Ensüümide ja tsütokiinide roll osteoartriidi patogeneesis

Viimastel aastatel on teadlaste suur tähelepanu pööratud osteoartroosi korral liigesekõhre rakuvälise kihi (ECM) lagundamise eest vastutavate proteaaside tuvastamisele. Tänapäevaste kontseptsioonide kohaselt mängivad maatriksi metalloproteinaasid (MMP-d) osteoartroosi patogeneesis olulist rolli. Osteoartroosiga patsientidel tuvastatakse kolme MMP-i (kollagenaaside, stromelüsiinide ja želatinaaside) suurenenud tase. Kollagenaas vastutab natiivse kollageeni lagundamise eest, stromelüsiin IV tüüpi kollageeni, proteoglükaanide ja laminiini lagundamise eest, želatinaas aga želatiini, IV ja Vh XI tüüpi kollageenide ning elastiini lagundamise eest. Lisaks eeldatakse teise ensüümi - agrekanaasi - olemasolu, millel on MMP-de omadused ja mis vastutab kõhre proteoglükaani agregaatide proteolüüsi eest.

Inimese liigesekõhredes on tuvastatud kolme tüüpi kollagenaase, mille tase on osteoartriidiga patsientidel oluliselt kõrgem: kollagenaas-1 (MMP-1), kollagenaas-2 (MMP-8) ja kollagenaas-3 (MMP-13). Kolme erinevat tüüpi kollagenaasi koosesinemine liigesekõhredes viitab sellele, et igaühel neist on oma spetsiifiline roll. Tõepoolest, kollagenaas-1 ja -2 lokaliseeruvad peamiselt liigesekõhre pindmises ja ülemises vahepealses tsoonis, samas kui kollagenaas-3 leidub alumises vahepealses tsoonis ja sügavas tsoonis. Lisaks näitasid immunohistokeemilise uuringu tulemused, et osteoartriidi progresseerumisel saavutab kollagenaas-3 tase platoo ja isegi langeb, samal ajal kui kollagenaas-1 tase järk-järgult suureneb. On tõendeid, et osteoartriidi korral osaleb kollagenaas-1 peamiselt liigesekõhre põletikulises protsessis, samas kui kollagenaas-3 osaleb kudede ümberkujunemises. OA-ga patsientide kõhredes ekspresseeritud kollagenaas-3 lagundab II tüüpi kollageeni intensiivsemalt kui kollagenaas-1.

Teise metalloproteinaaside rühma esindajatest on inimese stromelüsiinis samuti tuvastatud kolm: stromelüsiin-1 (MMP-3), stromelüsiin-2 (MMP-10) ja stromelüsiin-3 (MMP-11). Tänapäeval on teada, et osteoartroosi patoloogilises protsessis osaleb ainult stromelüsiin-1. Stromelüsiin-2 ei ole osteoartroosiga patsientide sünoviaalmembraanis tuvastatav, kuid seda leidub väga väikestes kogustes reumatoidartriidiga patsientide sünoviaalfibroblastides. Stromelüsiin-3 leidub ka reumatoidartriidiga patsientide sünoviaalmembraanis fibroblastide lähedal, eriti fibroositsoonides.

Inimese kõhrekoe želatinaaside rühmas on identifitseeritud ainult kaks: 92 kD želatinaas (želatinaas B ehk MMP-9) ja 72 kD želatinaas (želatinaas A ehk MMP-2); osteoartriidiga patsientidel määratakse 92 kD želatinaasi taseme tõus.

Hiljuti on tuvastatud veel üks MMP-de rühm, mis lokaliseeruvad rakumembraanide pinnal ja mida nimetatakse membraantüüpi MMP-deks (MMP-MT). Sellesse rühma kuuluvad neli ensüümi - MMP-MT1 - MMP-MT-4. MMP-MT ekspressiooni on leitud inimese liigesekõhredes. Kuigi MMP-MT-1-l on kollagenaasi omadused, on nii ensüümid MMP-MT-1 kui ka MMP-MT-2 võimelised aktiveerima želatinaas-72 kDa ja kollagenaas-3. Selle MMP-de rühma roll OA patogeneesis vajab selgitamist.

Proteinaasid sekreteeritakse tsümogeeni kujul, mida aktiveerivad teised proteinaasid või orgaanilised elavhõbedaühendid. MMP-de katalüütiline aktiivsus sõltub tsingi olemasolust ensüümi aktiivses tsoonis.

MMP-de bioloogilist aktiivsust kontrollivad spetsiifilised TIMP-id. Praeguseks on inimese liigesekudedes leitud kolme tüüpi TIMP-e: TIMP-1–TIMP-3. Neljas TIMP-i tüüp on identifitseeritud ja kloonitud, kuid seda pole inimese liigesekudedes veel avastatud. Need molekulid seonduvad spetsiifiliselt MMP-de aktiivse tsentriga, kuigi mõned neist on võimelised seonduma 72 kD proželatinaasi (TIMP-2, -3, -4) ja 92 kD proželatinaasi (TIMP-1 ja -3) aktiivse tsentriga. Tõendid näitavad, et OA korral on MMP-de ja TIMP-ide vahel liigesekõhredes tasakaalutus, mille tulemuseks on inhibiitorite suhteline defitsiit, mis on võimalik, et osaliselt tingitud aktiivsete MMP-de taseme tõusust koes. TIMP-1 ja -2 leidub liigesekõhredes ja neid sünteesivad kondrotsüüdid. Osteoartroosi korral tuvastatakse sünoviaalmembraanis ja sünoviaalvedelikus ainult I tüüpi TIMP-i. TIMP-3 leidub ainult rakuvälise maatriksi (ECM) piirkonnas. TIMP-4 jagab peaaegu 50% oma aminohappejärjestusest TIMP-2-ga ja 38% TIMP-1-ga. Teistes sihtrakkudes vastutab TIMP-4 72 kD progelatinaasi aktivatsiooni moduleerimise eest rakupinnal, mis näitab olulist rolli rakuvälise maatriksi (ECM) remodelleerimise koespetsiifilise regulaatorina.

Teine MMP-de bioloogilise aktiivsuse kontrollimise mehhanism on nende füsioloogiline aktiveerimine. Arvatakse, et seriini ja tsüsteiini proteaaside perekonna ensüümid, näiteks AP/plasmiin ja katepsiin B, on MMP-de füsioloogilised aktivaatorid. Osteoartriidiga patsientide liigesekõhredes on leitud suurenenud urokinaasi (uAP) ja plasmiini taset.

Vaatamata asjaolule, et liigesekudedes leidub mitut tüüpi katepsiine, peetakse katepsiin-B-d kõhre MMP-de kõige tõenäolisemaks aktivaatoriks. Inimese liigesekudedes on leitud seriini ja tsüsteiini proteaaside füsioloogilisi inhibiitoreid. Osteoartriidiga patsientidel on AP-1 inhibiitori (IAI-1) ja tsüsteiini proteaaside aktiivsus vähenenud. Sarnaselt MMP/TIMP-ga on just seriini ja tsüsteiini proteaaside ning nende inhibiitorite vaheline tasakaalustamatus see, mis seletab MMP-de suurenenud aktiivsust osteoartriidiga patsientide liigesekõhredes. Lisaks on MMP-d võimelised üksteist aktiveerima. Näiteks stromelüsiin-1 aktiveerib kollagenaas-1, kollagenaas-3 ja 92 kD želatinaasi; kollagenaas-3 aktiveerib 92 kD želatinaasi; MMP-MT aktiveerib kollagenaas-3 ja želatinaas-72 kDa potentseerib seda aktivatsiooni; MMP-MT aktiveerib samuti želatinaasi 72 kDa. Tsütokiinid võib jagada kolme rühma - destruktiivsed (põletikulised), regulatiivsed (sealhulgas põletikuvastased) ja anaboolsed (kasvufaktorid).

Tsütokiinide tüübid (van den Berg WB jt järgi)

Hävitav	Interleukiin-1 TNF-α Leukeemiat pärssiv faktor Interleukiin-17
Regulatiivne	Interleukiin-4 Interleukiin-10 Interleukiin-13 Ensüümi inhibiitorid
Anaboolsed	Munsuliinilaadsed kasvufaktorid TGF-b Luu morfogeneetilised valgud Kõhredest pärinevad morfogeneetilised valgud

Destruktiivsed tsütokiinid, eriti IL-1, indutseerivad proteaaside vabanemise suurenemist ja pärsivad kondrotsüütide proteoglükaanide ja kollageenide sünteesi. Regulatiivsed tsütokiinid, eriti IL-4 ja -10, pärsivad IL-1 tootmist, suurendavad IL-1 retseptori antagonisti (IL-1RA) tootmist ja vähendavad NO süntaasi taset kondrotsüütides. Seega toimib IL-4 IL-1-le vastu kolmes suunas: 1) vähendab tootmist, ennetades selle toimet, 2) suurendab peamise "püüdja" IL-1RA tootmist ja 3) vähendab peamise sekundaarse "sõnumitooja" NO tootmist. Lisaks vähendab IL-4 koe ensümaatilist lagunemist. In vivo saavutatakse optimaalne terapeutiline efekt IL-4 ja IL-10 kombinatsiooniga. Anaboolsed faktorid nagu TGF-β ja IGF-1 tegelikult IL-1 tootmist ega toimet ei sega, vaid omavad vastupidist aktiivsust, näiteks stimuleerivad proteoglükaanide ja kollageeni sünteesi, pärssivad proteaaside aktiivsust ning TGF-β pärsib ka ensüümide vabanemist ja stimuleerib nende inhibiitoreid.

Põletikulised tsütokiinid vastutavad MMP-de suurenenud sünteesi ja ekspressiooni eest liigeskudedes. Neid sünteesitakse sünoviaalmembraanis ja seejärel difundeeruvad liigesekõhre läbi sünoviaalvedeliku. Põletikulised tsütokiinid aktiveerivad kondrotsüüte, mis omakorda on samuti võimelised tootma põletikulisi tsütokiine. Osteoartroosist mõjutatud liigestes täidavad põletiku efektori rolli peamiselt sünoviaalmembraani rakud. Makrofaagide tüüpi sünovotsüüdid eritavad proteaase ja põletikumediaatoreid. Nende hulgas on osteoartroosi patogeneesis enim "kaasatud" IL-f, TNF-a, IL-6, leukeemia inhibiitorfaktor (LIF) ja IL-17.

Bioloogiliselt aktiivsed ained, mis stimuleerivad liigesekõhre lagunemist osteoartriidi korral

• Interleukiin-1
• Interleukiin-3
• Interleukiin-4
• TNF-α
• Kolooniaid stimuleerivad faktorid: makrofaagid (monotsüüdid) ja granulotsüüt-makrofaagid
• Aine P
• PGE ₂
• Plasminogeeni aktivaatorid (koe- ja urokinaasi tüüpi) ja plasmiin
• Metalloproteinaasid (kollagenaasid, ellastaasid, stromelüsiinid)
• Katepsiinid A ja B
• Trilsin
• Bakteriaalsed lipopolüsahhariidid
• Fosfolipaas Ag

Kirjanduse andmed näitavad, et IL-1 ja võimalik, et ka TNF-α on osteoartroosi korral liigesekoe hävimise peamised mediaatorid. Siiski pole veel teada, kas need toimivad teineteisest sõltumatult või on nende vahel funktsionaalne hierarhia. Osteoartroosi loommudelid on näidanud, et IL-1 blokaad ennetab tõhusalt liigesekõhre hävimist, samas kui TNF-α blokaad viib ainult põletiku vähenemiseni liigesekudedes. Mõlema tsütokiini suurenenud kontsentratsiooni leiti patsientide sünoviaalmembraanis, sünoviaalvedelikus ja kõhres. Kondrotsüütides on nad võimelised suurendama mitte ainult proteaaside (peamiselt MMP ja AP), vaid ka vähemoluliste kollageenide, näiteks I ja III tüübi, sünteesi ning vähendama II ja IX tüüpi kollageenide ja proteoglükaanide sünteesi. Need tsütokiinid stimuleerivad ka reaktiivseid hapnikuühendeid ja põletikumediaatoreid, näiteks PGE2 _. Selliste makromolekulaarsete muutuste tagajärjeks liigesekõhre osteoartriidi korral on reparatiivsete protsesside ebaefektiivsus, mis viib kõhre edasise lagunemiseni.

Ülalmainitud põletikku soodustavad tsütokiinid moduleerivad MMP supressiooni/aktiveerimise protsesse osteoartroosi korral. Näiteks võib TIMP-1 ja MMP tasemete tasakaalustamatus kõhres osteoartroosi korral olla vahendatud IL-1 poolt, kuna in vitro uuring näitas, et IL-1 beeta kontsentratsiooni suurenemine viib TIMP-1 kontsentratsiooni vähenemiseni ja MMP sünteesi suurenemiseni kondrotsüütides. AP sünteesi moduleerib samuti IL-1 beeta. Liigesekõhre kondrotsüütide in vitro stimuleerimine IL-1-ga põhjustab annusest sõltuva AP sünteesi suurenemise ja iAP-1 sünteesi järsu vähenemise. IL-1 võime vähendada iAP-1 sünteesi ja stimuleerida AP sünteesi on võimas mehhanism plasmiini genereerimiseks ja MMP aktiveerimiseks. Lisaks ei ole plasmiin mitte ainult ensüüm, mis aktiveerib teisi ensüüme, vaid osaleb ka kõhre lagunemise protsessis otsese proteolüüsi kaudu.

IL-ip sünteesitakse inaktiivse eelkäijana massiga 31 kD (pre-IL-ip) ja seejärel, pärast signaalpeptiidi lõhustumist, muundatakse see aktiivseks tsütokiiniks massiga 17,5 kD. Liigesekudedes, sealhulgas sünoviaalmembraanis, sünoviaalvedelikus ja liigesekõhres, leidub IL-ip aktiivsel kujul ning in vivo uuringud on näidanud sünoviaalmembraani võimet osteoartroosi korral seda tsütokiini eritada. Mõned seriinproteaasid on võimelised muutma pre-IL-ip bioaktiivseks vormiks. Imetajatel leiti selliseid omadusi ainult ühel proteaasil, mis kuulub tsüsteiin-aspartaadi-spetsiifiliste ensüümide perekonda ja mida nimetatakse IL-1β-konverteerivaks ensüümiks (ICF ehk kaspaas-1). See ensüüm on võimeline spetsiifiliselt muutma pre-IL-ip bioloogiliselt aktiivseks "küpseks" IL-ip-ks massiga 17,5 kD. ICF on 45 kD proensüüm (p45), mis lokaliseerub rakumembraanis. Pärast p45 proensüümi proteolüütilist lõhustumist moodustuvad kaks subühikut, mida tuntakse kui p10 ja p20, mida iseloomustab ensümaatiline aktiivsus.

TNF-α sünteesitakse ka membraaniga seotud eelkäijana massiga 26 kDa; proteolüütilise lõhustamise teel vabaneb see rakust aktiivse lahustuva vormina massiga 17 kDa. Proteolüütilist lõhustamist viib läbi TNF-α konverteeriv ensüüm (TNF-AC), mis kuulub adamalisiinide perekonda. AR Amin jt (1997) leidsid TNF-AC mRNA suurenenud ekspressiooni osteoartriidiga patsientide liigesekõhredes.

Kondrotsüütide ja sünovotsüütide bioloogiline aktiveerimine IL-1 ja TNF-α poolt toimub seondumise kaudu spetsiifiliste retseptoritega rakupinnal - IL-R ja TNF-R. Iga tsütokiini jaoks on identifitseeritud kahte tüüpi retseptoreid - IL-IP tüübid I ja II ning TNF-R tüübid I (p55) ja II (p75). IL-1PI ja p55 vastutavad signaaliülekande eest liigesekoe rakkudes. IL-1R tüübil I on veidi suurem afiinsus IL-1beta suhtes kui IL-1a suhtes; IL-1R tüübil II on seevastu suurem afiinsus IL-1a suhtes kui IL-ip suhtes. Jääb selgusetuks, kas IL-IP tüüp II saab vahendada IL-1 signaale või toimib see ainult IL-1 ja IL-1R tüübi I assotsiatsiooni konkureerivaks pärssimiseks. Osteoartroosiga patsientide kondroitiinid ja sünoviaalfibroblastid sisaldavad suures koguses IL-1PI-d ja p55-d, mis omakorda selgitab nende rakkude suurt tundlikkust vastavate tsütokiinide stimuleerimise suhtes. See protsess viib nii proteolüütiliste ensüümide sekretsiooni suurenemiseni kui ka liigesekõhre hävimiseni.

IL-6 osalemist osteoartriidi patoloogilises protsessis ei saa välistada. See eeldus põhineb järgmistel tähelepanekutel:

• IL-6 suurendab põletikuliste rakkude arvu sünoviaalmembraanis,
• IL-6 stimuleerib kondrotsüütide proliferatsiooni,
• IL-6 võimendab IL-1 toimet MMP sünteesi suurendamisel ja proteoglükaani sünteesi pärssimisel.

Siiski on IL-6 võimeline indutseerima TIMP-ide tootmist, kuid ei mõjuta MMP-de tootmist, seega arvatakse, et see tsütokiin osaleb liigesekõhre proteolüütilise lagunemise pärssimise protsessis, mida teostab tagasisidemehhanism.

Teine IL-6 perekonna liige on LIF, tsütokiin, mida toodavad osteoartroosiga patsientidelt saadud kondrotsüüdid vastusena põletikku soodustavate tsütokiinide IL-1p ja TNF-α stimulatsioonile. LIF stimuleerib kõhre proteoglükaani resorptsiooni, samuti MMP sünteesi ja NO tootmist. Selle tsütokiini rolli osteoartroosis ei ole täielikult selgitatud.

IL-17 on 20–30 kD homodimeer, millel on IL-1-sarnane toime, kuid palju vähem väljendunud. IL-17 stimuleerib mitmete põletikku soodustavate tsütokiinide, sealhulgas IL-1p, TNF-α, IL-6 ja MMP, sünteesi ja vabanemist sihtrakkudes, näiteks inimese makrofaagides. Lisaks stimuleerib IL-17 NO tootmist kondrotsüütides. Nagu LIF-i puhul, on ka IL-17 rolli OA patogeneesis vähe uuritud.

Anorgaaniline vaba radikaal NO mängib olulist rolli liigesekõhre lagundamisel OA korral. Osteoartriidiga patsientidelt eraldatud kondrotsüüdid toodavad nii spontaanselt kui ka pärast põletikuliste tsütokiinidega stimuleerimist suuremas koguses NO-d võrreldes normaalsete rakkudega. Osteoartriidiga patsientide sünoviaalvedelikus ja seerumis on leitud kõrge NO sisaldus - see on indutseeritud NO süntaasi (hNOC), NO tootmise eest vastutava ensüümi, suurenenud ekspressiooni ja sünteesi tulemus. Hiljuti klooniti kondrotsüütidele spetsiifilise hNOC DNA ja määrati ensüümi aminohappejärjestus. Aminohappejärjestus näitab 50% identsust ja 70% sarnasust endoteeli ja närvikoe suhtes spetsiifilise hNOC-ga.

NO pärsib liigesekõhre rakuvälise maatriksi (ECM) makromolekulide sünteesi ja stimuleerib MMP sünteesi. Lisaks kaasneb NO tootmise suurenemisega IL-IP antagonisti (IL-1RA) sünteesi vähenemine kondrotsüütides. Seega viib IL-1 taseme tõus ja IL-1RA langus NO hüperstimulatsioonini kondrotsüütides, mis omakorda viib kõhremaatriksi lagunemiseni. On teateid selektiivse hNOC inhibiitori terapeutilisest toimest in vivo eksperimentaalse osteoartroosi progresseerumisele.

Looduslikud tsütokiini inhibiitorid on võimelised otseselt takistama tsütokiinide seondumist rakumembraani retseptoritega, vähendades nende põletikku soodustavat aktiivsust. Looduslikud tsütokiini inhibiitorid võib oma toimemehhanismi põhjal jagada kolme klassi.

Esimene inhibiitorite klass hõlmab retseptori antagoniste, mis takistavad ligandi seondumist retseptoriga, konkureerides seondumiskoha pärast. Praeguseks on selline inhibiitor leitud ainult IL-1 jaoks - see on eespool mainitud IL-1/ILIP süsteemi konkureeriv inhibiitor IL-1 PA. IL-1 PA blokeerib paljusid osteoartriidi korral liigesekudedes täheldatavaid toimeid, sealhulgas prostaglandiinide sünteesi sünoviaalrakkude poolt, kollagenaasi tootmist kondrotsüütide poolt ja liigesekõhre luukoe lagunemist.

IL-1RA-d leidub erinevates vormides – üks lahustuv (rIL-1RA) ja kaks rakkudevahelist (μIL-lPAI ja μIL-1RAP). IL-1RA lahustuva vormi afiinsus on 5 korda suurem kui rakkudevahelistel vormidel. Vaatamata intensiivsele teaduslikule uurimistööle on viimaste funktsioon endiselt teadmata. In vitro katsed on näidanud, et IL-1beta aktiivsuse pärssimiseks on vaja IL-1RA kontsentratsiooni, mis on 10–100 korda kõrgem normaalsest, samas kui in vivo tingimused nõuavad IL-1RA kontsentratsiooni tuhandekordset suurenemist. See asjaolu võib osaliselt selgitada IL-1RA suhtelist defitsiiti ja IL-1 liigset esinemist osteoartroosiga patsientide sünooviumis.

Teine looduslike tsütokiini inhibiitorite klass on lahustuvad tsütokiiniretseptorid. Selliste inhibiitorite näideteks inimestel, mis on seotud osteoartriidi patogeneesiga, on rIL-1R ja pp55. Lahustuvad tsütokiiniretseptorid on normaalsete retseptorite lühenenud vormid; tsütokiinidega seondudes takistavad nad nende seondumist sihtrakkude membraaniga seotud retseptoritega, toimides konkureeriva antagonismi mehhanismi kaudu.

Lahustuvate retseptorite peamine eelkäija on membraaniga seotud IL-1RP. rIL-IP afiinsus IL-1 ja IL-1RA suhtes on erinev. Seega on rIL-1RN-il suurem afiinsus IL-1β suhtes kui IL-1RA suhtes ja rIL-1PI-l on suurem afiinsus IL-1RA suhtes kui IL-ip suhtes.

TNF-il on ka kahte tüüpi lahustuvaid retseptoreid - pp55 ja pp75, mis sarnaselt lahustuvatele IL-1 retseptoritele moodustuvad "eraldumise" teel. In vivo leidub mõlemat retseptorit kahjustatud liigeste kudedes. Lahustuvate TNF-retseptorite rolli osteoartroosi patogeneesis vaieldakse. Eeldatakse, et madalates kontsentratsioonides stabiliseerivad nad TNF-i kolmemõõtmelist struktuuri ja suurendavad bioaktiivse tsütokiini poolväärtusaega, samas kui pp55 ja pp75 kõrged kontsentratsioonid võivad TNF-i aktiivsust vähendada konkureeriva antagonismi kaudu. Tõenäoliselt võib pp75 toimida TNF-i kandjana, hõlbustades selle seondumist membraaniga seotud retseptoriga.

Kolmandat looduslike tsütokiinide inhibiitorite klassi esindab põletikuvastaste tsütokiinide rühm, kuhu kuuluvad TGF-beeta, IL-4, IL-10 ja IL-13. Põletikuvastased tsütokiinid vähendavad põletikuliste ja mõnede proteaaside tootmist ning stimuleerivad IL-1RA ja TIMP tootmist.