Embrüonaalsed tüvirakud

Avastamine embrüonaalsete tüvirakkude - seal ei olnud juhuslik, ja ilmus valmis mulla teadusuuringute valdkonnas arengu bioloogia teadus. Mõiste "tüvirakud" viidi ravimina juba 1908. Aastal Aleksander Maksimovi konvendis hematoloogilise ühiskonna konverentsil Berliinis seoses hematopoeetiliste rakkudega. Ammu enne isolatsiooni ja ettevalmistamist stabiilse liinidele pluripotentsed embrüonaalseid tüvirakke alguses uurimistöö arengu protsessi kasutatakse varre terato- (embrüo-kartsinoomirakkudega kellega uuritud tundmatu mehhanismi embrüogeneesi, sealhulgas järjestuse ekspressiooni varase geenide ja valkude tooteid nende töö.

Kuid kas inimgenoomi totipotentsus on pöördumatult kaotatud evolutsiooni protsessis? Ei ja embrüogenees on tõestuseks. Kui see nii on, siis millal põhimõtteliselt realiseerub evolutsioonilise arengu teine tee? Tõenäoliselt, kui inimene lahkub Cosmosist, kus keskkonnatingimused on suhteliselt püsivad üsna pikka aega. Luude hõrenemise (luud demineralization sisse kaaluta oleku) väga aeglaselt alluvad remodeling ja taastamine võib pidada esimeseks sammuks inimese kohanemise protsessi liigina olemasolu ruumis. Kuid evolutsioonilise arengu teise teekonna maksmine on erinev - steriilsus on see, et maksta tagasi kõigile rakkudele totipotentsus ja absoluutne plastilisus. Nii mitmekordistada selles "evolutsioonilise kameeleoonide" maailmas pole mingit mioosi, otpočkovaniem. Kuid me elame kaua. Telomeraasi surematus on amoeba surematus. Mitmekelleeritud organismis on tüvirakud kvantitatiivse ja kvalitatiivse pikaealisuse substraat.

[1], [2], [3], [4]

Embrüonaalsete tüvirakkude allikad

Täna allikad embrüonaalseid tüvirakke laborikatseks Line hiire Teratokartsinoomi (129 / sv, F19, F8, Siini 40, CGR 86 Ri, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) ja inimese Teratokartsinoomi (NTERA-2, TERA-2 , H-9 kloon), samuti ESC Trauneone liinid. Kuid juuresolekul üksikasjalikult rakulise passi immuuninterferentsist fenotüüpi, Kromosoomanalüüsiga tulemused mRNA ekspressiooni profiilid eksponeeritud retseptorid ja valgu rakusiseseid ei kompenseeri olulisi puudusi teratokartsinomnyh read ESC - kiire kaotuse totipotency ja võimatus taotluse kliinilistes uuringutes ja segatüüpi diferentseerumise kultuuris on väga raske eristada rakkude heterogeense populatsiooni puhas spetsialiseeritud liin. Seetõttu tavaliselt allikana ESC read toodetud kliinilisel otstarbel, toimib sisemise rakumassi blastotsüsti, embrüote üksikute blastomeres 8-raku arengustaadiumis rakud Morula hilisemates etappides ja primaarne idurakust.

Tuleb märkida, et teratokartsinoomirakud, kuigi neil on pluripotentsuse omadus, iseloomustavad oluliselt väiksemat pluripotentset potentsiaali võrreldes ESC-ga. Nende integreerimine embrüonaalsete rakkudega põhjustab harva kimeeride moodustamist, kus lisaks teratokartsinoomirakkude genotüübiga gametes ei moodustu kunagi. Usutakse, et see on tingitud sagedased rakkude kultiveerimise ajal Teratokartsinoomi kromosoomanomaaliad: kaotus Y-kromosoomi trisoomia sort, deletsiooni või translokatsioonid.

Inimese ESC-liini eristamiseks on tehtud mitmeid kordi, kuid seda ülesannet ei õnnestunud lahendada, kuna normaalsetel inimese blastotsüütidel on objektidel raske ligipääsu. Lisaks on inimestel kromosomaalsete kõrvalekallete esinemissagedus suurem kui loomade embrüogenees. Enamik in vitro viljastamisel saadud varajastel inimembrüotel esineb kaootilise kromosoomi mosaiitsismi ja sageli esineb arvulisi ja strukturaalseid kõrvalekaldeid. Isegi hiljem, blastotsüsti staadiumis koosnevad ainult 20-25% inimembrüodest normaalse karüotüübiga rakkudest. ESC loomiseks oli selliseid embrüos peaaegu võimatu kasutada, sest tavaliselt sigoteid kasvatatakse kahe või nelja blastomere astmesse ja seejärel siirdatakse emakasse. Vaid suhteliselt hiljuti oli usaldusväärne tehnika, mis on välja töötatud viljastatud inimese ovulooside kasvatamiseks blastotsüsti staadiumis. Selle meetodi kasutuselevõtmine in vitro viljastamise praktikas suurendas mitte ainult eduka implantatsiooni tulemuse sagedust, vaid muutis tavapäraste blastotsüütide jaoks ligipääsetavamaks objektiks.

Järgmises pluripotentsed tüvirakud allikas on esmane soost rakud, mis erinevalt arenenumate eellasrakkude populatsioonide germenativnogo epiteeli ei ole pinnal beta integriinivastaseks, kuid väljendada kõrget aktiivsust shelochnoy fosfataas. Tuleb märkida, et eksperimendis uuriti alates eelmise sajandi 80. Aastatel esmastest sugurakkudest moodustatud tüvirakkude populatsiooni. Samal ajal töötati välja hiire embrüo gonaadi algloomade esmaste idurakkude isoleerimise meetod. Esimene ebaõnnestunud tulemused kultiveerimist ürgse sugurakkudes in vitro soovitab tühisus need pingutused, kui rakud, kuigi säilinud, kuid ei vohada ja suri esimesel päeval. Hiljem leiti, et esmane hiire sugurakkudes vohada in vitro juuresolekul ainult söödet lahustuvad ja membraaniga seotud konkreetse polüpeptiidi kasvufaktoreid. Arvukad uuringud on näidanud, et see on vajalik esinemisega kasvukeskkonda mitte ainult LIF, kuid membrannosvyazannyh ja terase lahustuvat faktorit (SIF) ellujäämise ja proliferatsiooni primordiaalsete sugurakkudes. Need peptiidid on tootnud keharakkude embrüote homosügootsed mutatsioon Steel, ja üks neist on ligandidna proto..oncogene cKIT.

Imetajate ja inimeste esmased sugurakud on ekstragonadaalse päritoluga ja on sugurakuliini klonaalse arengu allikas. Stardijoonele ürgse sugurakkudes, samuti kõikides kudedes embrüo ja ekstraembrüonaalsetest mesoderm annab epiblast (esmane ectoderm) alguses embrüote võttes mosaiik organisatsiooni struktuuri. Varajase embrüo erinevate osade mikrokirurgiline eemaldamine leidis lokaalses tsoonis primaarsete idurakkude toimeainete esmaste kloonide epiblast. Mis rodamindekstrana mida kasutati raku marker ta leidis, et lähteainete ürgse sugurakkudes asuvad proksimaalse piirkonnas epiblast lähedal ekstraembrüonaalsetest ectoderm. Esmane seksuaalrakuliin ilmneb 45-rakkloonist, mille eraldumine toimub gastrulatsiooni alguses. Seejärel toimub klooni segregatsioon ja gastrulatsiooni ajal sisenevad primaarsed soolarakud ekstraembryoonse mesodermi ja leiavad allantoi põhja põhjas, esmase bändi taga. Sealt primaarsed idurakud rändavad endocerviksi endodermi ventraalse otsa suunas ja seejärel liiguvad aktiivselt soolekinnisesse, liigitades ringlemise lõppedes genitaalrulli. Rändeprotsessis, samuti esimeste 2-3 päeva jooksul, mil lokaliseerimine gonaadi alguses esineb, laienevad esmased seksuaalrakud aktiivselt ja läbivad kaheksa replikatsioonitsüklit. Kui rände alguses on 12-päevase arengu hiirte embrüote reproduktiivsetes tsüstides ligikaudu 50 esmaset idurakku, on primaarsete sugurakkude arv üle 25 000.

Funktsionaalset sarnasust sotsiaalnõukogude ja ürgse sugurakkudes näitab täielikku integratsiooni viimane asendamiseks blastotsüsti sisemise rakumassi ja hilisema täieliku arengu embrüo, koe, mis koosneb ainult järeltulijate ürgse sugurakkudes. Vastavalt teistele omadustele hiire primaarse sugurakkudes PGCs olid samuti identsed, näidates võime diferentseeruda eri suundades, et moodustada embryoid organite in vitro, et in vivo kujul teratoome nahaaluse süsti immuunpuudulikesse hiired meenutav spontaanse teratoome munandis hiirte liin 129 / ter.

On kindlaks tehtud, et kui lisada LIF keskmise ja lahustuvat membrannosvyazannogo SIF isoleeritud esmase sugurakkudes 8 päeva hiire embrüote ellu jääda ja paljuneda kultuuris 4 päeva, kuid seejärel surra. Lisaks mil surma kultuuri täheldatud ürgse sugurakkudes kattub arengustaadiumis hiire embrüote (12,5-13,5 päeva), kui pungad esmane sugunäärmete naine sugurakkudes sisestage meioos, ja mees ürgse sugurakkudes on blokeeritud mitootilise jagunemine. Kui lisate keskkonda mitte ainult kasvufaktoreid LIF ja SIF, vaid ka FGF2 esmane sugurakkudes jätkata proliferirovat ja subkultuuride moodustatakse rakkude kolooniad võivad paljuneda isegi pärast keskkonnast eemaldatud kasvufaktoreid (SIF ja FGF). Sellised rakud võivad olla kultiveeritud pikale substraati embrüonaalsed fibroblastid lisamata lahustuva kasvufaktori LIF. Need on need stabiilsed rakuliinid, mis on tuletatud primaarsetest idurakudest, mida soovitati nimetada embrüo idurakkudeks. See termin ei saa pidada edukaks, kui kultiveeritud EG-rakke ei ole võimalik saada embrüonaalsete sugurakkudes, võimeline teostama järgmiste etappide oogenees või spermatogeneesi. See on tingitud asjaolust, et EG-rakuliine, kuigi saadud ürgse sugurakkudes, kuid kultuuri omandada omadusi embrüonaalsete pluripotentsed tüvirakud kaotavad võime toimepanemise germenativnye joon. Teisisõnu, peamine sugurakkudes kasvatamise ajal kaotavad oma omadused sugurakkude ümber lähteainete ja ESC-nagu pluripotentsed rakud.

Märgitakse, et kui EG hiirte immuunpuudulikkust manustatakse, ei teki teratomeeti. Eeldatakse, et inimese EG rakkude võime kaotamine teratoomide initsieerimiseks on tingitud asjaolust, et need jooned ei tekkinud otseselt kultiveeritud esmaste idurakkude poolt, vaid need saadi embrüoühiku isoleeritud rakkudest. Seepärast on võimalik, et nad on pluripotentsuse, kuid juba pandud rakkude järeltulijad.

Tuleb märkida, et EG rakkude ja esmaste idurakkude vahel on fundamentaalsed erinevused. Viimane ei võimalda saada kimäärseid hiire embrüode, mis näitab, et esmaste idurakkude võime puudub integreeruda sisemise raku massi või trophektodermi. Primaarsete sugurakkude populatsiooni omadused on enam sarnased hilisemate embrüote somaatiliste rakkude sidusatele joontele, mille sisseviimine blastotsüsti hulka ei too kaasa ka kimäärsete embrüote moodustumist.

Muundamise teel kultiveerides embryoid organite saadud EG kumuleerimata rakkudel lastakse selekteerimine selektiivsöötmete saada teise populatsiooni pluripotentsed rakud, mida nimetatakse "rakkudest saadud embryoid organid (embryoid keha pärinevad rakud - EBD-rakud). EBD-rakkude võime paljundada kultuuril pikka aega võimaldas luua püsivate rakkude stabiilsed rakuliinid. Saadud rakkude kloonid, mis ekspresseerivad spetsiifiliste rakkude laia spektriga mRNA-d ja valk-markereid. Selline lähenemine tulemusel tõestas, et esmane soost inimese pluripotentsed rakud ja diferentseeruvad in vitro erinevatesse rakutüüpide: neuroneid, gliiarakkude, vaskulaarne endoteeli Vereloomerakkude, lihaste ja endodermal rakkudes.

Embrüonaalsete tüvirakkude alternatiivsed allikad

Inimese ESC-liinide alternatiivne allikas võib olla hübriidrakud. Implantatsioon emakasse pseudotiinete lehmad geterogenomnoy saadud struktuur ühendamisel elektroporatsiooni fetusa inimese keharakkudes munaraku lehmad, mis oli eelnevalt eemaldatud esituuma, võimaldab saada sisemine rakkude mass implanteerumata embrüo kunstliku arengustaadiumid. Selleks esimeses etapis saadakse blastotsüsti muna lehma siirdatud inimese rakud tuuma.

Teises etapis ekstraheeritakse embrüoblastist blastotsüstist ja sellest lähtuvalt ESC vastavalt Thomsoni meetodile. On märkimisväärne, et selle meetodi abil ESC-liinide isoleerimise parimad tulemused saadi kasutades folliikulite rakke või primaarseid idurakke, mis säilivad inimese kehas säilunud seisundis. See on tingitud asjaolust, et lehma muna siirdatud inimese rakud tuumas neukorochennye peaks olema kõrge aktiivsus ja telomeeri telomeazy mis väldib enneaegset vananemist ESC kloonid saadud hübriidi muna (Repin, 2001). On teada, et kõige olulisemad intratsellulaarsed marker EGF valgud on Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, mis kuuluvad nn kromatiini summuti-valkudesse. Summutid pakuvad eriti kompaktset heterokromatiini pakkimist, mis takistab euchromatiini silmade moodustumist. Nende valkude vahendatud kromatiini pakend korreleerub ESC genoomi totipotentsusega. Praeguseks on leitud, et veiste ja inimeste küpsed ovulatsioonid on ainus spetsiifiliste rakkude tüüp, mis sisaldavad tsütoplasmas suuri kontsentratsioone summutite proteiinides. Selle põhjal töötati välja hübriidsete ESC-de tootmiseks meetod somaatiliste rakutuumade siirdamiseks lehmade mittenuclear ovules. Esialgsed in vitro uuringud on näidanud, et lehma munarakkude tsütoplasma taastab inimese somaatilise rakutuumuse genoomi totipotentsuse 12-24 tundi kultiveerimisel.

Eriti huvipakkuvad on andmed inimese embrüo eelimplantaadi arengu tunnuste kohta, mis näitavad, et totipotentsete rakkude hilisem asendamine pluripotentsete rakkude populatsiooniga on suurem kui hiirtel. Raku transformatsioonide uurimine näitas, et inimese blastsütiidi sisemise rakumassi rakud moodustavad lisaks ESK-dele ka trofoblastirakke, mis näitab nende üldist tõhusust.

On teada, et blastotsüsti staadiumis on kaks erinevalt rakupopulatsiooni. Üks neist on blastotsüti, trofektodermi välimine kiht, mis on saadud trofoblastirakkudest ja teistest embrüonaalsetest platsentaastmetest. Teine rakkude populatsioon on rühmitatud tihedasse massi, mis puutub kokku trophektodermi sisepinnaga. Sisemise raku massi rakupopulatsioon pärineb kõigist embrüo organite kudedest ja mikroobidest. Hilinenud blastotsüsti etapis moodustatakse sisemise raku massist ekstra-embrüo endoderm ja moodustub epiblast (peamine ektoderm). Samal ajal säilivad epiblastide rakud pluripotentsust, kuid võime eristada endogeenset endodermi rakke on piiratud.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Inimese embrüonaalsete tüvirakkude saamine

Alles hiljuti leiti, et trofoblastest ESC-d ei olnud võimalik saada. Siiski diploidne line trophectoderm eraldatud tüvirakud blastotsüsti söötmes, mis sisaldab asemel LIF ja FGF2 hepariin proliferates ja muundub tüvirakke. Kui te eemaldada keset FGF2 on trophectoderm rakkude lõpetada aretus, nad hakkavad endoreduplikatsioon kromosoomide ja rakuliste elementide trofektodermalnye järk-järgult ümber hiiglasliku trofoblastirakke. Tõenäoliselt LIF ei stimuleeri vohamist trophectoderm rakkudes tingitud asjaolust, et FGF2 vallandab mehhanismi transsignalizatsii nagu FGF2, seondudes tsütoplasmaatilise retseptori (FGFR2), aktiveerivad MAP kinaasi tsütoplasmas - ERK1 ja ERK2. Järelikult, kui need sisalduvad rakud blastotsüsti ühe signaaliraja (LIF - gpl30 - JAK-kinaasi - STAT3) sisemise rakumassi rakud muundatakse pluripotentsed hESCs, samas aktiveerides teise mehhanismi transmembraanse signalisatsiooni (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaaside ERK1 / ERK2) Blastotsüsti moodustuvad trophektodermi tüvirakud. Signaaliülekande tee valimine omakorda sõltub oct4 geeni aktiivsusest. See geen kuuluvate POU domeeni, mis asub aadressil kasvukohta t 17 autosoomidega ning väljendub ajal oogenees, purustus- perioodi samuti rakud sisemise rakumassi blastotsüsti ja varajasele sugurakkudes. Funktsionaalsele rollile OCT4 geen kodeerib transkriptsioonifaktori vajalikud esinemise pluripotentsed rakud, nende diferentseerumise ja dediferentseerimist.

Okt4 geeni ekspressioon ESC-s varieerub sõltuvalt selle transkriptsioonifaktori ja kofaktorite interaktsioonist. Okt-4 ekspressiooni suuna reguleerimine blastotsüstides näitas, et kui tema aktiivsus väheneb, moodustub pooled rakkudest trophektodermiga, kuid oct4 indutseeritud ekspressiooni suurenemisega esineb valdavalt ESC.

Eksperimendis, ESC ei saa tõlkida joont kasvatades totipotentsetes blastomeres dekoltee etapis ning etapil gastrulatsioon ja hiljem embrüonaalse arengu faasis. Hiire ESC tavaliselt suunama 3,5-4,5 päeva tiinust, mis vastab kuuenda (ühekihiline blastotsüsti) ja seitsmes etapid (kahekihilise blastotsüsti - varajase muna silinder) normaalse embrüogeneesi. Ilmselt sisaldavad hiirte embrüod ainult rakutüpide perioodil rakulisi populatsioone, mida saab ESC-ks muuta. Sellest tulenevalt on ESC liinide eraldamine võimalik ainult teatud embrüogeneesi etappides. Totipotentsetes, nii arenguvõimalused elujõulise embrüo embrüonaalsete membraanid ja platsenta on sügoot ja mis on tekkinud purustamise blastomeres. Germinaalsete rakkude kogu potentsiaali kadumine algab hilise morula staadiumis, kui edasine blastomeerne peenestamine sõltub nende asukohast. Varajased moratooriumid säilitavad totipotentsust, sest eksperimentaalsed manipulatsioonid nende asukoha muutustega, näiteks nende asukoha inversioon, ei takista täieliku embrüo kujunemist.

Leiti, et ESC vabanemise efektiivsust rida mõjutab blastotsüütide seisund nende selgitamise ajal. Kasutamise blastotsüüdid pärast seitsmepäevase simuleerimine Diapaus suguelundites hiirte ooforektomeeritud 3,5 tiinuspäeva ja töödeldi progesteroon, aitab edukam eraldamine liinidele embrüonaalseid tüvirakke. Eeldatakse, et sellistes tingimustes suureneb sisemise raku massi moodustavate blastomeeride arv. Samuti on võimalik, et rakutsükkel laieneb ja enamik blastomeere siseneb G0 faasi.

Lisaks loomist stabiilse pluripotentsed embrüonaalsete tüvirakkude read sõltub genotüübiga embrüote: üsna kergesti eristada sotsiaalnõukogud Hiire blastotsüüdid line 129, on oluliselt raskem saada neid kasutades hiired CS7BL / 6 ja praktiliselt võimatu eraldada joont hESCs blastotsüüdid CBA / Ca hiirtel. Ilmselt on varajases embrüos mõned geneetilised tunnused, mis mõjutavad pluripotentsiaalse ESC liini arengut. Samas, kui kasvatati epiblast soojustatud, samuti selektiivse valiku diferentseerides hESCs rakutüvele varase embrüote CBA / Ca hiiri ikkagi eraldatud.

ESP-liinide blastotsüstidest saadud tõestatud standardne meetod on antud varasemate embrüosidega katsetamise tehnika laboratooriumi käsiraamatutes. Eksperimentaalsed ESK-read võib saada ka 4.5-päevaste hiirte embrüote isoleeritud epiblasti (primaarse ektodermi) kultiveerimisel üsna keerulise mikrokirurgilise tehnika ja modifitseeritud kultiveerimistingimustega. Selle protseduuri keerukus on õigustatud, kuna ESC liinide moodustumise sagedus oli palju suurem kui töö blastotsüti siseruummassiga.

ESC-liinide isoleerimiseks viiakse iga kloon mikro-süvendisse, kasvab 40-60 rakkude agregaat, see hajutatakse uuesti. Mitu kordust selle protseduuri võimaldab saada surematuks ESK kooskõlas maksimaalse proliferatsioonikiirused normokariotipnyh rakud kinnitatud plastikust, mis läbi käikude 50-100 säilitavad totipotency ja kõrge telomeraasi aktiivsus. Selle protsessi toetamiseks read ESC suurim oht on reostuse või seerumi bakteriaalsed endotoksiinid - isegi jälgi endotoksiin kontsentratsioon söötmes põhjustatud mass surma ebaküpsete sugurakkudes. Hoolika kontrolli lineaarse kasvu ja õigeaegne hajutamist sotsiaalnõukogude kultuuris on võimelised sümmeetrilise lõhustumise, mille mõlemad tütar rakud jäävad pluripotentsed ja suudavad teha piiramatu arvu rakutsükleid, säilitades diploidne karüotüüpi ja kogu potentsi.

Valik puhta populatsioon inimese sotsiaalnõukogud võib läbi viia pärast transfektsiooni oma genoomi rekombinantse DNA molekulid, mis sisaldavad kodeeriva geeni sünteesi roheliselt fluorestseeruva valgu (GFP). GFP ekspressiooni suurenemist kasvava sotsiaalnõukoguga toetava keskkonna nende levik, arvestades alguses diferentseerumist geeniekspressiooni taset vähendada, mis võimaldab valitud valiksöötme puhast stabiilne, pluripotentsed rakuliine. Kasvatades GFP-ga ESC-de selektsiooni, suureneb kolooniate sagedus märkimisväärselt, kuna selektsioonipuude tingimustes elimineeritakse diferentseerunud rakkude võimas antiproliferatiivne toime.

Translation inimese embrüonaalseid tüvirakke line abil nende isoleerimise meetod implantatsioonieelsel embrüod (etapp 80-120 rakku), mis jäävad pärast in vitro viljastamist protseduuri. Selleks eraldatakse kunstlikult saadud liigsed embrüod Delbecco-Needle keskkonnas mehhaaniliselt. Pärast rakkude märgistamisega monokloonseid antikehi selektiivse fluorestsentsmärgi embryoblast isoleeritud rakke. Embrüoblaat dispergeeritakse üksikutesse rakkudesse, kasutades disaspaase-kollagenaasi segu. Eraldatud rakud kasvatati spetsiaalse keskkonnas (80% Delbekko keskmise + 20% veise loote seerumit kohalolekul 500 ug / ml IL-6, LIF ja SCF) kohta üksikkihis embrüonaalsed fibroblastid söötur 3 esimesed kanalid. Sellisel juhul toetab IL-6, LIF ja SCF kokkupuude tüvi- ja eellasrakkude säilimist ja proliferatsiooni. Selles keskkonnas peatamise hESCs kasvada kloonid osharennyh kinnitamata rakud dissotiseeritava õrna mitu pipetiga. Uued kloonid ilmuvad 5.-7. Päeval suspendeeritavas kultuuris. ESC maksimaalne kasvumäär saavutatakse 10-15 rakkude faasis kloonide korduva dissotsieerumisega. Seejärel viiakse iga kloon mikrokolonnini ja kasvatakse 40-50 rakkude koguseni. Protseduuri korratakse korduvalt läbikäikudes, suurendades kultuuri mahtu tihedusele 5-10 miljonit rakku 6-sentimeetrise tassi kohta. Kasutades sellist Thomson passaažida see eraldati 10 klooni surematud inimese sotsiaalnõukogud mis läbi käikude 100 säilitavad kõrge telomeraasi aktiivsus, võime intensiivne vohamist ja fenotüübitunnuste kokku minimaalselt potentsi, diferentseerumist üheski 350 spetsialiseeritud rakuliine, mis on tuletatud ekto-, meso- - ja endoderm. Diferentseerumist inimese ESC hakkas (at keskkonna muutus, liitmine ja kõrvaldamine seerumi LIF) koos rakkude kinnitumist substraadile, näidates arengut tsütoskeleti ja ekspressiooni adhesioonretseptorid. On oluline, et inimese ESK-de piiramatu leviku korral säiliks normaalne karüotüüp.

Inimese ESC-liinide isoleerimise teine meetod põhineb primaarsete sugurakkude kasutamisel. Eksperimentaalsed uuringud on näidanud, et Eu-rakuliine saab hiirte 12,5-päevaste embrüote genitaalplaasidest. Kuid sellistel juhtudel oli eellasrakuliinide moodustumise sagedus märkimisväärselt madalam kui varasemate embrüo katsetes. Samal ajal on 13,5-päevase rasedusajaga hiire embrüoride suguhormoonide esmased sugurakud üldjuhul võimelised muutuma ridadele.

Esimene stabiilne rida inimese pluripotentsed EG-rakke esmane gonocytes eraldatud suguelundite Primordia 5-9 nädala vanuste embrüote. Eraldatud rakke kultiveerida substraat inaktiveeritud hiire embrüonaalsete fibroblastide DMEM keskkonnas koos loote seerumit, millele lisati merkaptoetanooli forskoliin, samuti inimese rekombinantset kasvufaktoreid (FGF ja LIF). 7-12 päeva pärast ilmnes multikululaarsed kolooniad kultuuris vastavalt inimese EG rakkude morfoloogilistele tunnustele ja molekulaarmarkeritele. Pärast liitmise, need rakud moodustuvad embryoid organite edasise arengu spetsialiseerunud rakud, mis näivad iseloomulik derivaadid kõigi kolme Looteleht. 10-20 lõigu jooksul säilitasid EG-rakuliinid normaalset karüotüüpi ja ei kaotanud pluripotentsust.

Samuti on näidatud, et LIF, membraaniga seotud ja lahustuvate terasest tegurite ning TGF-b kombineeritud toime muudab primaarsete idurakkude arengu programmi. Selle asemel, et peatada mitootilised vahed ja hakata diferentseeruma oogeneesi või spermatogeneesi suunas, jätkuvad primaarsed sugurakud palavikku. Pärast mitut täiendavat mitootset tsüklit muutuvad nad epiblastide rakkudeks sarnaseks ning idurakkude prekursorite omaduste kaotamine muutub pluripotentseks embrüonaalsete EG-rakkudeks.

Nii 1998. Aastal eraldati esmase seksuaalrakkude immortaliseeritud rühmad esmakordselt inimese loote lahutamise koe seksuaalsest algust. Embrüogeneesis inimese esmane sugurakkudes ilmuvad rebukoti kolmandal nädalal arengu, ning 4-5th nädalat, need rakud migreeruvad seksuaalse tuberkul kus nad moodustavad elanikkonnast esmane dormantnye gonocytes. Inaktiivses seisundis jäävad primaarsed idurakud sünnituseni. Esmane idu rakuliine ammutatakse loote genitaalide Tuberkkeli 5-9 nädala vanused embrüod väljavõtmise ex tempore kangast, mida töödeldakse segu tüüpi kollagenaasi IV-V, hüaluronidaas ja DNase jaoks kvantitatiivset ja kvalitatiivset kasvu rakusaagise. Loomade suguelundite tuberkulli kudedel esinevad esmased sugurakud on ümbritsetud Sertoli stromaalsete (mesenhümaalsete) rakkudega. Funktsionaalne eesmärk Sertoli rakud on tootmise antiapoptootiliste faktorite (Fas-ligand), mitogeenide ja immuunsupressiivsed ained, mis kaitsevad seksuaalse tüvirakud immuunsüsteemi rünnaku organismis. Peale selle on sugurakk-tuubi strooma mikrokeskkond gamettide küpsemisele oluline roll. Isoleeritud esmased idurakud istutatakse kultuuris üle feeder-strooma kihi, mis koosneb esimese kolme lõigu loote fibroblastidest. Mitogeenide kõige tõhusam kombinatsioon on kompleks, mis koosneb LIF-st, FGF-st ja forskoliinist (stimulant cAMP moodustamiseks). Proliferatsiooni primordiaalsete sugurakkudes in vitro nõua selliste loote seerumit, kohalolekul primaarse reproduktsiooni gonocytes kultuuris kloonid kaasas teket globulaarset, mittekinnituvates rakud substraadile.

USA National Institutes of Health põhjal kokku olemasoleva teabe eraldamise meetodite kohta inimese ESC read blastotsüüdid tehti esialgne järeldus, et edukas jaotamine ESC on kõige tõenäolisem, kui kultiveeritud blastotsüüdid hästi moodustatud sisemine rakkude mass (Tüvirakud: teaduse arengut ning tulevikus uurimissuunda Nat.Instit, tervise USA). Sellest seisukohast parim allikas sotsiaalnõukogude luua read on inimese blastotsüsti 5. Päeval arengut, mille jaotamise sisemise rakumassi tuleks hoolikalt eemaldada trophectoderm. Eraldatud sisemise rakumassi kuhu selles staadiumis 30-35 rakud tuleb kasvatatud substraat hiire embrüonaalsete fibroblastide, mis on määrav tingimus moodustamise kolooniad kultuuris hESCs.

Embrüonaalsete tüvirakkude fenotüübiliste tunnuste analüüs

Eriti huvipakkuv on ESC fenotüüpsete omaduste vahepealne võrdlev analüüs. Selgus, et inimese ESC kolooniad - tihe klastrite lapik epiteeli-rakkudele, samas hiirte embryoid vasika on lahtised konglomeraat ümardatud rakkudes. Inimese ESC-s on tuumade ja plasma suhte indeks madalam kui hiire ESK-s. Ahvide embrüo tüvirakud moodustavad ebaühtlastest servadest rohkem lamedaid rakukolooniad. ESC esmaste kloonide esmased kloonid on kergesti nähtavad. Kõigi uuritud loomaliikide proliferatiivne ESC ei väljenda esimese ja teise klassi MHC molekule. Samal ajal, inimese sotsiaalnõukogud andma positiivse vastusena antikehade TERA 1-60 ja GCTM-2, mis näitab juuresolekul oma pinnal keratiin / kondroitiinsulfaat proteoglükaanidele iseloomulik embrüonaalsete (teratoome) -kartsinomnyh tüvirakke. Ekspressiooni hESCs igasuguseid loomi OCT4 geenis, kinnitab, et vaatamata fenotüübilised erinevused inimese ja hiire ESC ilmselt aktiveeriti samade geenide pidava pluripotentsuse (Peruu, 2001). Lisaks ESC read saadud embrüonaalsete rottidel, sigu, küülikuid, primaate ja veised, on sarnased morfoloogilised tunnused, samasugune komplekt molekulaarsete markerite identifitseerimise ja peaaegu identne molekulaarse mehhanismi rakendamise embrüogeneesis programm, mis võimaldab teil võtta värske pilk ksentotransplantatsiooni küsimus .

Erinevalt tavalisest embrüogeneesi in vivo, in vitro proliferatsiooni hESCs ei kaasne moodustumist suguvõimeliste kihid ja jätkub protsess plokist homeootiliste Nohgenov tausta, st ilma organogeneesi. Kuna segmenteerimine geenid ei funktsioneeri kultuuris hESCs võimatu paljundada selliseid perioode embrüogeneesi minekuks somiidist segmenteerimine tuumas, moodustamise rebukotis, allantoisis provisooriumis ja teiste elundite ja kudede. Kultiveeritud ESC-d külmutati spetsiifiliste rakkude 350 piirjoonte moodustamise alguses. Seega kloon tütarettevõtte eellasrakud ja tsentraalselt lokaliseeritud PGCs on ainus mudel embrüo arengu käigus, kus erinevate kudede piirkondades on moodustatud ühes etapis erinevad spetsiaalsed rakud pärinevad siiski, ühised lähteained. Kuigi miinimumtase retseptorite pinnal hESCs, nad säilitavad võimetes primitiivne morfogeneetilisest protsesside simuleerimine põhiosa varase embrüo struktuur: läga hESCs kultuuris ja agregaate moodustab sarnase struktuuri blastotsüsti või isegi hiljem embrüod (muna silindrid). Selliseid suspensioonimaterjale nimetati sobivaks lihtsateks ja kompleksseteks embrüodeks.

Kui segatakse diferentseeruvad erinevate rakkude embryoid keha samaaegselt väljendatud varase geenide ectoderm (oct3, fgf-5, sõlme), endodermiga (gata-4), mesodermi (brachyury), kardiogeenne mesodermi (PKH-2,5), neuraaltoru (msx3 ) ja hematopoeesia (elkf). Kasutades erinevaid kombinatsioone tsütokiinide ja kasvufaktorite sihtimiseks teket Looteleht rakkudes in vitro Mitmel juhul oli võimalik saada embryoid organid, mis olid eelistatavalt ekspresseeritud geenidele ectoderm või mesodermi, mis avab tee modelleerimine gastrulatsioon ja varajase organogeneesi faasis.

Kloonianalüüs kasvu hESCs on tõendeid asümmeetrilise rakkude jagunemist, kus ainult üks ESC kesklinnas kloon säilitab mittepiiravate reproduktsioonisuutlikkuse, samas kui teine tütar rakkude tekitab põlvkonna eellasrakud, diferentseerumise on juba tulemas. Seega kloon levimiskiirusest hetkel perifeeriat embryoid keha on kõrgem kui keskel. Piir rakud kasvavad kloon spontaanne diferentseerumise korrastamata migreeruda või surra apoptoosimehhanismid. Need sündmused määrata saatuse kloon kui proliferatsiooni kiirust ületab liikumiskiirus ja apoptootilist rakusurma, kloon suurused kasvavad pidevalt stabiliseerimise esineb koos võrdse apoptoosi ja moodustumise kiirus uute rakkude liikumiskiirus, regressiooni - vastupidine suhe neid protsesse. Eellasrakud jagada sümmeetriliselt, st nii tütarrakkude hiljem diferentseeruvad küps spetsialiseeritud rakuliine. Suhe ESC / eellasrakkude suur, kuid on alati mitmeid Juurdepääsulubade on vaid murdosa üks protsenti elanikkonnast eellasrakkude. Seega ainult põhjalik ja õigeaegne pipetiga desagregatsiooni kloonid suudavad arvu suurendada sotsiaalnõukogude kultuuris. ESC maksimaalse saagise saamiseks oli kõige efektiivsem 10-12 rakkude staadiumis kloonide eristamine. Rakkude diferentseerumise suund ja ulatus embrüosioonis sõltub nende asukohast. Välisilme embryoid keharakud ei väljenda geeni ja OCT4 läbivad diferentseerumise esmane endodermiga rakud, millest moodustatakse järgnevalt epithelioid rakkudes ja parietal ekstraembrüonaalsetest vistseraalne endoderm. Embrüo-kehasisesed rakud ekspresseerivad oct4 geeni ja säilitavad pluripotentsuse 48-tunnise kultuuri jaoks. Kuid siis morfoloogiliste saneerimise toimub epiteelkoe monokihtkultuuri algab ja geenide ekspressiooni, mis kontrollivad arengut primaarse ectoderm. Lisaks protsessi kõigi korrastamata rakudiferentseerumise algab välimus erinevad rakutüübid, mis on derivaadid kõigi kolme Looteleht. Protsessis spontaanse diferentseerumine embryoid keharakud esimese tekkida agregaatide endodermiga markerid vormis fragmendid (tsüstid) rebukotis. Veelgi enam, nendes struktuurides ilmnevad kasvavate kapillaaride angioblastid ja endoteelirakud. Lõppjärgus spontaanse diferentseerumist sisemise rakkude embryoid organismis tekivad mitmesugused lõplikult diferentseerunud rakke, sealhulgas neuronid, neurogliia elemente, kardiomüotsüüdide, makrofaagid ja erütrotsüüdid. Teatud ühtlustamise (arvestades ruumilise inversioon lehed moodustava embrüonaalse koe) kaudu embryoid organite in vitro võib avastada morfogeneetilisest protsesse ja analüüsida molekulaarsete mehhanismide embrüonaalsete rakudiferentseerumise algtähtajaks ning lisaks tuvastada rolli spetsiifilisi geene läbiviimisel neid protsesse.

Seega on klooni sees rakud, milles avastatakse erinevad geneetilise arengu programmid - ESC-d, varajased eellasrakud ja diferentseeruvad eellasrakkude populatsioonid. ESC-i kasvatamine droopimise või massikultuuri abil ilma feederkihita ja ilma LIF-i lisamiseta keskkonda paratamatult viib embrüoidsete kehade moodustumiseni. Embrüo-kehade välimise ja sisemise kihi rakkude morfoloogia on erinev. Väline kiht koosneb suurtest protsessirakkudest. Nende pind, mis on ümbritsetud keskkonnaga, on kaetud arvukate mikrovillidega. Välimine rakkude kiht eraldatakse Reicherti membraanile sarnasest sisemisest basaalmembraanist, samal ajal kui embrüo kehade sisemise kihi rakud on silindriline epiteel. Morfoloogiliselt on sisemine kiht, kuigi sisaldab paljusid jagavaid rakke, enam meenutab diferentseerimata ESC kolooniaid.

Inimese embrüonaalsete tüvirakkude omadused

Kuna parenhüümi-Mesenhümaalsed suhtlemise taustal signaali blokeerimine geenide homeosis põhjustab korrastamata kasvu PGCs kultuuris, sest see sakk on katki ja moodustamise infrastruktuuri provisooriumis elundeid. Organiseerimata kasvu ja korratu spontaanne diferentseerumist hESCs kultuuris puudumise tõttu Mesenhümaalsed märgistamise strooma raamistik tulevaste organite: in vitro on võimalik moodustamine miljoneid hepatotsüütides, kuid te ei saa ühegi segmendiga maksa, sealhulgas selliste struktuursete ja funktsionaalsete elementide, nagu nina, ruumi Disse ja Kupffer rakke.

Usutakse, et pluripotentsuse nõuandekogude realiseeritud eranditult embrüogeneesis moodustamaks kudede ja organite embrüo, samas nabanööri ja platsenta tuletatakse trofoblastiga. Suletud kestast trofektodermalnuyu ESK järjekindlalt genereerida rakukloonidest provisooriumis realiseerimisel arendusprogramm kombinatoonneetodiga mRNA lahtiselt Nohteyaov topograafiliste maatriksi, mis ette määrata ruumilist paigutust, kuju, mõõtmed, number ajutiste ja lõplike elundi rakkudele ja parenhüümi koost struktuurne ja funktsionaalne üksus. Samal ajal ESC on ainus rakutüüp, kus molekulaarne mehhanism realiseerimiseks nende potentsiaali täielikult lahutatav geneetilise programmi arendamise ja ESCOde ise ilma võimalusest koostoimed teiste rakkude tõttu ummistus nii retseptori arusaamu ja transsignalizatsii süsteemid. Kuid piisav aktiveerimise sotsiaalnõukogude tulemusi järk-järgult kasutuselevõtu embrüogeneesis programmi lõpp sündi on täielikult moodustunud ja valmis emakaväline organismi elutegevuses koosneb miljarditest rakkudest. Selle lühikese aja jooksul, kuid kujuteldamatult kohustus rakulise ruumi tee vältimatu esinemise vigu molekulaarsed mehhanismid, mis tagavad selle toimimise rakud, samuti programme, mis kontrollivad nende proliferatsiooni, diferentseerumist ja spetsialiseerumine. Seetõttu kaasaegses Farmakogeonoomika peetakse eraldi haiguse molekulaarse seadmetes ja haiguse raku programmeerimine. Ja tegevuse enamik uusi ravimeid, mille eesmärk on leevendada nimi diferentseerumise, leviku ja organogeneesi samuti taastamine elundite ja kudede. Täiskasvanutel kaudu organismi sotsiaalnõukogud osutub võimalikuks käitumise juhtimiseks tüvi / eellasrakkude siirdatud ajju, maksa, põrna, luuüdi ja teistesse organitesse inimese remondi kahjustatud saaja parenchymal elundite tingitud diferentseerumist ja spetsialiseerumine doonori mesenhümaalrakkudes konserveeritud maatriksis. Sisuliselt totipotency programmi käivitamine teise munarakku genoomi tasandil zygotes ja blastomeres, kuid need rakud ei ole veel võimalik kloonida ja passaažid vajalikke koguseid vajadustele experiental ja praktilises meditsiinis. Seetõttu ESC on unikaalne allikas geneetilise informatsiooni sisaldava kolmemõõtmeline lineaarne restriktsioonikaart embrüo ja koodid spetsialiseerunud rakuliine ajal gastrulatsioon.

Praktiliselt piiramatud võimalused Regeneratiivsete ESC tingitud asjaolust, et nende genoomis, erinevalt geneetilise aparaadi diferentseerunud keharakkudes, väidab pluripotentsuse. Üheks ilminguks seisuolek juurdunud sotsiaalnõukogud geneetiline informatsioon on niinimetatud minimaalne fenotüübi - pinnal ESC väljendamiseks piiratud arvu retseptoreid ning seetõttu kasutatakse väga vähe programme suhelda transsignalizatsii tuuma aparatuuri rakus tema mikrokeskkonda. Taustal talveunest eest vastutavate geenide piirang spetsialiseerunud rakuliine ja diferentseerumist, aktiveeritud ainult umbes 30 500 geeni, mille tooteid pakkuda kommunikatsioon rakkude ümbritseva mikrokeskkonda. Meetodil seerianumber geeniekspressiooni analüüsi näidanud, et üldist olemust Main funktsionaalse genoomi lahtrid reguleerimise energia- ja ainevahetuse keharakkudes ja sotsiaalnõukoguga viimase määratud äärmiselt madal mRNA kogus retseptoreid G-valgud, sekundaarseid signaalmolekule, transcriptases, kofaktorid ekspressiooni ja repressiooni , st regulatiivse signaali transmembraanset ülekandmist kogu raku. See on tingitud puudumise või väga madala ekspressiooni geenide transsignalizatsii. Diferentseerumise käigus indutseeritakse genoomi ESC 18 on lõpetatud sünkroonselt toimiva geene tausta aktiveerimist transsignalizatsii 61 geeni kontrolliv sünteesiks raku adhesioonretseptorid, rakuvälise maatriksi komponendid, liik transcriptases messendzhernyh elemendid ja signaali edastamise süsteem tuuma üksuse plasma rakumembraani retseptoritele. Samaaegselt blokeeritakse geenide ekspressiooni eest vastutavad valkude sünteesi summutite, samuti geeniekspressiooni koingibitorov pakkudes totipotency genoomi hESCs.

Kõigi kolme embrüonaalse infolehe rakkude kohta leiti geneetilisi markereid. Määramine ectodermal rakukiht vedada geenide ekspressiooni nodaalsed oct3 ja fgf-5, mesodermaalse rakud - geeni brachyury, Zeta-globiini endodermiga - at gata-4 geeniekspressiooni. Tavalises embrüogeneesi ajal gastrulatsioon täheldatud aktiivset migratsiooni ebaküpsed populatsioonide vars ja eellasrakud lokaalselt määrava piirkondades näoluude kolju, mõned osad aju, perifeerse närvisüsteemi, südame juhteteede süsteemi ja harknääre koe mis moodustuvad kloonide nihutatud rakkudes. Raku märgistamise alguses geenide Looteleht muudab lihtsamaks topograafilised analüüsi rände eellasrakkude embrüo arengus. On leitud eelkõige seda, et rakkude agregaadid embryocarcinoma P19 ekspressiooni esimene geen mesodermi brachyury algab reduktsiooni vältel geeniekspressiooni koeplasminogeeni aktivaator,-fetoproteiini, keratiin 8 ja keratiin 19, mis on markerid varase mesodermi rändlindude populatsioonidele. Järelikult teket kudedega mesodermaalse päritoluga algab alles pärast protsessi migratsiooni ja settimist punkti mesodermaalse eellasrakud.

Äärmiselt piiratult fenotüübilised tunnused ja puudumisel enamik plokke transsignalizatsii ESC siiski väljendada teatud retseptormolekule, mida saab kasutada nende tuvastamiseks. On märkimisväärne, et inimestel ja primaatidel esinenud ESC-de antigeen-markerid leiti olevat levinud. Enamasti kasutatakse märgistuse hESCs märgistatud antikehad antigeenide membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (kordumatu lipiidide antigeene esindavate kompleksi glükolipiidiga GL7 siaalhappe), samuti kõrgpolümeer- glükoproteiinid TRA-1-81, TRA-1-60. Lisaks hESCs väljendada konkreetsete embrüonaalse antigeeni SSEA-1 ja endogeensed aluseline fosfataas, samuti konkreetse transkriptsioonifaktori OCT4. Viimast on vaja säilitamiseks hESCs vohamist mehhanismid - spetsiifilise transkriptsioonifaktori OCT4 geeni aktiveerib ekspressiooni fibroblastide kasvufaktor 4 geeniekspressiooni ja stabiliseerib poks vastutab mittepiiravas DNA reduplikatsioon mitteküpsetes rakkudes. Kõige olulisem rakusisese markervalke on Oct3, OCT4, Tcf ja Groucho, mis on seotud valkude Kromatiini-summutite.

Peaaegu kohe pärast aastaid kestnud katseid hESCs kultiveerida in vitro olid ebaõnnestunud ja esmakordselt koostatud kultuuri eraldatud tüvirakud hiire blastotsüsti ja kultuuri esmane sugurakkudes, PGCs pluripotentsed etapp algas teadusuuringute potentsiaali, kui seda manustati varases staadiumis embrüo arengut. Selgus, et hetkel Morula ja blastotsüsti PGCs on võimelised moodustama kimäärne embrüo kus doonori PGCs järeltulijate tuvastasime kõikides somaatiliste kudede ja isegi sugurakke. Seega, Developmental Biology lehe ESC "skriptimiseks sillaks" Eksperimentaaluuringute in vivo ja in vitro, mis suurendas oluliselt võimalust õpib protsessid Lemmikud primaarse kudede ja organite nende diferentseerumise ja embrüonaalsete organogeneesi.

On hästi teada, et in vivo embrüogeneesi ajal ESK integreerunud rakumassi varase embrüo ja nende derivaadid leidub kõigis organites ja kudedes. PGCs koloniseerida idurakkudes kimäärne sugurakkudes, järeltulijad, mis moodustavad täieliku munaraku ja spermatosoidi. Embrüonaalsed tüvirakud on klonogeenses - ühekordne PGCs saab luua geneetiliselt identsed koloonia rakkude molekulaarseid markereid, mis sisaldavad OCT4 geeniekspressiooni ja aluseline fosfataas, kõrge telomeraasiaktiivsus, samuti spetsiifiliste geenide ekspressiooni embrüonaalsete antigeenidega.

Mehhanismide uurimiseks embrüogeneesi kasutades tehnikat hESCs kimäriseerimine Morula luues bioloogilise struktuuri, mis asub väliskihi tetraploidsest blastomeres saaja ja doonori PGCs manustatakse viiakse. Seega trofoblastiga moodustatud järeltulijate tetraploidsest blastomeerid saajale, mis võimaldab implantatsiooni ja platsenta, ja doonori PGCs keda sisemise rakumassi, mis on moodustatud elujõulise inimloote primaarse keha ja eellasrakkude sugurakke. Uuring ESC väärtus ei seisne mitte ainult selles, kui in vitro manipulatsioon oma genoomi säilitatakse pluripotentsuse, vaid ka asjaolu, et samas säästes võime osaleda moodustamise hESCs ürgse sugurakkudes kimäärne embrüo. On näidatud, et ainult üks järglased geneetiliselt muundatud PGCs koloniseerida kõiki esmaselt ja mikroobe moodustav kangas kimäärne embrüo saadud liitmise teel või kaaskultuuri Rakkude 8-cell embrüo. Kui hiirtele siirdatud Morula sotsiaalnõukogud transfekteeritud roheliselt fluorestseeruva valgu geeni, fluorestseeruva järeltulijad rakke leidub kõigis uuritud kudedes embrüo arengus (Shimada, 1999). Siirdamine ESC on Morula saab luua elujõuline hiired, keha, mis koosneb ainult järeltulijate kinkis ESC, mis avab võimalused erinevaid terapeutilise kloonimise võimalusi. Nüüd selline metoodiline lähenemine on edukalt rakendatud uurida probleeme arengu bioloogia, eelkõige võib ta analüüsib geneetilise mehhanisme inaktiveerimine X kromosoomi või epigeneetilistest ebastabiilsus hESCs. ESC siirdamist varajaseks embrüoksiks kasutatakse ka biotehnoloogias nii põllumajanduses kui ka geeniteraapia eksperimentides.

Geneetiliselt muundatud ESC-de transplantatsioone kasutatakse mutantsete geenide märklaudrakkude testimiseks. In vitro kasvatatud ESC-sid kasutatakse biotehnoloogias, et luua knockout hiiri. Selleks homoloogilise rekombinatsiooni teel tuleb eemaldada sotsiaalnõukogud uuringu geen (knockout) ja selektiivsöötmete eritavad rakud, millel puudub selline geen. Siis süstitakse väljavalitud ESC-d blastotsüstiga või agregeeritakse morulaarsete blastomeeridega. Nii saadud kimäärne alguses embrüote siirdamisel saaja naine ja vastsündinud hiirte valitakse üksikisikute sugurakkude nullizigotnymi selle geeni. Selle tehnoloogiaga on loodud mitmed nookoothiirte ridu, mida laialdaselt kasutatakse eksperimentaalses bioloogias ja eksperimentaalses meditsiinis. Nendel bioloogiliste mudelite uuritud väärtus teatud geenide embrüonaalses arengus, samuti nende rolli mehhanismid haiguste ja patoloogiliste seisundite profülaktikaks. Lisaks sellele kasutatakse genoteraapia uute meetodite eelkliinilistes katsetamisjärgus loomaliike, kellel on väljakukkumine. Näiteks, kasutades geeni transfektsiooni ESK normaalne alleel mutantgeeni tõhusaks haldamiseks parandatud mutatsioon, lööb vereloomesüsteemi. Võõra geenid viiakse sotsiaalnõukogude võimaldab kiiresti luua read homosügootne transgeensete katseloomadega. Siiski tuleb märkida, et tehnikat suunatud rekombinatsiooni geenideletsiooni usaldusväärselt välja töötatud veel ainult suhteliselt ESC hiirtel. Kasutades hiire sotsiaalnõukogud double knockout paigaldatud funktsionaalne roll area klastri geenide 7. Kromosoomi (koopia genoomse 19 minutit inimese kromosoomi) ja proksimaalse osa 11. Kromosoomi (kopeerida inimese 5d kromosoomi) - kustutatud Nende geenide ESK hiired lubasid hinnata nende analoogide funktsiooni inimestel.

Võimsuse funktsiooni uuringud inimese embrüonaalseid geenide transfektsiooni geeni, mis laboriloomade lasti hESCs eelkõige krüpto rolli selgitamiseks geenist minekuks moodustabki kardiogeenne mesoderm inim-6 geeni - embrüogeneesis silma. Kujutab esimese geenide ekspressiooni mitteküpsetes vohavate kaardi ESC Teratokartsinoomi ja blastotsüsti hiired kinnitas valdav repressioon ESK transsignalizatsii geene. Kombinatsioon mutant sotsiaalnõukogud 60-80 ja 20-30 rakkude normaalse implanteerumata hiire embrüote viib arengut kimäärne embrüo milles järjehoidjad keha koosneb doonori ja retsipiendi rakke, mis võimaldab meil rolli määramiseks teadmata geenide gastrulatsioon ja organogeneesi. Funktsionaalne kaarti geeni arendada hiire embrüote detailid suurendatult rolli geeni sf-1 tab neerupealistes ja suguelundite Primordia WT-1 geeni - neerudes tab MyoD pere geenid - vahekaardi skeletilihaste geeni perekonna gata-1-4 - kitsenduses küpsemise erütro- ja lümfopeese algused.

Režissöör välja emade ja isapoolne alleele geenide hESCs kasutades vektor rekombinaasi kätte selgitada funktsioone erinevate geenide varases embrüogeneesis ja tehnoloogia suunatud inimese teadmata geenide hiire ESC kaasa avastus uute mutant eest vastutavate geenide Raske pärilike haiguste. Kasutades knockout määratletud meetodi obligatoorsed tähendus mõnede geenide munakanad lootekoes: gata-4 - infarkti, gata-1 - erütroidsete rakkude hemopoieetiliste kude, MyoD - skeletilihastes brachyury - for mesodermi liik transcriptases hnf3 ja hnf4 - võtta maksa tüvirakke, lapp-2 - järjehoidjaid kloone T- ja B-lümfotsüüdid (Repin, 2001). Double kustutamise geenide hESCs on avanud juurdepääsu uuringu funktsionaalse rolli geenide sugurakkude kihid, segmenteerimine ja homeosis ja ESC siirdamise anda võimalus saada elujõulisi intraspetsiifiliste hübriid embrüote. Parendatud tehnikat siirdamisest doonori PGCs ühes 8-idurakust tõestatud, et kimäriseerimine rakutasandil paljude elundite saaja embrüo. Pange tähele, et raku kapsas leidub inimese koe retsipienthiirte elundite pärast manustamist inimese vereloome tüvirakkude arvu viiakse blastotsüsti. Selgus, et hiire embrüote moodustumise käigus vere organite ringleva pluripotentsed hESCs. On võimalik, et nende bioloogiline funktsioon on tulevase immuunsüsteemi embrüonaalses korralduses. ESC in vitro paljundada piisava mudelite inimese geneetiline haigus: kahekordne knockout mudelite düstrofiinigeenis hiirtel Duchenne'i lihasdüstroofia, seiskamine atm geen (juhtsignaali sünteesi kinaasi kromatiini) - ataksia-teleangektaziyu. Sel juhul surmaga pärilik haigus lastel defektsest DNA remont arendab taandareng Purkinje rakkude väikeajus, mis on kaasas involution harknääre tõttu surma proliferatsioonirakkudele. Clinic, patofüsioloogia patomorfologija ataksia-teleangek- tazii reprodutseerida kaudu sissetoomine ESC ebanormaalse geneetiline informatsioon hiirtelt kimäärid vastavad inimestel. Lisaks ataksia-teleangektazii lehe PGCs ja knockout hiirtel arenes katsemudeliks mõned pärilikud homosügootsed inimhaiguste seostatakse häiretega süsivesikute ja lipiidide metabolismi, katabolismi aminohapped, eemaldamist vase ja bilirubiin, mis suurendas oluliselt võimalust eksperimentaalse ravimi prekliinilised testida uusi ravimeetodeid asjakohaste haiguste õigused.

[12], [13], [14], [15]

Tüvirakkude tsütohübriidi kasutamine

Hübriid-rakud sulatamisel saadud somaatiliste rakkude nõuandekogude perspektiivses ning piisav mudeli uurimiseks tüviraku pluripotentsuse ja ümberplaneerimine diferentseerunud rakkude kromosoomides. Tsitogibridy saadakse ühinemisel ESC diferentseerunud rakkude täiskasvanud looma, annab võimaluse uurida seoseid genoomid erinevad "Aja": arendab unikaalne olukord, kus homoloogiliste kromosoomide saadud rakke erinevatel etappidel diferentseerumine ja vahelduva küpsuse, on samas tuumas, kus nad saavad lihtsalt transdeystvuyuschimi jagada reguleerivad signaalid. On raske ette näha, kuidas reageerib tsisregulyatornye epigeneetilistest süsteemi homoloogiliste kromosoomide olemasoleva ajal ün dividual arengu vastuseks mõju transdeystvuyuschih signaale embrüonaalsete related genoome. Lisaks hübriidi rakkudes esineb segregatsioon vanemliku kromosoomi, mis võimaldab uurida interaktsiooni genoomid erinevatesse kromosoomi tasemel, st potentsiaalselt osa tuvastamisel spetsiifilise kromosoomi säilitamisel pluripotentsuse või vastupidi, diferentseeritav toodang.

Kuna esimene eksperimentaalne mudel õppimine interaktsiooni genoomid erinevad "kujunemisloost" kasutatakse tsitogibridy saadud ühendades teratokartsinomnyh pluripotentsed ja diferentseeritud somaatiliste rakkude. Mõnel juhul säilitasid sellised hübriidrakud pluripotentsed omadused piisavalt kõrgel tasemel. Eelkõige in vivo somaatiliste hübriidi teratokartsinomno-rakud indutseeritud arengut tõsi teratoome sisaldas derivaadid kõigi kolme Looteleht, et in vitro suspensioonkultuuridesse moodustatud embryoid organitele. Isegi seda tüüpi liikidevaheliste tsitogibridov märkida juuresolekul loote antigeene kui somaatiliste partner ühinemisele Teratokartsinoomi rakke lümfotsüüdid või tümotsüütides. Tähelepanuväärne on see, et tsüto-hübriidid, mis on loodud teratokartsinoomirakkude liitmisega fibroblastidega, vastavad fenotüübi järgi fibroblastidele.

Kõige olulisem on see, et tõestatud, et in-teratokartsinomno somaatiliste hübriidi rakud ilmunud märke genoomi ümberplaneerimine diferentseerunud rakkude, mida iseloomustab taasaktiveerimistaotlus üksikute geenide või mitteaktiivsed X-kromosoomi somaatiliste partner. Seega uuringute tulemusi tüübist tsitogibridah teratokartsinomno-keharakkudes näitavad, et hübriid rakud sageli pikema pluripotentsuse ja ümberplaneerimine genoomi, on märke somaatiliste partner.

Katsetes saada embrüonaalseid intraspetsiifilisest hübriidi rakud kinnistamist splenotsüüte hiire ESC täiskasvanud looma uuritud selliseid omadusi tsitogibridov, segregatsiooni analüüsi vanemliku kromosoomid ja hinnatakse pluripotentsuse hübriidi genoomi. Et kindlustada liikidevahelisele hübriidile valmistada rakke fusion Teratokartsinoomi rakkude keharakkudes, mida üldiselt iseloomustab madal segregatsiooni kromosoomid, tetraploidsest või peaaegu tetraploidsest karüotüüp. Tsütohübridis täheldati sarnast kromosoomi kompositsiooni primaarsete sugurakkude liitmise kaudu lümfotsüütidega. Samal ajal intraspetsiifiliste hübriid rakud saadi ühinemise tulemusena hiire lümfotsüütide teratokartsinomnyh naarits, oli intensiivne segregatsiooni kromosoomide somaatiliste partner.

Kvalitatiivselt uue etapi uuring segregatsiooni vanemliku kromosoomide intraspetsiifiliste hübriidid tuli pärast arengut mikrosatelliit- analüüsimeetodit kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni, kusjuures iga hiire kromosoomi leitud paarsada markereid, mis võimaldavad usaldusväärselt vahet tahes kahe homoloogilise kromosoomi hübriidi rakkudes.

Ühendades ESK (lehe HM-1 rakud defitsiitse gipoksantinfosforiboziltransferazy aktiivsus, 2n = 40, XY, isoleeritud blastotsüüdid hiireliinilt 129 / 01a) hiirte splenotsüütide congenic line DD / c pole saanud ka komplekti hübriidi kloonid morfoloogiliselt oli sarnasus hESCs. Kõik kloonid eraldati valiksöötme, milles kasv on võimalik ainult aktiivse lahtri gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforectilise analüüs näitas juuresolekul kõik kloonid Alleelivariandi gipoksantinfosforiboziltransferazy iseloomuliku hiired DD / c. Kasutades tsütogeneetiline analüüs, leiti, et neli oli kolm hübriidi kloonid okolodiploidny seatud kromosoome. Üks paigale-tetraploidsest kloon sisaldas kahte populatsioonide hübriidi rakud, millest üks oli tetraploidsest ja teine, väiksem - diploidne.

Analüüs Mikrosatelliitmarkerite võimaldades diskrimineerida mis tahes kahe homoloogilise kromosoomi hiire 129 / 01a ja DD / c, hübriidsüsteemi kloonide okolodiploidnym set näitas, et kloonid esines kaks erinevat soodustingimustel elimination autosoomidega somaatiliste partner. Enamik autosomaalsed kloonid HESS2 ja HESS3 oli markerid liinile 129 / 01a, st pluripotentsed partner. Erandiks oli 1. Kromosoomi, mu: kloonide HESS2 ja HESS3 koos markerid HM-1 rakud, väikese arvu markerid somaatilised partner. Need tulemused peegeldavad puudulik segregatsiooni kromosoomide 1 ja somaatiliste partner ja on kooskõlas tsütogeneetiline andmete trisoomia kromosoome, mis toimub 30-40% HESS2 ja HESS3 raku kloonid. HESS4 kloon erines oluliselt kromosoomide koostis: paljud autosoomidega See kloon pärines genoomi ESK (kromosoomid 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 ja 17), kuid kromosoomid 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 ja 19 olid esindatud mõlema vanema homoloogidega. Kvantitatiivset suhet mikrosatelliitmarkerit need homoloogsed kromosoomid vastas ligikaudu 1: 1. See võimaldas autorid näitavad, et üks homoloog on saadud genoomi ESC ja teine - diferentseerunud rakke. Mõnes Alakloonide klooni HESS4 täheldatud ainult sümboolne kohalolek kromosoomide 18 ja 19 somaatiliste partner. Tulemused näitavad, et rakud kloonida HESS4 lisaks segregatsiooni kromosoomide somaatiliste partner oli sellega, et üks või mõlemad homoloogid eespool kromosoomi pluripotentsed genoomi, st oli kahepoolne segregatsiooni kromosoomid mõlemad vanemad - nähtus üsna ebatavaline, sest tsitogibridov iseloomulik segregatsiooni kromosoomide ainult üks vanematest.

Lisaks pärast 20. Läbipääsu, kes kõik kloonid hübriidi rakud sisaldavad ainult X-kromosoomis markerid somaatiliste partner, see tähendab, et kloonid asendati X-kromosoomis ESC X kromosoomis somaatilies partner. Kinnita sellest kriitilised andmed in situ hübridisatsiooni FITC-märgistatud sondiga spetsiifilised X-kromosoomis Hiir: positiivne signaal tuvastati ainult ühel kromosoomil. Tuleb märkida, et varasematel kasvuperioodidel (kuni 15. Sajandini) oli tsütogeneetiliste andmete kohaselt paljudes rakkudes kaks X-kromosoomi. Järelikult kasutamist selektiivsöötmete võimaldab manipuleerida kromosomaalse kompositsiooni hübriidrakk ja lavastatud valimiseks kandvaid kloone ühe kromosoomi somaatiliste partner sotsiaalnõukogud taustal genoomi.

Selle unikaalne omadus genoomi tsitogibridov on lokaliseerimine vanemliku genoomide ühe core muidugi tõstatab küsimuse säilitades pluripotentsed embrüo genoomi omadusi ESC-somaatiliste rakkude hübriidid tingimustes tihedas kontaktis genoomi diferentseerunud rakkude. Morfoloogiliselt sarnanes ESC ja somaatiliste rakkude tsütohübriid ESC vanematega. Kvalifikatsioon pluripotentsuse näitas, et kõik kloonid okolodiploidnym dial kromosoomid olid võimelised moodustama embryoid organite peatamise kultuuride, kus derivaadid kolme Looteleht kohal.

Enamik hübriidrakke sisaldas ECMA-7 antigeeni, mis oli varajase hiire embrüo jaoks iseloomulik marker ja millel oli ka leelisfosfataasi aktiivsus. Kõige veenvamad andmed hübriidrakkude kõrgete pluripotentsete omaduste kohta saadi eksperimentides, et saada kloonide HESS2 hübriidrakkude seeria kimääride seeria. Biokeemiliste markerite analüüs näitas, et doonori hübriidrakkude järeltulijad leiti enamikus kimäärikudes. Seepärast säilitavad ESC ja somaatiliste diferentseerunud rakkude fusiooniga saadud hübriidrakud kõrgel tasemel pluripotentsuse, sealhulgas võime moodustada kimäärid blastotsüütiõõnde sisestamisel.

Kloonid HESS2 ja HESS4 erinesid oluliselt vanema kromosoomide koostises, kuid neil olid sarnased pluripotentsed omadused. Võiks eeldada, et plyuripotentnostv "hübriidsüsteemi genoomi avaldub dominantse märk, kuid on võimalik, et mitte kõik kromosoomid embrüonaalsete genoomi hoidmine on seotud pluripotentsuse. Kui see eeldus on tõene, siis võib eeldada, et kõrvaldamine mõned kromosoomide pluripotentsed partner genoomist hübriid rakud ei kaasne muutusi oma pluripotentsed staatus. Sel juhul analüüsi segregatsiooni vanemliku kromosoomi embrüonaalsete hübriid rakkude lubaks tulla lähedale selgitada kromosoomid kontrolli eest vastutavate pluripotentsuse embrüonaalsete rakkude.

Serov O. Jt (2001) leidsid seas 50 järglaste saadud ristamisel kimäärid normaalse hiired, need, mis oleks genotüübiga hiired 129 / 01a ja kande- X-kromosoomis DD hiirtel. Autorid näevad selle põhjuseks hüperaktiivsete rakkude pluripotentsuse vähenemist somaatilise genoomi mõjul. Alternatiiviks võiks olla selgituseks negatiivset mõju trisomy mõnda tasakaalutus autosoomidega ja sugukromosoomide (XXY rakkudes täheldatud kuni 15. Läbipääsu) hübriidsüsteemi rakkude läbipääsu meioosi. On teada, et XXY rakud ei saa läbida meioosi ja moodustada sugurakke. Trisoomia võib samuti põhjustada hübriidrakkude proliferatiivse aktiivsuse vähenemist, mille tagajärjel võib kimääride arendamisel olla selektiivne eelis vastuvõtva embrüo rakkudele. Sellest järeldub, et hübriidrakkude pluripotentsiaalse potentsiaali adekvaatseks hindamiseks on vaja saada hübriidkloone tavalise diploidi kromosoomide komplektiga.

Eksperimentides Serova O. Jt (2001) esimese näidanud võimalust reprogrammeerimist X-kromosoomis genoomis keharakk hübriidrakk. See järeldus tuleneb autorid ekspressiooni analüüsimiseks kimäärid hprt geen (X-kromosoomi marker): juuresolekul alleelivariante hprt DD / c hiirte tuvastati kõigis analüüsitud kudedes kimäärne. Tuleb rõhutada, et pärast kasutuselevõttu hübriidse rakkude blastotsüsti õõnsuse tsitogibridy kuuluvad mitte-selektiivsed tingimused ja säilimist X-kromosoomis genoomis hübriidi rakud tähendab, et see on muutunud obligaatne komponent selle genoomi ning ei erista seda Y-kromosoomi pluripotentsed partner.

Kokkuvõtteks analüüsitulemuste interaktsiooni somaatiliste ja pluripotentsed embrüonaalsete genoomi hübriidi rakud järeldavad autorid, et teatud tsitogibridah pluripotentsuse ilmub dominantse tunnuse. Hübriidne genoom on võimeline reprogrammaerima diferentseerunud rakkude individuaalseid kromosoome, mis aga ei välista somaatilise genoomi vastupidise toime võimalust embrüonaalse genoomi paljunipotentsusele. Hübriidrakkude kasvatamisel toimub diferentseerumise esilekutsumine palju sagedamini kui ESC NM-1 esialgses vanemjoones. Sarnane efekt on täheldatud primaarsete kolooniate moodustamisel: paljud embrüonaalsete hübriidrakkude esmased kolooniad eristuvad moodustamise varases staadiumis kloonide suurte kadudega nende valimise ja korrutamise ajal.

Seega tsitogibridy ühinemisel ESC somaatiliste rakkude, vaatamata tihe kontakt genoomi diferentseerunud rakkude säilitada pluripotentsuse unikaalne omadus embrüonaalsete genoomi. Veelgi enam, sellistes hübriidrakkudes on võimalik diferentseeritud rakkudest pärit üksikute kromosoomide ümberprogrammeerida. Jääb selgusetuks, kuidas hästi säilinud plyu- ripotentnye omadusi embrüonaalsete genoomi hübriidi rakud, eriti nende võime osaleda teket germinaalses kimäärid. Selleks on vaja saada normaalse karüotüübiga embrüonaalseid hübriidrakke. Igal juhul pluripotentsed embrüonaalsed hübriid rakud saab tõeline mudel geneetilise identifitseerimise kromosoomide kaasatud hooldus pluripotentsuse või tema kontrolli kahepoolsete segregatsiooni vanemliku kromosoomid potentsiaalselt pakub sellist võimalust.

Vähem atraktiivne on nähtuse uurimine, mida O. Serov ja kaasautorid (2001) defineerivad kui "kromosoommälu". Hübriidsüsteemi genoomi homoloogsed kromosoomid on kaks alternatiivsed konfiguratsioonid: homoloogide somaatiliste partner kord läbinud diferentseerumise, arvestades homoloogid pluripotentsed partner, see protsess on alles algus. Seetõttu säilitades kõrge pluripotentsed omadused hübriidi rakud näitab, et "pluripotentsed" konfiguratsiooni homoloogid ESC suhteliselt stabiilne hübriidi genoome, vaatamata mõju transdeystvuyuschih tegurid väljuv somaatiliste partner. Eespool kirjeldatud funktsioone ümberplaneerimine diferentseeritud homoloogilise genoomi kromosoomide arengut kimäärid ei välista võimalust, et esimestel etappidel moodustumise in vitro ja kultiveerides tsitogibridov nad säilitavad oma staatuse omandanud diferentseerumise käigus in vivo. Viimaste andmete kohaselt ülekandmisel embrüonaalsete hübriidi rakkude mitte-selektiivsed keskkonnas, milles toimub intensiivne elimination kromosoomid ainult somaatiliste partner, st genoomi hübriidi rakud kergesti diskrimineeriv homoloogid pärast in vitro kultuuris 10-15 läbipääsud. Seega embrüonaalsete hübriidi rakud on paljulubav katsemudel Uuringu mitte ainult põhiomadusi embrüonaalsete genoom pluripotentsuse, vaid ka selle alternatiivide - embrüonaalsed diferentseerumist.

Embrüo tüvirakkude siirdamise terapeutiline efektiivsus

Enne analüüsimist terapeutilist efektiivsust ESC siirdamise ja nende derivaadid kokkuvõtlikult eespool materjalist. Olemas ESC poolest täielik rakendamine embrüogeneesis in vitro on ebapiisav, sest vead antud juhul puudumise tõttu mesenhümaalsed tüvirakud, mis tekivad organismis iseseisvalt ja sõltumatult hESCs. Geneetiline potentsi ESK vähem geneetilist potentsiaali zygotes seega otseselt kloonimiseks embrüote sotsiaalnõukogud ei kasutata. Unikaalne bioloogilise potentsiaali hESCs ainsa rakud, mis arengu programmide täielikult ka järjepideva rakendamise leiab taotluse uuring geeni funktsiooni uuringud. Kasutades ESK läbi dekodeerimiseks esimese signaali kombinatsioonid, mis aktiveerivad ekspressiooni varased ja hilised geenid, mis kodeerivad arengut kolme Looteleht. Säilitamine genoomi pluripotentsuse majandus- ja sotsiaalnõukogude in vitro teeb need ainulaadseks vahend remont taastamine, mida saab automaatselt kompenseerida rakkude kaotust kahjustatud elundeid ja kudesid. Ideaalses hüpoteetilise teostuses võib eeldada, et "... Siirdamisega doonori PGCs retsipientorganismis kantakse kompaktselt pakendatud programme, mis soodsates tingimustes on realiseeritud ehitamise uue tkani'7 võimelised" ... Tõhusalt integreerida adressaadi kerel morfoloogilised, ja funktsionaalne tase. "

Loomulikult, pärast ESC monodiferentseerimise meetodite väljatöötamist algas in vitro üksikute spetsialiseeritud kloonide in vitro uuritud in vivo uuring. Proliferatiivne ESO-kloon genereerib rändavate eellasrakkude populatsioonid, mis on tõeliselt võimelised aktiivseks integreerumiseks retsipiendi koe kahjustustsoonidesse, mida kasutatakse regeneratiiv-plastilises meditsiinis. On kindlaks tehtud, et Dopa-neuronite siirdamine substantia nigras vähendab eksperimentaalse hemiparkinsoniini kliinilisi ilminguid. Doonori närvisüsteemi tüvirakkude piirkondlikud siirdamine vähendab seljaaju ja aju traumast või kontusioonist põhjustatud motoorikahäirete taset. Tüvirakkude siirdamise esimesed positiivsed tulemused demüeliniseerivates haigustes. Tundub, et ESC-de regeneratiiv-plastilised potensiaadid pakuvad praktilises meditsiinis piiramatult võimalusi mobiilside siirdamiseks. Siiski muutuvad ESC-d vältimatult kasvajates ümbertöötlemisel ektoopilisteks tsoonideks. ESC subkutaanse süstimisega immunodefitsiidiga hiirtel moodustub teratoom. Kui siirdades kapsli alla läga ESK munandis süngeenilistes hiirtel ka moodustub teratoome koosneb erinevatest kudedest, rakkudest, mis on derivaate kõigis kolmes Looteleht. Sellistes teratoomides on vähendatud organogeneesi protsessid äärmiselt haruldased.

Mitmetes töödes antakse teavet ESCO varajaste derivaatide siirdamise positiivsete tulemuste kohta loomadel, kellel on eksperimentaalne patoloogia. Cell neurotransplantation lehe derivaadid PGCs on edasi arendatud eksperimendi ja esimese kliinilistes uuringutes korrektsioon funktsionaalsete häirete aju ja seljaaju trauma, raviks syringomyelia ja multiskleroos (Repin, 2001). Tekkega tehnoloogia neyronogeneza sotsiaalnõukogud in vitro kasutamise asemel embrüo ajukoe siirdamise tehnikad töötatud derivaadid neurosfääridest, kultuuridest saadud embrüonaalsete närvikude. Sellised siirdamise suspensioonid on palju homogeensemad ja sisaldavad neuronaalseid ja neuroglia prekursoreid.

Lisaks regulaarsel kasvukeskkonda retinoolhappega doosis 10 ug / ml 6 nädalat embrüonaalses read (teratoome) NTERA-2 inimese -kartsinomy moodustatud üle 80% postmitootilisteks neuroneid. Täielik homogeensus neuronite populatsiooni saavutatakse voolu sorteerimine märgistatud immunofenotüpiseerimise markerite küps neuronite, mis võib vabaneda jäänuseid teratokartsinomnyh ja ebaküpsed rakud. Pärast katseloomade siirdamist eksperimentaalsete loomade ajupiirkonda, on sellised neuronid mitte ainult ellu jäänud, vaid ka sisendatud piirkondlikesse närvivõrkudesse. Loomadel eksperimentaalsetes mudelites kohalike defektide KNS neurotransplantation vähendab kliinilisi ilminguid inimpatoloogiate nagu mõju koljutrauma, rabandus, demüelinisatsioonihaiguste, pärilik väikeaju arengu defekte, haiguste ladestumine lipiide ja polüsahhariide.

Kesknärvisüsteemi degeneratiivsete haiguste regeneratsiooniprotsesside optimeerimiseks on välja töötatud müeliini tootvate oligodendrotsüütide valmistamise tehnoloogiad ESK-st. Esimene etapp hõlmab traditsiooniliselt ESC-de levikut siirdamiseks vajalike rakkude arvu paljunemisega. Teises etapis viiakse läbi rakkude suunatud diferentseerumine müeliinit tootvate oligodendrotsüütide prekursorite populatsioonile, mida kontrollivad selektiivsed markerantigeenid.

Mõned väljavaated on avatud kasutamiseks derivaadid sotsiaalnõukogude arendada meetodeid korrigeerimist immuunpuudulikkuse põhjustatud geneetilistest defektidest küpsemise harknääre. Uuringutes geenidega (lapp 1) hiirte indutseeritud geeni defekt - rikkudes rekombinatsiooni mehhanismi V (D) J geenilookuste TCR, mis viib funktsiooni kadu T-lümfotsüüdid, transplantatsioon varase derivaadid PGCs tüümuse loomade taastab küpsemist normaalse populatsioonide immuunrakkude kloonid vastutab rakuline immuunsus. Kliinilised uuringud transplantatsiooni valmismärgised in vitro hESCs raviks fataalne pärilikku aneemiat lastel.

Vastuväited kiiret kasutuselevõttu tüvirakkude siirdamine kliinikus on õigustatud piiratud arvu stabiilne read inimese embrüonaalseid tüvirakke ja standardimise vajadus. Et suurendada puhtust standardiseeritud ESC jooned ja täiskasvanute tüvirakkude tehakse ettepanek kasutada valimise meetod read põhjal molekulaargeneetilises analüüs lühikese tandem DNA kordust. Samuti on vaja testida ESC-liine väikeste kromosoomide ümberkorralduste ja geneetiliste mutatsioonide esinemisega, nende rakulise kasvatamise tingimustes võib nende esinemise võimalus olla piisavalt suur. Lõputöö ulatub kohustuslik omaduste katsetamiseks kõigi PGCs ja piirkondlike pluripotentsed tüvirakud, kuna nende paljundamine in vitro võib tekitada uusi omadusi ole omased embrüonaalsete tüvirakkude lõplike või kudedesse. Eelkõige eeldatakse, et pikaajalisel kasvatamisel söötmetes tsütokiinide Hess lähemale kasvajarakke, kuna need tekivad sarnast muutust radade rakutsükli reguleerimiseks omandamisega võime rakendada piiramatul arvul raku pooldumise. Mõned autorid arvavad, et tuumorite arengu potentsiaali alusel kaalutakse embrüonaalsete tüvirakkude varajaste derivaatide inimese siirdamist kui ettevaatust. Nende arvates on palju turvalisem kasutada ESC-i põlvkondade järeltulijaid, st diferentseeritud rakkude esivanemisi. Siiski ei ole veel välja töötatud usaldusväärset meetodit stabiilsete inimese rakuliinide saamiseks, mis eristavad õiges suunas.

Seega on kirjanduses üha rohkem andmeid inimese embrüonaalsete tüvirakkude derivaatide transplantatsiooni positiivse terapeutilise toime kohta. Kuid paljud neist töödest tuleb läbi vaadata ja kritiseerida. Mõned teadlased usuvad, et varajaste kliiniliste uuringute tulemused on esialgsed ja viitavad ainult sellele, et tüvirakud võivad avaldada kasulikku mõju haiguse kliinilisele kulgemisele. Seepärast on vaja saada andmeid rakkude siirdamise pikaajaliste tulemuste kohta. Argumendina antakse kliinilise neurotransplantoloogia väljaarendamise etappid. Tõepoolest, kirjanduses esialgu domineerib väljaandes kõrge kasuteguriga aju siirdamise fragmendid embrüote Parkinsoni tõbi, kuid siis hakkas ilmuma aruanded keelates ravitoimet embrüo või loote närvikude siiratakse patsientide ajus.

Korraldas esimese kliiniliste uuringute ohutuse hindamiseks siirdamise neuroblast - derivaate PGCs NTERA-2 Teratokartsinoomi ebaküpsete rakkude vohavad kultuuri allutati ladustamise 100000000. Rakumassi. Osa nii saadud rakke kasutati määrata omadused rakufenotüübi ja lisandeid, samuti testida võimaliku nakatumise viiruste ja bakterite vastu. Alates sööde eemaldati LIF ja feeder kihti stroomarakkuse ja loote loonud tingimused suunatud diferentseerumist hESCs viiakse Neuroblaste kombinatsiooniga tsütokiinide ja kasvufaktoreid. Siis puhastati ebaküpsete Neuroblaste Teratokartsinoomi rakkudesse vooluelemendis sorteerija. Pärast teist puhastamist ja iseloomustamist fenotüübile siiratud rakud Neuroblaste (10-12 miljonist) suspensiooni kasutades spetsiaalset süstal ja microcannulas stereotaxy ja kontrolli all CT süstitakse tuumas basalis aju patsientidest (seitsmenda kuu pärast hemorraagilise insuldi). Odnogodovoy siirdamisjärgseks sõelutakse mõju siirdamise neuronite insuldi tsoonis pole ilmnenud ja soovimatuid mõjusid. Pooled patsientidest toimus paranemine motoorse funktsiooni perioodil vanuses 6 kuni 12 kuud pärast siirdamist. Positiivsed kliinilisi muutusi kaasnesid suurenemist verevarustuse insuldi tsoonis siirdamise järel rakud: keskmine imendumise suurenemine fluorestsentsmärgitud 2-desoksüglükoos vastavalt positronemissioontomograafial jõudnud 18%, ning mõnedel patsientidel - 35%.

Kuid USA riiklik terviseinstituut korraldas sõltumatu uuringu neurotransplantatsiooni kliinilise efektiivsuse kohta parkinsonismiga patsientidel. Esimese rühma patsiente siirdati dopamiini tootva embrüonaalse närvikoega, samal ajal kui teise rühma patsientidel tehti vale operatsioon. Tulemused näitavad sellise neurotransplantatsiooni null-kliinilist efektiivsust hoolimata asjaolust, et dopamiini tootvad embrüonaalsed neuronid säilisid retsipientide ajus. Lisaks pärast 2 aastat pärast siirdamist loote närvikude 15% patsientidest tekkis püsiv düskineesia, mis puudub patsientidel platseebogrupis (Tüvirakud: teaduse arengut ning tulevikus uurimissuunda Nat Inst, tervishoiuministeeriumi USA ...). Nendel patsientidel jätkuvad haiguse edasise arengu tähelepanekud.

Mõned autorid atribuut vastuolulised kirjandusele hinnata kliinilise efektiivsuse Neurotransplantation andmeid teistsugust lähenemist patsiendi valikul rühmad, ebapiisav valik eesmärgi hindamise meetodid nende seisundist ja mis kõige tähtsam, erinevate tingimuste arengut loote närvikoe ja erinevates ajuosades kust kangast toodeti erinevates suurustes operatsioonijärgne transplantatsioon ja metoodilised omadused.

Tuleb märkida, et katsed suunata siirdamisest pluripotentsed embrüonaalseid tüvirakke striaalsetele ajupiirkonnas rottide eksperimentaalse keha gemiparkinsonizmom kaasas ESC vohamist ja nende diferentseerumise dopamiinergiliste neuronite. Tuleb eeldada, et äsja moodustatud neuronite tõhusalt ehitatud neuronite võrgustikku sotsiaalnõukogude pärast siirdamist täheldati korrigeerimist anomaaliaid käitumise ja mootori asümmeetria apomorfiini test. Samal ajal surid mõned loomad siiratud ESK ümberkujunemise tõttu ajukasvajas.

Eksperdid USA Rahvusliku ja Medical Academy, spetsialistide National Institutes of Health usuvad, et kliinilise potentsiaali hESCs väärib tõsist tähelepanu, aga rõhutavad vajadust üksikasjalikult uuritakse nende omadused, komplikatsioonide tekkimise tõenäosust ja pikaajalisi mõjusid eksperimendid piisava bioloogilise mudelite inimese haiguste (Tüvirakud ja tulevase regeneratiivse meditsiini riikliku akadeemia ajakirja, tüvirakkude ja tulevaste teadusuuringute suunad., Nat.Instit. Tervis USA).

Sellest seisukohast on oluline, et võrdlevat histoloogilise analüüsi eksperimentaalsete teratoom saadakse siirdamise munandis läga PGCs koos teratoome mis on arendanud tingitud siirdamist varase embrüo, mis hõlmas ka käesoleva ESC näitas, et ESK sõltumata nende päritolust või koostoime nende või teiste ümbritsevate rakkude kaudu samamoodi ka nende tuumorigeensed võimed. See osutus, et sellised teratoome on kloonist, nagu kasvajaga sotsiaalnõukogud võib ilmneda, kuhu kuuluvad derivaatide kõigis kolmes Looteleht (.Rega, 2001). Väärib märkimist, et kui siiratakse immunodefitsiidiga hiired kloonitud PGCs normaalne karüotüüp ja moodustanud teratoome koosneb eri liiki diferentseeritud keharakkudes. Need eksperimentaalsed andmed on täpne tõend teratomi klonaalse päritolu kohta. Vaatenurgast arengu bioloogia, nad näitavad, et see ei ole mitu pühendunud eellasrakkude ja pluripotentsed tüvirakud identiteet on allikas diferentseeritud derivaadid kõigi kolme Looteleht, teratoom komponente. Kuid praktilises rakutransplantatsioonis Nende uuringute tulemused on, kui mitte liiga suured, siis hoiatusnähuks võimaliku ohu kuna nakatamist ESC või varajasele sugurakkudes erinevates kudedes täiskasvanud immunodefitsiidiga hiired vältimatult põhjustab kasvajate arengut alates siirdatud tüvirakke. Neoplastilistele degeneratsioon ectopically siirdatud ESC kaasas tekkimist satelliit populatsioonide diferentseerunud rakud - mida osaliselt eristada on kindlasti sotsiaalnõukogude ja vereloome kloonid pühendatud read. On huvitav, et siirdamise hESCs skeletilihasrakkudes lähedal teratokartsinomnymi neuronite moodustavad sagedamini. Kuid manustamist PGCs Mace muna või blastotsüsti kaasas täielik integreerimine sugurakkudes ilma moodustamine kasvajarakkude. Samal ajal ESC peaaegu kõigis organites ja kudedes embrüo, sealhulgas seksuaalse alge. Sellised allofennye loomad olid kõigepealt valmistada, allutades Teratokartsinoomi raku 129 algstaadiumis embrüotest 8-100 rakkudes. In allofennyh hiirte populatsioonide geterogenomnyh rakustpärineva doonori PGCs tuuakse luuüdi, soolestik, nahk, maksa ja genitaalid, mis võimaldab luua eksperimendis isegi liikidevahelisi raku kimäärid. Mida väiksem on aeg varase embrüo, seda kõrgem rakkude protsendi kimäriseerimine, kõrgeima astme kimäriseerimine täheldatud vereloomesüsteemi, naha-, närvisüsteemi, maksa ja peensoole allofennogo embrüo. Täiskasvanutel organismi kudede alluvad kimäriseerimine kaitsmiseks kokkupuute immuunsüsteemi saaja gistogematicalkie tõkked: siirdamist primordiaalsete sugurakkudes munandites parenhüümi kaasas sisestamist doonori tüvirakke vastuvõtjasse koe germenativny kiht. Kuid ESC siirdada blastotsüsti moodustumine kimäärne Primordia suguelundid koos põlvkonna doonori ürgse sugurakkudes ei esine. ESC pluripotentsuse loomisel eritingimused ning seda saab kasutada kloonimise: ESC siirdamise hiired 8-16-raku hiire embrüo rakkude mitoosi milles tsitokalazinom blokeeritud, aitab kaasa normaalse embrüogeneesi tekkega embrüo doonori PGCs.

Järelikult alternatiiv on siirdamise Allogeense ESC terapeutilise kloonimise põhinevad somaatiliste rakkude tuuma siirdamise arvesse enucleated munarakku luua blastotsüsti sisemise rakumassi kust jaotatakse seejärel line geneetiliselt identse doonorhiire PGCs somaatiliste tuumas. Tehniliselt see idee on teostatav, kuna võimalust luua Inimese embrüonaalsete tüvirakkude read blastotsüüdid saadud pärast somaatiliste tuumade arvesse enucleated munaraku korduvalt tõestanud katsetes katseloomadega (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Eriti homosügootsed hiired mutatsioon rag2 fibroblastid kasvatamise teel subepidermaalse koe rakke kasutati doonorikeskusena tuumade siiratakse enucleated munarakkudel. Pärast aktiveerimist ootsüütide "sügoodi" kultiveeritud kuni blastotsüsti moodustumine, sisemisest rakumassi on isoleeritud PGCs ja associated neid viiakse rida mutantgeeni nullizigotnyh rakud (rag2 ~ / ~). Homoloogilise rekombinatsiooni teel sellisel PGCs korrigeerimiseks mutatsiooni ühe alleelne geen. Esimeses katseseerias saadud hESCs rekombinantse geeni taastunud embryoid organite valmistati transfekteeritud rakud selle rekombinantse retroviiruse (HoxB4i / GFP) ja pärast paljundamist süstitud hiirtel veenide rag2 ~ / ~. Teise seeria tetraploidsest blastomeres koondatud geneetiliselt muundatud hESCs ja siirdatud neid suublasse naine. Sündinud immunokompetentsete hiirte luuüdi siirdamise mutanthiirtes rag2 ~ / ~. Kummaski seerias tulemus oli positiivne: 3-4 nädalat kõigil hiirtel normaalsete küpse müeloidse ja lümfoidrakku on leitud võimelised tootma immunoglobuliinide. Seega siirdamiseks munarakku tuumade keharakkude saab kasutada mitte ainult toota inimese embrüonaalseid tüvirakke read, vaid ka tsitogenoterapii - Korrektsioon pärilike anomaaliaid ESC vektorina transpordi korrigeerima geneetiline informatsioon. Aga isegi selles valdkonnas siirdamist, välja arvatud bioeetika küsimustes, see on omad piirangud. Ei ole selge, kuidas ohutu siirdamise oleks terapeutiliselt kloonitud rakkude genotüübiga identne genotüüp konkreetsele patsiendile, sest sellised rakud võivad mutatsioonide et luua eelsoodumus teatud haiguste raviks. Tavaline inimene munad jäävad kättesaamatuks objekti, arvestades, et isegi kui ümberistutamiseks somaatiliste tuumade arvesse enucleated loomade munaraku ainult 15-25% konstrueeritud "sügoot" arendada blastotsüsti staadiumis. Seega ei ole määratletud, kui palju blastotsüüdid vaja saada üks rida pluripotentsed kloonitud hESCs. Tuleb märkida, ja kõrge tase rahalised kulud keerukust metoodika terapeutilise kloonimise.

Kokkuvõtteks võib öelda, et ESC pluripotentsuse genoomi hüpometüülitud DNA kombineeritakse suurte telomeraasiaktiivsus ja lühikeste C ^ rakutsüklifaasi, mis tagab intensiivse ja potentsiaalselt lõpmatu paljunemist, mille käigus PGCs säilitavad diploidne kromosoomide ja "juveniilne" kogum fenotüübitunnuste. Kloonianalüüs kasvu PGCs kultuuris ei välista need diferentseeruvad spetsiaalseid raku organismi juures stoppjoon vohamist ja lisades sobivaid reguleerivad signaalid. Liik diferentseerumist hESCs kooskõlas in vitro keharakkude realiseerub ilma osalusel mesenhüümi, mööda Nohteyaov, on organogeneesi ilma teket embrüo. Emakaväline in vivo manustamist PGCs paratamatult viib moodustamine teratokartsinoom. ESC siirdada blastotsüsti või varajase embrüo kaasas nende integreerimine kudede embrüo ja selle stabiilne kimäriseerimine organid.

Taastav ja plastist tehnoloogiate põhinevad rakkude siirdamine on ristumiskohta liikmete huve, rakubioloogia, arengu bioloogia, eksperimentaalse geneetika, immunoloogia, neuroloogia, kardioloogia, hematoloogia ja paljudes teistes valdkondades eksperimentaalse ja praktilises meditsiinis. Kõige olulisem katsetulemuste tõestada võimalust taasprogrammeerimiseks tüvirakkude suunas muutus nende omadused, mis avab väljavaated juhtimiseks rakudiferentseerumise protsesside kasvufaktorid - müokardi taastamine, restaureerimine KNS kahjustuste ja normaliseerimise funktsioon saareke seade kõhunäärme. Kuid laialdane kasutuselevõtt siirdamise derivaadid ESC meditsiinipraktikas on vaja uurida omadused inimese tüvirakkude detailsemalt ja edasi eksperimendid PGCs eksperimentaalsetes mudelites haigused.

Bioeetiliste küsimusi ja probleem äratõukereaktsiooni Allogeense rakusiirikuks võiks lahendada vaadeldud plastilisus genoomi piirkondliku tüvirakud. Siiski esialgsed andmed on, et kui siirdades maksas isoleeritud ja põhjalikult kirjeldanud autoloogse Vereloomerakkude, millest on uusi hepatotsüütidel inkorporeeritakse maksa- lobules, on nüüd läbi ja heita. Kuid avaldatud andmete siirdamist neuraalsed tüvirakud tüümuses on moodustamine uute võrsete doonori T-ja B-lümfotsüütide ja siirdades neuraalsed tüvirakud aju luuüdis viib moodustamine vereloome idu püsivalt doonori müeloidse ja erütropoeesi . Järelikult täiskasvanud elundite saab säilitada pluripotentsed tüvirakud on võimelised genoomi ümberplaneerimine ESC võimsust.

Inimembrüoid jääb ESC-i meditsiiniliseks otstarbeks kättesaamise allikaks, mis määrab kindlaks inimelu sünnihetkel moraalsete, eetiliste, moraalsete, õiguslike ja usuliste probleemide uue ristumiskoha vältimatu tekkimise. ESKde avastamine andis tugeva tõuke karmide arutelude taastamiseks, kus valitseb elusrakkude ja materiaalse, sisulise ja isiksuse vaheline joon. Samal ajal ei ole ESC-i meditsiinil põhinevaid universaalseid norme, eeskirju ja seadusi, hoolimata korduvatest katsetest neid luua ja aktsepteerida. Iga riik oma õigusaktides lahendab selle probleemi iseenesest. Omalt poolt püüavad arstid üle kogu maailma jätkuvalt selliste arutelude käigus välja töötada regenereerivat plastikmaterjali, peamiselt embrüonaalsete tüvirakkude ja täiskasvanud organismide tüviraku varude kasutamise kaudu.

Mõned embrüo tüvirakkude isoleerimise ajalugu

Terato- (embrüo) rakud eraldati -kartsinomnye aset spontaanselt munandivähk teratoome hiireliinilt 129 / ter-Sv, spontaanne munasarjade teratoome hiireliinil Lt / Sv ja alates teratoome, ektopichno allikaks olid siiratud rakud või embrüonaalsete kude. Seas viisil saadud terato- stabiilsed hiire read (embrüo) -kartsinomnyh mõned rakud on pluripotentsed, teised allutati diferentseerumise ainult rakkudes ühte teatud tüüpi ja ning mõned neist on olnud üldiselt võimetud rakudiferentseerumise.

Ajal, fookus oli uurimistöö näitas, võimaliku tagastamise terato- (embrüo) -kartsinomnyh rakkude normaalse fenotüübiga pärast nende kasutuselevõttu areneva loote kudede, samuti töö luua laboris geneetiliselt muundatud terato- (embrüo) -kartsinomnyh rakud, mille abil saadi inimese päriliku patoloogia bioloogilisel modelleerimisel saadud mutantsed hiired.

Et isoleerida terato- read (embrüo) on kasutatud konditsioneer -kartsinomnyh rakususpensiooni kultuuri. Kultuuris terato- (embrüo) -kartsinomnye rakud, nagu kus majandus- ja kasvada, moodustamaks embryoid organite ja nõuavad tõlgitakse joont seondumise dissotsiatsioon säilitades pluripotentsuse kohta söödatopsi kiht embrüonaalsed fibroblastid või suspensiooni kultiveerimiseks söötmes. Terato- pluripotentsed rakud (embrüo) - kartsinoom read suured, kerajad, on kõrge aktiivsusega alkaliinfosfataasist, vorm agregaate ja on võimelised mitmesuunaliste diferentseerumist. Kui sisestatakse blastotsüsti agregeeruvad moorula, mille tulemusel moodustus kimäärsetest embrüote erinevates organites ja kudedes, mis derivaadid leidub terato- (embrüo) -kartsinomnyh rakkudes. Kuid enamik selliseid kimäärne embrüote surevad emaüsas ja organite ellujäänud kimäärid vastsündinud välismaa rakkude ja harva tuvastatud madala tihedusega. Samal ajal kasvajate esinemissageduse (fibrosarkoom, rabdomüosarkoom, ja teist liiki pahaloomuliste paisumine ja adenoomi Pankreas) järsult suurendab ja neoplastiliste degeneratsiooni esineb sageli isegi emakasisese kimäärne embrüo.

Enamik terato- (embrüo) -kartsinomnyh rakkude mikrokeskkonna normaalse embrüonaalsed rakud peaaegu looduslikult muutub pahaloomulise neoplastilise omadused. Usutakse, et pöördumatu pahaloomulise põhjustab aktiveerimist protoonkogeenidega protsessis struktuurseid ümberkorraldusi. Üks erand on rakuliine embriokartsinomnoy SST3, teratoom saadud hiire munandis (line 129 / Sv-ter), millel on suur võime integreeruda kudede ja organite lootele ilma järgnevate kasvajate moodustumise kimäärsed hiired. Derivaat terato- (embrüo) -kartsinomnyh rakuliine hiirtel kimäärid peaaegu ei osale moodustamise primaarne gonocytes. Ilmselt see on seotud suure sagedusega kromosoomimutatsioone ühine enamikule terato- (embrüo) -kartsinomnyh liinid millised rakud täheldatakse aneuploidsuseks või kromosomaalse anomaalia.

Mitme stabiilse terato- read (embrüo) -kartsinomnyh inimese rakk valmistati laboratoorsetes tingimustes, mida iseloomustab see pluripotentsuse, kõrgproliferatiivset aktiivsus ja võime diferentseeruda kultuuris kasvamise ajal. Eelkõige terato- line (embrüo) -kartsi- holonomic NTERA-2 inimrakkude uurimiseks kasutati mehhanismide neuraalne rakudiferentseerumise. Pärast siirdamist rakud selle joone subventrikulaarses piirkonda eesaju vastsündinud rottide ja nende migratsiooni täheldati neyronogenez. On olnud isegi üritab siirdamist neuronite terato- saadud rakkude kultiveerimise (embrüo) -kartsinomnoy line NTERA-2, patsientidele lööki, mis autorite sõnul, mis viib kliinilise haiguse paranemise. Sel juhul pahaloomulise terato- siiratud rakud (embrüo) -kartsinomnoy line NTERA-2 patsientidel insuldi on täheldatud.

Esimene rida diferentseerumata pluripotentsed embrüonaalseid tüvirakke hiirte juba 80-ndate eelmise sajandi sai Evans ja Martin, valides neid sisemise rakumassi kohta blastotsüsti - embryoblast. Eraldatud ESC-liinid säilivad pikaajaliselt pluripotentsuse ja võime eristada erinevat tüüpi rakke spetsiifilise kultuurikeskkonna tegurite mõjul.

Termin "embrüonaalse pluripotentsed tüvirakud" kuulub Leroy Stevens et uurimine Tubakatõrvas mõju sagedus kasvaja arengut juhtis tähelepanu spontaansete munandivähk Teratokartsinoomi lineaarsete (129 / v) hiirte kontrollgrupis. Testikulaarsed Teratokartsinoomi rakud, mida iseloomustab suur proliferatsiooni kiirust ning vedeliku juuresolekul jäänud kõhuõõnde tekkega spontaanse diferentseerumise neuronite keratinotsüütidele kondrotsüüdist, kardiomüotsüüdide, samuti juuksed ja luufragmentide viitamata sellele Korrastatud cytoarchitectonics sobivas koes. Kui istutada teratokartsinoomirakkudes rakukultuuris kasvatatud kinnitamata substraadile pluripotentsed kloonid ja moodustanud embryoid kehad olid siis summutati ja allutati Spontaanne lõhustumine korrapäratut diferentseeruvad neuronid, gliiarakkude lihasrakud ja kardiomüotsüüdide. Stevens leiti, et Teratokartsinoomi hiire 129 / v sisaldab vähem kui 1% rakkudest suudavad diferentseeruda mitmesuguste spetsialiseeritud somaatiliste liin, ja mis on ise diferentseerumise sõltub teguritest, mis mõjutavad nende (kompositsioon peritoneaalvedelikku toodetel lisati kultuurile küpsete rakkude või kudede). Leroy Stevenson Eeldused juuresolekul seas Teratokartsinoomi rakud embrüonaalsete eellasrakkude seksuaalse sugurakkudes kinnitati: peatamist embryoblast implantatsioonieelsel embrüote rakud täiskasvanud hiire kudede moodustatud Teratokartsinoomi ja nendest eraldatud puhtad rakuliine pärast intraperitoneaalset manustamist retsipientloomad oli diferentseerunud neuronites kardiomüotsüüdide ja teiste somaatiliste kletki derivaadid kõigi kolme Looteleht. Eksperimentides in vivo siirdamise ESK (saadud embryoblast kuid mitte trofoblasti) hiire embrüod erinevatel etappidel read 8-32 Blastomeer lõppenud sündi kimäärse looma (no kasvaja moodustumise) elunditega mis tuvastab kapsas doonorikoele. Kimäärsus täheldati isegi rida soost rakkudes.

Esmane eellasrakkude sugurakkudes eraldati hiire embrüo idu soost, morfoloogia immunoloogilise fenotüübi ja funktsionaalsed omadused, mis on kooskõlas hESCs saadud Teratokartsinoomi Stevenson ja embryoblast. At kimäärid sündinud pärast manustamist hESCs viiakse blastotsüsti allofenny elundi morfogeneesi erineb mosaiik vahelduva doonori ja retsipiendi struktuuriliste ja funktsionaalsete üksuste maksa-, kopsu- ja neerud. Mõningatel juhtudel täheldatud moodustumist soolekrüptid või maksa viilud, kuhu kuuluvad nii doonori ja retsipiendi rakke. Kuid rakendamist morfogeneesi alati tekkinud geneetilise programmi kujul, mis kuulus saajale ning kimäärsus piirasid rakutasandil.

Seejärel leiti, et vohamist hESCs ilma rakudiferentseerumise kohta söödatopsi kihti tuletatud mesenhümaalrakkudes (loote fibroblastid) esineb kohalolekul LIF siduvad selektiivse toitekeskkonnale mis selektiivselt pakkuda ainult ellujäämise tüvi- ja progenitoorrakkude, samas kui enamik spetsialiseeritud rakulised elemendid sureb. Tänu nende meetodite 1998 James Thomson oli eraldatud viis surematuks rida embrüonaalsete tüvirakkude sisemine rakkude mass blastotsüsti inimene. Samal aastal John Gerhart on välja töötanud meetodi eraldamiseks surematu ESC read seksuaalse puff nelja-viie nädala inimese embrüote. Tänu oma unikaalsed omadused, ainult kaks aastat hiljem embrüonaalsete tüvirakkude ja rakkude lõplikku koe hakanud kasutada tava regeneratiivse meditsiini ja geeniteraapia.