) ja mis põhineb fragmentirovanin (liik) Mycobacterium tuberculosis DNA ensüümi Pvull ja saadud fragmentide järgnevate hübridisatsiooni teatud spetsiifiliste DNA järjestustega selle korduv element IS6110. Intraspecifine variaablus tuleneb IS6110 korduvuste erinevast arvust ja nende asukohast DNA-s. Samuti erinevaid vahemaad teatud Hindepunktideks restriktaasiga (piirang alade) ja element IS6110. See tehnoloogia on väga keeruline ja aeganõudev. Peale töötlemist ekstraheeritud DNA kultuuri Mycobacterium tuberculosis, geelelektroforeesi teostatakse restriktsiooniensüümiga ja seejärel üle DNA fragmendid erineva pikkusega kohta nitrotselluloosmembraanile ristamine viidi läbi fragmendid IS6110-element ja tuvastasime abil ensüümreaktsioonide. Saadud spetsiifiline ribade struktuur iseloomustab Mycobacterium tuberculosis'e spetsiifilise tüve DNA-d. Arvutianalüüsi abil avastatakse tüvede identiteet või seosed. Vaatamata asjaolule, et RFLP-meetod on kõige diskrimineerivam, st identifitseerib Kõige enam erinevusi tüvedes analüüsiti, on ebaefektiivsed väikesel arvul (alla 5) IS6110-kordust täheldatud mõnedel tüved. Joonisel fig. 13-14 näitab tüvede RFLP-tüpiseerimise tulemusi.

Alternatiiviks võib olla spoligotüpiseerimine - speisser-DNA järjestuste polümorfismi analüüs - DR-piirkonna otseste korduste vaheline vahe. Tüvede spoligotüübi tegemisel viiakse PCR läbi DR-piirkonna piirväärtusega praimerid, mille järel moodustatakse erineva pikkusega fragmendid, mis hübridiseeruvad DNA muutuvaid vahepealseid piirkondi. Esitatakse DR-piirkonna speisseri järjestuste analüüs. Teadlaste sõnul on see lihtsam, tootlikum ja sobivam tüvede esmaseks skriinimiseks ja esialgse epidemioloogilise analüüsi jaoks, samuti uuringute otsene kliiniline materjal.

Ilmselt on tõhusam ja tehnoloogiliselt ligipääsetavam meetod VNTR (ingliskeelsete sõnade lühend) või meetod mycobacterium tuberculosis'e DNA täpsete tandemikordade arvu muutuva arvu kindlaksmääramiseks. See meetod põhineb ainult PCR-i kasutamisel ja ei vaja täiendavat manipuleerimist. Kuna erinevate tüvede ja erinevate lookuste tandemkorduste arv on erinev, siis määratakse erineva suurusega fragmendid ja analüüsitakse saadud PCR saaduste elektroforegrammis. Teadlaste sõnul on VNTR-i kasutamisel tüvede suhtes suurem diskrimineerimine kui RFLP meetodil.

Viimastel aastatel on suurt tähelepanu pööratud W-Pekingi perekonna Mycobacterium tuberculosis (mõnikord Pekingi tüve) tüvede levikule, mis on suures osas ravimiresistentsed.

Põhinõuded molekulaarbioloogiliste uuringute kvaliteedile

[72], [73], [74], [75],

PCR-i põhilised regulatiivdokumendid

Tellimused Vene Tervishoiuministeeriumi: №45 alates 02.07.2000 g .. Number 109 2003/03/21 g .. Number 64 alates 2000/02/21, Suuniste 1.3.1888-04 "Töökorraldus uuringud PCR materjali nakatunud patogeensete bioloogiliste patogeensuse rühmade III-IV ained "; 1.3.1794-03 "Töökorraldus PCR-materjali uurimisel, nakatunud I-II patogeensusega rühmade mikroorganismidega". 2003; 3.5.5.1034-01 "Saasteärastamise materjali infekteeritud bakterid I-IV patogeensuse rühmad tuleb PCR," 2001 liites 11 kuni unifitseeritud toote mikrobioloogilise uurimise meetodeid tuvastamisele, diagnostika ja tuberkuloosi ravis.

[76], [77], [78]

Töötajad

Execution molekulaarbioloogiliste uuringute võib hoida arstide kliinilise laboridiagnostikat arstid bakterioloogide, viroloogidest, arstid, bioloogid, kliinilise diagnostika laboratooriumi, samuti spetsialistide teisese meditsiiniline haridus, läbinud spetsialiseerumist ja täiendõpet ettenähtud viisil.

Laboratooriumi ruumide paigutus

Nõutavad järgmised laboratooriumid:

• Proovide käitlemispiirkond on labor, mis on kohandatud töötama III-IV patogeensusega rühmade nakkusohtlike ainetega, vastavalt metoodilistele juhenditele 13.1888-04.
• Reaktsioonisegude valmistamise tsoon PCR - laboratoorium, mis kaitseb sisemise labori saastumise eest - puhas tsoon.
• • Kui PCR-toodete analüüsimiseks kasutatakse elektroforeesi või hübridiseerimist. Laboratoorsed ruumis, mille paljunenud DNA fragmendid ammutatakse torud ja võimendamine võib vastavalt sattuda keskkonda vastavalt esitatavatele nõuetele PCR laborid (1.3.1794-03 suuniste Guidance 1.3.1888-04) peavad olema täielikult on isoleeritud eelmistes lõigetes märgitud ruumidest. Tuleb välja liikumise tsooni Tsoonelektroforeesis proovi käitlemise ja "puhas" ala tahes personal, seadmed, materjalide ja esemete, samuti üleandmise õhu kaudu ventilatsioonisüsteemi või tulemusena eelnõud. See tsoon ei ole vajalik PCR-toodete fluoromeetriliseks tuvastamiseks.
• Dokumentide ja tulemuste töötlemise ruum on varustatud arvutitega ja vajaliku kontoriseadmetega. See ruum võib sisaldada seadmeid, mis võimaldavad tuvastada PCR-tooteid ilma toru avamata. - fluorestseeruvad PCR-detektorid ja termotsüklid reaalajas PCR-i jaoks.

Röga primaarseks raviks mõeldud sanitaar- ja epidemioloogilised nõuded on sarnased tavalistele mikrobioloogilistele nõuetele mükobakterite tuberkuloosi korral.

[79], [80], [81], [82],

PCR-diagnostika laboriseadmete lõpuleviimine

Laboratoorium hõlmab järgmiste ruumide varustust.

• Proovide ettevalmistamise ruum sisaldab järgmisi seadmeid: II kaitseklassi "SP-1.2" laminaar: tahkefaasiline termostaat koos "Eppendorfi" tüüpi katseklaasidega; mikrotsentrifuug 13000 p / min; tsentrifuug (Vortex); külmutuskapp temperatuurivahemikus -20 ^kuni C 10 kuni ^umbes C; "Rroline" seeria muutuva mahuga pipeteerid; pump OM-1 püüduriga; statiivid pipettidele; statiivi tööjaam 200x0,5 ml; statiivi tööjaam 50x1,5 ml; Katseklaasid säilitatakse 80x1,5 ml;
• Reaktsioonisegu ettevalmistusruum: kaitsekamber PCR-kasti ("Laminar-C 110 cm); tsentrifuug - Vortex; Proliini seeria muutuva mahuga pipetetid; statiivid pipettidele; statiivi tööjaam 200x0,2 ml; Katseklaasid säilitatakse 80x1,5 ml; külmutuskapp temperatuurivahemikus -20 ^kuni C kuni + 10 ^kohta C;
• elektroforeesi ruum: horisontaalse elektroforeesi kaamera; toide; transilluminaator;
• DNA-võimendid või nukleiinhapete analüsaator (PCR reaalajas) arvuti ja tarkvara abil; saab asetada vabale ruumile. Kui kasutatakse reaalajas PCR-tehnoloogiat. Elektroforeesi ruum ei ole vajalik.

[83], [84], [85], [86]

Väline kvaliteedikontroll

Et olla kindel objektiivselt usaldusväärsete tulemuste saamisel, peaksid laborid osalema laboriuuringute kvaliteedi välishindamise süsteemis.

Kvaliteedikontrollisüsteemi osavõtjad saavad; 12 viaali külmkuivatatud bakteriraku suspensioonid, millest kaks sisaldavad E. Coli E. Coir, 3 viaalid Mycobacterium tuberculosis (Avirulentne tüvi) temperatuuril 10 ² / ml; 3 ampulli sarnase tüve rakkude kontsentratsiooniga 10 ⁴ / ml; 2 ampulli mitte-tuberkuloosse mükobakteri M. Avium-intracellulare ja M. Kansasii kontsentratsiooniga 10 ⁵ / ml.

Välise kvaliteedi hindamise jaotatud katsed on eelnevalt testitud kahes iseseisvas laboris, kellel on selle valdkonna ulatuslikud kogemused.

[87], [88]