NBT-test: neutrofiilide oksüdatiivse purske hindamine

Spontaanne nitrosinise tetrasooliumi test on tsütokeemiline meetod neutrofiilide oksüdatiivse metabolismi hindamiseks ilma välise stimulatsioonita in vitro. Selle põhimõte seisneb selles, et superoksiidi aniooni moodustumisel redutseerub lahustuv kollane värvaine lahustumatuks tumedaks formazaaniks, mida saab rakus mikroskoobi all visualiseerida. Põhimõtteliselt hindab test fagotsüütide võimet algatada mikrobitsiidse vastuse hapnikust sõltuv etapp.

Bioloogiliselt on see test seotud neutrofiilide nikotiinamiidadeniini dinukleotiidfosfaatoksüdaasi kompleksi funktsiooniga. Kui kompleks toimib normaalselt, toodab rakk reaktiivseid hapnikuühendeid ja suudab redutseerida nitrosinise tetrasooliumi formasaaniks. Kui süsteem on kahjustatud, värvunud rakkude arv väheneb või kaob. Seetõttu on NBT-testil ajalooliselt olnud oluline roll kroonilise granulomatoosse haiguse diagnoosimisel. [1]

Oluline on neid kahte meetodit eristada. Spontaanne test hindab neutrofiilide algtaseme aktiivsust ilma standardse stimulaatori lisamiseta. Aktiveeritud ehk stimuleeritud test viiakse läbi pärast kokkupuudet ainega, mis käivitab oksüdatiivse purske, näiteks forboolmüristaatatsetaadi või muu stiimuliga. Kliiniliselt ei ole need sama asi: spontaanne test on tundlikum praeguse neutrofiilide aktiveerimise suhtes, samas kui stimuleeritud test on tundlikum süsteemi reservi suhtes. [2]

Ajalooliselt on laborid spontaanse testimise puhul toetunud tervete inimeste formazaani-positiivsete neutrofiilide madalatele ja üheselt mõistetavatele väärtustele. Praegune probleem on aga see, et NBT-testimismeetodid on pikka aega arenenud ilma täieliku standardiseerimiseta ning seetõttu puudub universaalne, võrdselt valideeritud tänapäevane referentsvahemik erinevate laborite jaoks. See on üks põhjusi, miks testi tõlgendamine on alati olnud keeruline. [3]

Praktilisest vaatenurgast ei näita spontaanne NBT-test "üldist immuunsust" ega "nakkuse olemasolu". See peegeldab ainult ühte kaasasündinud immuunvastuse spetsiifilist aspekti – neutrofiilide võimet genereerida reaktiivseid hapnikuühendeid antud testsüsteemi tingimustes. Seetõttu ei tohiks seda kunagi kasutada ainsa diagnostilise kriteeriumina. [4]

Tabel 1. Mida NST-test täpselt hindab?

Parameeter	Spontaanne NST-test	Aktiveeritud test NST-ga
Mida kontrollitakse?	Neutrofiilide basaalne oksüdatiivne aktiivsus	Oksüdatiivse purske reserv pärast stimulatsiooni
Bioloogiline tähendus	Raku taustvalmidus reaktiivsete hapnikuühendite moodustamiseks	Võime dramaatiliselt suurendada hingamispurset
Peamine ajalooline roll	Neutrofiilide aktivatsioonianalüüs, vana nakkus- ja immunoloogiline marker	Oksüdaassüsteemi defektide skriining, eriti kroonilise granulomatoosse haiguse korral
Lugemismeetod	Formazaani-positiivsete rakkude mikroskoopia	Mikroskoopia või poolkvantitatiivne hindamine pärast stimulatsiooni
Peamine tänapäevane probleem	Väga madal spetsiifilisus	Halvem kui dihüdrorodamiiniga läbi viidud voolutsütomeetria

Tabel võtab kokku spontaansete ja stimuleeritud NST-lähenemisviiside erinevused. [5]

Testi ajalooline tähtsus ja mis on tänapäeva praktikas muutunud

NBT-test oli 1960. ja 1970. aastatel neutrofiilide funktsiooni uurimise võtmemeetod. See võimaldas kliiniliselt tuvastada oksüdatiivse purske defekte kroonilise granulomatoosse haigusega patsientidel. See oli tol ajal oluline edasiminek, kuna test võimaldas tuvastada fagotsüütide bakteritsiidseid defekte juba enne tänapäevaste läbivoolutehnoloogiate tulekut. [6]

Aja jooksul selgus, et meetodi spontaanne versioon sõltus liiga palju välistest ja sisemistest teguritest. Vanemates ülevaadetes on otseselt öeldud, et nii spontaansed kui ka stimuleeritud NST-testid kannatasid arvukate protokollimuudatuste, range standardiseerimise puudumise ja piiratud reprodutseeritavuse all. See ei muutnud testi kasutuks, kuid piiras oluliselt selle usaldusväärsust laiaulatusliku diagnostilise vahendina. [7]

Kaasaegses immunoloogias ja kliinilises hematoloogias on NBT-test enamikus keskustes asendatud dihüdrorodamiini voolutsütomeetrilise testiga. GeneReviews märgib, et dihüdrorodamiini test on kroonilise granulomatoosse haiguse korral teistest testidest parem ning 2024. aasta ülevaates nimetatakse seda nikotiinamiidadeniini dinukleotiidfosfaatoksüdaasi funktsiooni hindamise praeguseks kuldstandardiks. [8]

Selle nihke põhjused on selged. Dihüdrorodamiini analüüs on kvantitatiivne, tundlikum, lihtsamini standardiseeritav ja hindab signaali igas üksikus rakus. See tuvastab paremini jääkoksüdaasi aktiivsust, tunneb paremini ära mosaiikpopulatsioone X-seotud vormi kandjatel ning sobib paremini jälgimiseks pärast siirdamist ja haiguse keerukamate geneetiliste variantide korral. [9]

NST-test pole siiski täielikult kadunud. 2024. aasta ülevaates rõhutatakse, et see võib endiselt olla kasulik piiratud ressurssidega olukordades, kus voolutsütomeetria pole saadaval, tulemusi on vaja kiiresti ja testi tegemiseks on olemas kohalik ekspertiis. See ei tee seda praeguse standardiga võrdväärseks, kuid selgitab, miks meetodit mõnes laboris endiselt kasutatakse. [10]

Tabel 2. Ajalooline NST-test ja kaasaegne dihüdrorodamiinitest

Iseloomulik	NST-test	Dihüdrorodamiini test
Tehnoloogia	Tsütokeemiline, mikroskoopiline	Voolutsütomeetria
Hindamise tüüp	Peamiselt kvalitatiivne või poolkvantitatiivne	Kvantitatiivne
Osalise defekti tundlikkus	Allpool	Kõrgem
X-seotud vormi kandjate hindamine	Piiratud	Palju parem
Jäänud oksüdaasi funktsiooni hindamine	Piiratud	Hea
Praegune olek	Ajalooline ja abimeetod	Eelistatud kaasaegne meetod

Tabel põhineb GeneReviewsil ja 2024. aasta kroonilise granulomatoosse haiguse diagnostika ülevaatel.[11]

Miks ei saa spontaanset NST-testi kasutada universaalse infektsioonimarkerina?

Vanemas kliinilises kirjanduses uuriti aktiivselt spontaanset NBT-testi kui võimalikku viisi bakteriaalse infektsiooni eristamiseks mittebakteriaalsetest seisunditest. Loogika oli selge: bakteriaalse infektsiooni poolt aktiveeritud neutrofiilid peaksid värvainet sagedamini taastama ja tootma rohkem formazaani-positiivseid rakke. Kogemus on aga näidanud, et see idee on liiga ebastabiilne. [12]

1975. aasta ülevaates, mida peetakse siiani meetodi oluliseks kokkuvõtteks, öeldi selgesõnaliselt, et NST-testi ei saa pidada absoluutseks meetodiks bakteriaalsete ja mittebakteriaalsete infektsioonide või mittenakkushaiguste eristamiseks, kuna valepositiivsed ja valenegatiivsed tulemused olid tavalised. Teisisõnu, isegi ajalooliselt kogunenud andmed ei kinnitanud spontaanse variandi oodatavat spetsiifilisust. [13]

Dermatoloogias tehtud uuringud olid samuti väga paljastavad: nii nakkuslike kui ka mittenakkuslike põletikuliste dermatoosidega patsientidel oli spontaanne NST sageli kõrgenenud, kuid see ei suutnud bakteriaalseid ja viiruslikke nahaprotsesse eristada. Lisaks suurenes test ka mitmete mittenakkuslike põletikuliste haiguste korral, mis näitab veelgi selle mittespetsiifilisust. [14]

Seda seletatakse bioloogiliselt. Spontaanne test reageerib mitte ainult mikroobile, vaid ka neutrofiilide üldisele aktivatsioonitasemele. Selline tõus on võimalik allergiliste, autoimmuunsete, põletikuliste ja muude seisundite korral, kus toimub kaasasündinud immuunsuse stimuleerimine ilma otsese bakteriaalse infektsioonita. Seetõttu on kõrge spontaanse NST tõlgendamine "bakterite märgina" liiga toores ja kliiniliselt ohtlik. [15]

Tänapäeva praktikas ei diagnoosita spontaanse NST-testi põhjal ei sepsist, bakteriaalset kopsupõletikku ega teadmata päritoluga palavikku. See puudub praegustest nakkushaiguste diagnostika rutiinsetest algoritmidest ja selle ajaloolist kasutamist selles rollis peetakse nüüd pigem laboratoorse immunoloogia arengu etapiks kui praeguseks standardiks. [16]

Tabel 3. Miks kõrge või madal spontaanne NST ei ole diagnoosiks

Tulemus	Mida see võiks tähendada?	Miks sellest ei piisa
Edutamine	Neutrofiilide aktiveerimine infektsiooni või põletiku ajal	Suurenemine on võimalik isegi ilma bakteriaalse infektsioonita.
Normaalne tulemus	Väljendatud baasjoone aktivatsiooni puudumine	Ei välista infektsiooni ega fagotsüütide defekti
Vähenda	Raske neutrofiilide düsfunktsioon, immuunpuudulikkus või laboratoorsed mõjud	Vaja on kinnitavaid funktsionaalseid teste
Järsult madal, kui kahtlustatakse kroonilist granulomatoosset haigust	Oksüdaasi süsteemi võimalik defekt	Vaja on kaasaegset kinnitavat testi
Kõrge allergiate või autoimmuunse põletiku esinemissagedus	Sünnipärase immuunsuse mittespetsiifiline aktiveerimine	Ei ütle midagi protsessi olemuse kohta

Tabel kajastab spontaanse NST-testi peamist piirangut: mittespetsiifilisust. [17]

Kus test on tõesti oluline: krooniline granulomatoosne haigus ja oksüdatiivse purske defektid

NBT-testi peamine klassikaline rakendusala on krooniline granulomatoosne haigus, mis on kaasasündinud fagotsüütide funktsiooni häire, mille korral neutrofiilid ei suuda normaalselt toota superoksiidi ja teisi reaktiivseid hapnikuühendeid. Neil patsientidel esinevad korduvad rasked bakteriaalsed ja seeninfektsioonid, granuloomid ja põletikulised tüsistused. [18]

GeneReviews rõhutab, et normaalse stimulatsiooni korral tervetel inimestel redutseerib üle 95% neutrofiilidest nitrosinise tetrasooliumi formasaaniks, samas kui kroonilise granulomatoosse haiguse korral selle reaktsiooniga rakud kas puuduvad või on nende arv järsult vähenenud. Just see nähtus on teinud NBT-testist haiguse äratuntava ajaloolise diagnostilise meetodi. [19]

Kuid siin on oluline väga täpne selgitus: kroonilise granulomatoosse haiguse puhul on kliiniliselt oluline stimuleeritud test, mitte puhtspontaanne test. Spontaanne NBT hindab algtaseme aktivatsiooni ja iseenesest ei ole optimaalne vahend oksüdatiivse purske kaasasündinud defekti tõestamiseks. Selleks otstarbeks on stimuleeritud NBT ja veelgi parem, dihüdrorodamiini test palju informatiivsemad. [20]

Hiljutised ülevaated rõhutavad konkreetselt, et NST-test on X-kromosoomiga seotud vormi kandjatel kroonilise granulomatoosse haiguse osaliste vormide, jääk-süsteemse aktiivsuse ja segarakkude populatsioonide tuvastamisel vähem efektiivne. Just nendes kliiniliselt keerulistes olukordades on dihüdrorodamiini testil selge eelis. [21]

On veel üks oluline nüanss. Raske müeloperoksidaasi puudulikkuse korral võib dihüdrorodamiini test anda kroonilise granulomatoosse haiguse vale mulje, samas kui NST jääb sellistel patsientidel normaalseks. Seetõttu säilitab vanem NST-test keerulistel juhtudel mõnikord täiendava diferentsiaalväärtuse, kuid see on pigem väga spetsiifiline ülesanne kui spontaanse variandi laialdane kasutamine. [22]

Tabel 4. Millal mõelda kroonilisele granulomatoossele haigusele

Kliiniline olukord	Miks see on murettekitav?
Korduvad sügavad abstsessid	Mikroobide fagotsüütilise tapmise defekti iseloomulik tunnus
Invasiivsed seeninfektsioonid, eriti Aspergillus	Kroonilise granulomatoosse haiguse tüüpilised tunnused
Kopsupõletik, lümfadeniit, osteomüeliit, maksa- ja nahaabstsessid	Klassikaline nakkusspekter
Seedetrakti või kuseteede granuloomid	Sagedased põletikulised ilmingud
Sarnaste infektsioonide perekonnaajalugu	Toetab pärilikku olemust
Kahtlane NST või dihüdrorodamiini test	Nõuab immunoloogilist ja geneetilist kinnitust

Tabel põhineb GeneReviewsi, ESIDi ja 2024. aasta ülevaatel.[23]

Kuidas patsienti tänapäeval õigesti uurida, kui vana NST-test on ebanormaalne

Kui spontaanne või stimuleeritud NBT-test on ebanormaalne, ei ole õige tänapäevane lähenemisviis seda lõputult korrata, vaid liikuda edasi täpsema funktsionaalse diagnoosi taseme juurde. Enamikus keskustes peetakse selleks tasemeks dihüdrorodamiini voolutsütomeetrilist testi. ARUP soovitab seda testi selgesõnaliselt kroonilise granulomatoosse haiguse sõeluuringuna. [24]

Pärast oksüdatiivse purske defekti kinnitamist on järgmine samm selle olemuse selgitamine. 2024. aasta ülevaade näitab, et pärast nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaatoksüdaasi puudumise või vähenenud aktiivsuse funktsionaalset kinnitamist saab uurida kompleksi üksikute valkude ekspressiooni ja teha molekulaardiagnostikat, et määrata kindlaks konkreetne geneetiline põhjus. [25]

Kui dihüdrorodamiini testi tulemus viitab kroonilisele granulomatoossele haigusele, kuid kliiniline pilt on ebatavaline, tuleks kaaluda diferentsiaaldiagnoose. Neist kõige olulisem on müeloperoksüdaasi puudulikkus, mis võib põhjustada atüüpilise dihüdrorodamiini testi tulemuse, samuti teatud raske glükoos-6-fosfaatdehüdrogenaasi puudulikkuse vormid ja haruldane omandatud neutrofiilide düsfunktsioon. [26]

Selle taseme testid tuleb teha elusate neutrofiilidega ja rangetes analüüsieelsetes tingimustes. ARUP rõhutab, et dihüdrorodamiini test nõuab värsket täisverd, transportimiseks toatemperatuuri ning mitte jahutamist ega külmutamist, kuna test sõltub elusrakkude puutumatust funktsioonist. [27]

Seega ei ole patoloogiline NST-test tänapäeval lõplik vastus, vaid pigem põhjus kiiresti liikuda edasi usaldusväärsema funktsionaalse ja geneetilise diagnostika poole. See on oluline erinevus tänapäevase artikli ja vana laboriloogika vahel, kus NST-testi ennast peeti mõnikord peaaegu lõplikuks diagnoosiks. [28]

Tabel 5. Kaasaegne algoritm pärast patoloogilist NST-testi

Lava	Mida teha
1	Hinnake kliinilist konteksti: infektsioonid, granulomatoossed protsessid, perekonna ajalugu
2	Tehke dihüdrorodamiini test voolutsütomeetria abil
3	Kui defekt kinnitust leiab, uurige nikotiinamiidadeniini dinukleotiidfosfaatoksüdaasi kompleksi valke ja geneetikat
4	Kõrvaldada matkivad tegurid, eriti müeloperoksidaasi puudulikkus
5	Suunake patsient kliinilise immunoloogi või hematoloogi juurde, kellel on kogemusi kaasasündinud fagotsüütide defektide ravis.

Tabel põhineb GeneReviewsi, ARUPi ja 2024. aasta ülevaatel.[29]

Spontaanse NST-testi piirangud ja miks see on tavapärasest praktikast välja langenud

NST-testi peamine metodoloogiline piirang on selle nõrk standardiseerimine. Isegi klassikaline 1975. aasta ülevaade rõhutas meetodi arvukaid modifikatsioone, mis viisid tulemuste olulise varieeruvuseni laborite vahel. Tänapäeva kliiniku jaoks tähendab see lihtsat asja: sama protsenti formazaani-positiivsetest rakkudest saab protokollist olenevalt tõlgendada erinevalt. [30]

Teine piirang on selle poolkvantitatiivne olemus. NBT-testi loetakse mikroskoopiliselt ja see tugineb sisuliselt värvunud rakkude arvu ja reaktsiooni intensiivsuse käsitsi hindamisele. Võrreldes voolutsütomeetriaga on see vähem täpne, vähem reprodutseeritav ja vähem sobiv nõrkade, osaliste ja mosaiikdefektide tuvastamiseks. [31]

Kolmas piirang on spontaanse variandi madal spetsiifilisus. See võib olla kõrgenenud mitmete põletikuliste ja mittenakkuslike seisundite korral ning langenud mitmesuguste sekundaarse immuunsupressiooni stsenaariumide korral. Seetõttu ei anna spontaanne NST iseseisvalt kasutades usaldusväärset vastust ei küsimusele "kas on tegemist bakteriaalse infektsiooniga" ega küsimusele "kas on tegemist primaarse immuunpuudulikkusega". [32]

Neljas piirang on haiguse kandjate ja osaliste vormide tuvastamise raskus. GeneReviews väidab selgesõnaliselt, et NST-d võidakse X-kromosoomiga seotud kroonilise granulomatoosse haiguse naissoost kandjatel ja hüpomorfsete variantidega patsientidel, kellel nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaatoksüdaasi jääkfunktsioon on osaliselt säilinud, ekslikult normaalseks pidada. [33]

Just need tegurid on viinud selleni, et spontaanset NBT-testi peetakse tänapäeval peamiselt ajalooliselt oluliseks, kuid piiratud vahendiks. Seda saab kasutada isoleeritud laborites ja piiratud ressurssidega keskkondades, kuid neutrofiilide oksüdatiivse purske hindamise tänapäevase rutiinse standardina on see andnud teed täpsematele meetoditele. [34]

Tabel 6. Spontaanse NST-testi peamised piirangud

Piirang	Miks see oluline on?
Halb standardiseerimine	Laborite tulemusi on raske võrrelda
Poolkvantitatiivne käsitsi hindamine	Madalam täpsus ja reprodutseeritavus
Madal spetsiifilisus	Suurenemine ja vähenemine toimub väga erinevates tingimustes.
Madal tundlikkus osaliste defektide suhtes	Haiguse kerged vormid võivad märkamata jääda
Mosaiikluse piiratud hindamine kandjate seas	Meetod on X-kromosoomiga seotud kandjate puhul halvem
Nihutamine täpsemate tehnoloogiate abil	Enamikus keskustes eelistatakse dihüdrorodamiini testi.

Tabel võtab kokku põhjused, miks testil on peamiselt ajalooline ja teisejärguline tähtsus. [35]

Kokkuvõte

Spontaanne nitrosinise tetrasooliumi test on oluline ajalooline meetod neutrofiilide oksüdatiivse metabolismi hindamiseks, mis aitas kujundada tänapäevast arusaama kroonilisest granulomatoossest haigusest ja muudest fagotsüütide talitlushäiretest. Selle kliiniline roll on tänapäeval aga oluliselt kitsam, kui vanemad laborijuhendid sageli viitavad. [36]

Kõige täpsem tänapäevane sõnastus on järgmine: spontaanne NBT-test ei ole usaldusväärne iseseisev test ei bakteriaalse infektsiooni diagnoosimiseks ega oksüdatiivse purske kaasasündinud defekti lõplikuks kinnitamiseks. Tänapäeva praktikas tuleks selle tulemusi käsitleda ainult abistavatena ning kroonilise granulomatoosse haiguse kahtluse korral tuleks eelistada voolutsütomeetriat dihüdrorodamiiniga ja sellele järgnevat molekulaarset diagnostikat. [37]

KKK

Mis on spontaanne NBT-test lihtsustatult?
See on vana laboritest, mis mõõdab, kas neutrofiilid on võimelised redutseerima nitrosinist tetrasooliumit tumedaks formazaaniks ilma välise stimulatsioonita. Põhimõtteliselt peegeldab see fagotsüütide hapnikusõltuva bakteritsiidse mehhanismi põhiaktiivsust.

Mille poolest erineb spontaanne test aktiveeritud testist?
Spontaanne variant hindab taustaktiivsust, aktiveeritud variant aga hindab reservi pärast raku kunstlikku stimuleerimist. Kaasasündinud oksüdatiivse purske defektide diagnoosimisel on stimuleeritud meetodid kliiniliselt olulisemad ja tänapäeva praktikas on dihüdrorodamiini test veelgi olulisem. [38]

Kas spontaanne NST-test saab diagnoosida bakteriaalset infektsiooni?
Ei. Varasemad kliinilised uuringud on näidanud, et test on liiga mittespetsiifiline ja annab palju valepositiivseid ja valenegatiivseid tulemusi. Seda ei saa kasutada bakteriaalse infektsiooni iseseisva kriteeriumina. [39]

Kas kõrgenenud spontaanne NST viitab alati infektsioonile?
Ei. Tõus on võimalik ka mittenakkuslike põletikuliste seisundite, allergiliste ja autoimmuunprotsesside ning üldise neutrofiilide aktivatsiooni korral. Seega ei määra ainuüksi kõrge tulemus põhjust. [40]

Kas madal spontaanne NST viitab alati kroonilisele granulomatoossele haigusele?
Ei. See võib esineda ka sekundaarse immuunpuudulikkuse, raske stressi, müelosupressiooni ja muude olukordade korral. Kroonilise granulomatoosse haiguse kinnitamiseks on vaja täpsemat ja kaasaegsemat algoritmi.

Millist testi peetakse praegu parimaks kroonilise granulomatoosse haiguse diagnoosimiseks?
Dihüdrorodamiini voolutsütomeetrilist testi peetakse kõige eelistatumaks. See on tundlikum, kvantitatiivsem ja paremini tuvastab haiguse osalisi vorme ja X-kromosoomiga seotud variandi kandjaid. [41]

Kas on olukordi, kus vana NST-test on endiselt kasulik?
Jah. Seda saab kasutada piiratud ressurssidega olukordades, kus voolutsütomeetria pole saadaval, ja täiendava meetodina teatud keerulistes diferentsiaalsituatsioonides. See ei ole aga enam massidiagnostika tänapäevane standard. [42]

Miks annab dihüdrorodamiini test müeloperoksidaasi puudulikkuse korral mõnikord valepositiivseid tulemusi?
Sest dihüdrorodamiini reaktsioon sõltub rakulisest peroksidaasisüsteemist. Raske müeloperoksidaasi puudulikkuse korral võib tulemus jäljendada kroonilist granulomatoosset haigust, kuigi NST jääb normaalseks. [43]

Kas geneetiline testimine on vajalik pärast patoloogilist funktsionaalset testi?
Jah, kui oksüdatiivse purske defekt on kinnitust leidnud. Pärast funktsionaalset testimist tehakse tavaliselt haiguse täpse põhjuse molekulaarne kinnitus ja pärilikkuse mustri selgitamine. [44]