Osteoartriidi eksperimentaalsed mudelid

Kõhr on väga spetsiifiline kude, mis sisaldab ainult üht tüüpi rakke (kondrotsüüdid), mida iseloomustab vere ja lümfisõlmede puudumine. Kõhre toitumine toimub peamiselt sünoviaalvedeliku imendumise kaudu. Kondro-tsüütide metabolismi reguleerivad mitmed lahustuvad tegurid, mis tekivad kohapeal kondrotsüütide ja ümbritsevate kudede poolt. Kondrotsüütide funktsioon sõltub ka rakuvälise keskkonna (hapniku pinge, ioonide kontsentratsioon, pH jne) koostis, VCM-i kompositsioon, raku ja maatriksi interaktsioon, füüsilised signaalid. Katse modelleerimise peamine ülesanne on kultuuride loomine ekstratsellulaarses keskkonnas, muutes küpsete rakkude fenotüüpi. Teine ülesanne on luua kultuurid kondrotsüütide enneaegse, viivitatava, lühiajalise või pikaajalise vastuse uurimiseks keemilistele ja / või füüsilistele signaalidele. Uuringud in vitro ka võimaluse õppida käitumise kondrotsüütkoostisosadest osteoartriidi. Kolmas ülesanne on kaasravi süsteemide väljaarendamine, mis võimaldab uurida erinevate kudede koostoimeid liigeses. Neljas ülesanne on kõhulahtiste implantaatide valmistamine järgnevaks siirdamiseks. Ja lõpuks, viies ülesanne on uurida kasvufaktoreid, tsütokiine või terapeutilisi aineid, mis on võimelised stimuleerima krambide resorptsiooni ja / või pärssimist.

Viimase kümne aasta jooksul, mis on loodud erinevate mustritega liigesekõhre rakkude kultuuride, nende seas - ühekihilisse, peatatud kultuur, kultuur hondronov eksplantaadid, kaaskultuuri, surematu rakukultuuris. Igal kultuuril on oma eelised ja puudused, millest igaüks sobib kondrotsüütide ainevahetuse ühe konkreetse aspekti uurimiseks. Seega on kõhr-ekspantaadid suurepärane mudel maatriks-elementide käibe uurimiseks, mis nõuab tõelisi rakupinna retseptoreid ja normaalsete rakumaterjali- ja maatriks-rakkude vastastiktoiminguid. Samal ajal soovitatakse viia läbi maatriksis olevate hoiuste uurimine või kondrotsüütide metabolismi reguleerimise mehhanismid isoleeritud rakkude kultuuris. Rakkude diferentseerumise protsessi uurimiseks on vajalik monokiht väikese tihedusega kultuur. Looduslikus või sünteetilises maatriksis suspendeeritud kultuurid on mudel, mis võimaldab analüüsida kondrotsüütide adaptiivset reaktsiooni mehaanilisele stressile.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Kondrotsüütide kultuurid

Kõhrkoe valimisel in vitro uuringutes tuleb arvestada mitmete oluliste punktidega. Kondrootsüütide maatriksi koostis ja metaboolne aktiivsus varieeruvad erinevates liigeses ning viimane sõltub ka kondrotsüütide sügavusest koes. Need andmed saadi mitmes eksperimendis, kus uuriti erinevate sügavuste kõhrepiirkondade kondrotsüütide isoleeritud alampopulatsioone. Pinnal paiknevate kultiveeritud kondrotsüütide ja liigesekõhre sügavate kihtide vahel leiti mitmeid morfoloogilisi ja biokeemilisi erinevusi. Pindmised rakud sünteesivad haruldaste vaesestatud fibrillaarne maatriksi proteoglükaanid arvestades sügavamates rakud toodavad maatriksi täis fibrille ja proteoglükaanidele. Lisaks pindmised rakud produtseerivad suhteliselt enam väikeste agregeerumata proteoglükaanidele ja hüaluroonhappe agrekaani ja suhteliselt väiksema kerataansulfaat, seda rohkem sügavalt paiknev kondrotsüüdist. Erinevate sügavuste kõhrepiirkondadest eraldatud kondrotsüütide ainevahetuse teine oluline omadus on vastus eksogeensele stiimulile. M. Aydelotte ja kaasautorite sõnul olid kõhre pinnaniviirusest pärinevad pulli kondrotsüüdid tundlikumad IL-1-st kui sügavast tsoonist pärinevad rakud.

Rakkude käitumine sõltub ka koe asukohast. Kondrotsüüdist kõhre ja kõrva servad, mis on võetud samalt loom, kes reageerivad erinevalt kasvufaktoreid nagu fibroblastide kasvufaktor (FGF) ja TGF-beeta. FGF suurenenud tümidiini, proliini ja leutsiin Kultuurile kondrotsüütidest ribi kuid mitte kõrva. TGF-P suurendas tümidiini viiakse kõhre kondrotsüüdist ribi ja kõrva, kuid ei avaldanud mingit mõju tümidiini viiakse kondrotsüüdist ja proliini kõrva. Suurima koormusega kandevõimedest saadud kõhrrakud erinevad kõhre madala koormusega alade omadest. Näiteks küpse kondrotsüüdist kõhre põlveliigese alates keskosas lambad liigessündroom sääreluus pinna hõlmamata meniski, mis kannab ka kõige koormuse in vivo, väiksemate sünteesiti aggrekaan jadekoriin kuid suurem kui rakud hõlmatud valdkondades meniski. Samuti rõhutavad autorid, kui oluline on kasutada liigeste keemilise funktsiooni uurimisel kõhride kasutamist ühest identsest tsoonist.

Kondrotsüütide metabolism ja nende reaktsioon reguleerivatele teguritele sõltub oluliselt ka doonori vanusest, selle luustiku arengust ja liigestuste seisundist, millest rakud võetakse. Inimese kondrotsüütides täheldatakse proliferatiivse vastuse märkimisväärset vähenemist vanusega. Suurim langus on täheldatud doonoritel vanuses 40-50 aastat ja üle 60 aasta. Veelgi enam, proliferatiivne vastus rasvumisele kasvufaktorites (nt FGF ja TGF-beeta) väheneb vananemise ajal. Lisaks kondrotsüütide proliferatsiooni kvantitatiivsetele muutustele on ka kvalitatiivseid muutusi. Noorte doonorirakkude (10-20 aastat) on vastuvõtlikumad kasvufaktori, vereliistakutekkese (PDGF) kui TGF-beeta, arvestades vastupidist rakkudes täheldati täiskasvanud doonorid. Kondrotsüütide sünteetilise funktsiooni vanusest sõltuvate muutuste selgitamiseks ja nende vastuseks kasvufaktorite mõjule kasutatakse mitmeid mehhanisme. Nende seas on pinnarakkude retseptorite arvu ja sarnasuse vähenemine, kasvutegurite ja tsütokiinide sünteesi ja bioaktiivsuse muutus, postretseptori signaalide muutus.

Liigeste patoloogiline seisund muudab kondrotsüütide morfoloogiat ja metaboolset aktiivsust. Niisiis, J. Kouri ja kaasautorid (1996) identifitseerisid osteoartriidi kõhrusega kolm kondrotsüütide subpopulatsiooni. Kõhre pindmisest ja ülemisest kesest kondrotsüüdid moodustavad klastreid ja sünteesivad rohkem proteoglükaane ja kollageeni. TGF-beeta ja insuliini kasvufaktor (IGF) võib stimuleerida proteoglükaani sünteesi kondrotsüüdist ja osaliselt neutraliseerida IL-1 ja TNF-a. Kõhre eksplantid all kannatava osteoartriit ja kondrotsüütidega eraldati kõhrest patsientide osteoartriit, on tundlikumad stimuleerimine TGF-beeta kui terve kõhre kondrotsüüdist. Need erinevused on kõige tõenäolisemalt seotud kondrotsüütide fenotüübiliste muutustega liigesekõhre ülemises kihis.

Individuaalsete kondrotsüütide eraldamine saavutatakse ECM proteolüütiliste ensüümide järjestikulise töötlemisega. Pärast ECM-i vabanemist on isoleeritud rakud ideaalselt sobivad de novo maatrikskomponentide sünteesi uurimiseks . Mõned autorid kasutavad ainult klostriidiumkollagenaasi, teised eelkubeerivad kõhre trüpsiiniga, pronase, DNaasi ja / või hüaluronidaasiga. Isoleeritud rakkude arv sõltub kasutatud ensüümidest. Seega, kui töödeldakse ühe 1 g kollagenaasi koe saab 1,4T0 ⁶ kondrotsüüdist, arvestades kasutamisel pronaasi, hüaluronidaas ja kollagenaasi - 4,3-10 ⁶. Kollagenaasi töötlemisel jäävad agrekaani, valkude, IL-6, IL-8 rakukultuuris palju rohkem kui erinevate ensüümide järjestikuse töötlemise korral. Nende kahe rakukultuuri erinevuste vahel on mitu selgitust:

• Rakuretseptoritele kahjustatud või vajutatud ensüümide toime TGF-beeta pärsib DNA sünteesi proteoglükaanidele äsja eraldatud kondrotsüüdist (päeval 1), samas DNA- ja proteoglükaani sünteesi kondrotsüütidest kultiveeriti monokiht (7 päeva) stimuleeritud TGF-beeta. Kuid nende membraankomponentide uuesti ekspresseerimiseks on vajalik enne katse algust piisav ajavahemik.
• Eksogeensed proteaasid võivad murda rakkude ja maatriksi interaktsiooni, mida vahendavad integriinid. Integriini perekond soodustab kondrotsüütide kinnistumist VKM-i molekulidele (Shakibaei M. Et al., 1997). See rebend võib mõjutada maatriksi geenide ekspressiooni.
• Maatriksi komponentide jäägid võivad reguleerida kondrotsüütide sünteetilist funktsiooni. Integriinid on võimelised tuvastama ECMi lagunemisprodukte, mängides seega olulist rolli kudede remondis pärast proteolüütiliste ensüümidega kokkupuudet. T. Larsson ja kaasautorid (1989) teatasid, et tervete või killustatud pro-teoglükaanide lisamine rakukultuurile stimuleerib valkude ja proteoglükaanide sünteesi. Kuid kõrge hüaluroonhappe põhjustab märgatava vähenemise lisamist kaaniga sünteesil kondrotsüüdist kanalootest kondrotsüüdist küps sea ja roti chondrosarcoma rakkudes. Pealegi, hüaluroonhape - inhibiitor proteoglükaani vabanemist rakkudest isegi IL-lb, TNF-a, FGF, mis näitab, et esimese tasakaalustades bioloogilist aktiivsust kasvufaktoreid ja tsütokiine. Hüaluroonhappe toime täpne mehhanism jääb ebaselgeks; On teada, et kondrotsüüdid sisaldavad hüaluroonhappe retseptorit, mis on seotud tsütosooli aktiinfilamentidega. Hüaluroonhappe seondumine selle retseptoriga stimuleerib valkude fosforüleerimist. Seega näitavad need andmed kondrotsüütide metaboolse funktsiooni moduleerimist maatriksvalkude fragmenteeritud või natiivsete molekulidega, aktiveerides membraani retseptori rakke.
• Kondrotsüütide maatriksvalkude sünteesi ensüümide kiire stimuleerimine võib olla kondrotsüütide kuju muutuse ja / või tsütoskeleti reorganiseerimise tagajärg.
• Mõned tsütokiinid (nt IL-8) ja kasvufaktorid (nt IGF-1, TGF-P) on fikseeritud ECM-is. Tuntumateks näideteks on TGF-beeta seondumine dekoreerimisega, mis vähendab endiste võimet indutseerida rakkude kasvu munasarja rakkudes hiina hamstritel. Andmed kõhrede sisustuse suurenemise kohta vanusega viitavad TGF-beeta biosaadavuse vähenemisele vananemisel. Kasvufaktorid ja tsütokiinid võivad vabaneda maatriksjääkidest kultiveerimise ajal ja seejärel modifitseerida kondrotsüütide funktsiooni.

[8], [9], [10], [11],

Monoteraapia kondrotsüütide kultuuris

Diferentseeritud fenotüübi kondrotsüütidest iseloomustab eelkõige sünteesi II tüüpi kollageeni ja proteoglükaanid koespetsiifiliste ja madala mitootilise aktiivsust. On tõendeid, et pikaajaline kasvatamine rakkude monokiht ja pärast mitu korduvate tsüklite rakkude, kondrotsüütidest kaotavad oma sfäärilise kuju, muutuvad pikliku fibroblastilaadsed kuju. Sellise fibroblastide metaplasia sünteetilised funktsiooniks on ka modifitseeritud rakud, mida iseloomustab progresseeruv vähenemine sünteesiks kollageenid II, IX ja XI tüübid ja parendatud kollageeni sünteesi I, III ja Utipov. Väikesed mitteagregeeritud proteoglükaanid sünteesitakse funktsionaalse agrekana abil. Sintezkatepsina B ja L on äärmiselt nõrk diferentseerunud rakkude, kuid protsessi diferentseerumise kaotuse suureneb. Kollagenaasiga 1 väljendatakse diferentseeritud kondrotsüüdist ajal pikenenud kasvatamise selle ekspressiooni vähendatakse arvestades suurenenud tootmist koeinhibiitori metolloproteaasid (TIMP).

Diferentseeritud kondrotsüüdist reekspressiruyut kollageeni diferentseerunud fenotüübi ülekandmisel neid ühekihiline kultuur kaalutud. Diferentseerumise protsess on tõenäoliselt seotud rakkude kujust. Seda vara kasutavad regulaarselt teadlased, kes uurivad autoloogsete kondrotsüütidega defektseid siirdamisi. Vähestel rakke biopsia materjalist, saab paljundada monokihtkultuuri ja siis jälle paigutati kolmemõõtmelise maatriksi enne siirdamist. Re-ekspressiooni konkreetse fenotüübi dediferentseerimata kondrotsüüdist migreerusid agaroos kultuuri, võib stimuleerida TGF-p-osseiini hüdroksüapatiidile keerulised ja askorbiinhape.

Vastuseks kasvufaktorite ja tsütokiinide mõjule redutseeritakse kondrotsüüte diferentseerumisprotsessis. Tsütokiinide ja kasvufaktorite rakulised vastused erinevad diferentseerumata ja diferentseeritud kondrotsüütide vahel. IL-1 stimuleerib fibroblastide proliferatsiooni, samas kui diferentseerimata kondrotsüütide kasvu inhibeerib IL-1. DNA sünteesi stimuleerib IGF-1 piklikud, kuid mitte lamestatud kondrotsüüdid. Diferentseeritud kondrotsüütides on IL-1β ja TNF-α stimuleeriv mõju prokollagenaasitoodetele selgemini kui diferentseerumata.

Kondrotsüütide kasvatamine

Kondrotsüütide kasvatamine suspensioonis vedelas keskkonnas või looduslikus või sünteetilise kolmemõõtmelises maatriksis tasakaalustab kondrotsüüdi fenotüübi. Rakud säilitavad oma sfäärilise kuju, sünteesivad koespetsiifilisi valke. Uue perikulaarse maatriksi moodustamiseks on tavaliselt soovitatav kaalutud kondrotsüütide kultuur. Sünteetilistest või looduslikest absorbeerivatest polümeeridest pärit kondrotsüütide kultuure kasutatakse rakkude implanteerimiseks kõhredefektidesse, et stimuleerida liigese kõhrekoe regenereerimist. Siirdatavate rakkude sünteetiline või looduslik keskkond peab vastama paljudele nõuetele:

• Implantaadid peaksid olema nakkavuse ja rakkude kasvu jaoks poorse struktuuriga,
• ei polümeeri enda ega selle lagunemissaadused ei tohiks in vivo implanteerimisel põhjustada põletikku ega toksilisi reaktsioone ,
• siirdamise kandja peaks suutma siduda külgneva kõhriga või subkondraalse luuga,
• looduslik või sünteetiline maatriks peab olema võimeline imenduma, selle lagunemine peab olema tasakaalustatud koe regenereerimisega,
• Kõhre parandamise hõlbustamiseks peaks maatriksi keemiline struktuur ja maatriksi arhitektuur aitama säilitada kondrotsüüdidesse sisestatud raku fenotüüpi ja koespetsiifiliste valkude sünteesi,
• implanteerimisel in vivo, on vaja uurida sünteetilise või loodusliku maatriksi mehaanilisi omadusi.

[12], [13], [14], [15], [16]

Kondrotsüütide suspensioon vedelas faasis

Rakkude kinnitumist plastsele laevadel, kus kultiveerimise kondrotsüütidest saab ennetada nende seinte kaetud lahuse metüültselluloosi, agaroos, hüdrogeeli (polü-2-hüdroksüetüülmetakrülaat) või nende segu kollageeniga agaroos. Nendes tingimustes moodustavad kondrotsüüdid klastreid ja sünteesivad peamiselt agrekaani- ja koespetsiifilisi kollageene (II, IX, XI tüüpi). Tavaliselt leitakse kahte tüüpi rakke. Keskel paiknevad rakud säilitavad hästi arenenud ECM-i ümbritsetud sfäärilise kuju, mida kinnitavad histokeemilised ja ultrastruktuuriuuringud. Äärealadel on kondrotsüüdidel discoidkontuurid, mida ümbritseb haruldane ECM; Selliste rakkude funktsionaalsed omadused on vähe teada.

Suspensioonis toetatavate mikrokandurite kondrotsüütide kasvatamine on võimalik; mikrokandjatena lehe dekstraanist helmed (tsitodeks), kollageeni kaetud dekstraanist helmed (tsitodeks III), besporovye mikrokerad on I tüüpi kollageeni (tsellagen). Nende kultuuri tingimustes kondrotsüütidega lisada mikrokandja pinnaga säilitavad oma sfääriline kuju ja toota matriksnopodobny materjali. Lisaks sellele soodustab kollageeni kasutamine kondrotsüütide proliferatsiooni ja normaalse fenotüübi uuesti ekspresseerimist. Seetõttu võib kondrotsüütide kasvatamist kollageeni mikrosfäärides kasutada rakulise fenotüübi taastamiseks enne siirdamist.

Teine meetod kultiveerides kondrotsüüdist suspendeeritud vedelas söötmes on vormis nende kasvatamine tihe helmed, kuhu kuuluvad rakud (0,5-1 * 10 ^b ) tsentrifuugimisel saadud. Sellised kondrotsüüdist on võimelised tootma maatriksit, mis sisaldab suures koguses proteoglükaanid II tüüpi kollageen, kuid mitte I tüüpi kollageeni, mida kinnitas ka histoloogilise immunohistokeemiline ja kvantitatiivseid meetodeid.

Kondrotsüütide suspendeerimine looduslikus ECMis

Chondrocytes võib kultiveerida suspensioonis kolmemõõtmelise maatriksi (soft agar, agaroos, kutsuvad geenide geeli või käsna, hüaluroonhape, fibriinliimi, alginaat helmed).

Kultiveeritud agaroosi kondrotsüüdid säilitavad oma tavapärase fenotüübi ja sünteesivad II tüüpi kollageeni ja koespetsiifilisi uusi agregaate. Kui kultiveeritakse agaroosis, vabanevad rakusünteesitud proteoglükaanid söötmesse 50 päeva. Võrdluseks - monokihilises kultuuris täidetakse rakufaas glükoosaminoglükaanidega juba esimesel 5-6 päeva kasvuperioodil; kui kultiveeritakse keskkonnas pärast glükoosaminoglükaanide sünteesi ja vabanemise intensiivistumist, toimub glükoosaminoglükaanide ajast sõltuv vähenemine esimese 8-10 päeva jooksul. Sellest hoolimata erineb kondrotsüütide käitumine nende kasvatamisel agaroosis kui in vivo tingimustes. Agaroos sisaldab suur hulk sünteesitud Aggregani agregaate väiksemaid ja väiksemaid molekule kui in vivo. TGF-P stimuleerib proteoglükaanide sünteesi laboratooriumis, kuid vähendab agrekaani sünteesi agaroosis.

Alginaat on lineaarne polüsahhariid, mis on saadud pruunvetikatest. Selliste kahevalentsete katioonide nagu Ca2 ^{+ -ioonide} juuresolekul muutub see polümeer geeliks. Iga kondrotsüütkoostisosadele püütud alginaat, mida ümbritseb maatriks negatiivselt laetud polüsahhariide, poorid, mis on võrreldavad hüaliinse kõhre. Maatriks mis moodustub kondrotsüüdist alginaati helmed, mis koosneb kahest segmendid - õhuke kiht rakuga seotud maatriksi vastav peritsellulaarse ja territooriumiga maatriksid liigesekõhre ja kaugemates maatriksi territooriumidevahelisi ekvivalent native kude. 30. Päeval kultuuri, suhteline ja absoluutne poolt hõivatud ruumala rakkude ja mõlema osakondade alginaatkihile rant on peaaegu täielikult identsed native kõhre. Juba peaaegu 30 päeva kondrotsüüdist säilitavad oma kerakujulised ja toota aggrekaan hüdrodünaamiline omadused, mis on sarnased nendega agrekaani molekulide maatriksis liigesekõhre ja kollageenimolekuli II, IX ja XI liiki. Samal ajal, nagu ka teised kultuurid, suspensioonid, Alginaat helmed pinnal lapik rakud esinevad mis tekitavad väikese koguse I tüüpi kollageeni molekulid, lastakse otse keskkonna ja ei kajastu VCR. Alginaadi helmeste korral täheldatakse kondrotsüütide mõõdukat proliferatsiooni. Pärast 8 kuud kasvatamisele alginaatgeeliga küpse kondrotsüüdist ei kaota metaboolne aktiivsus ja jätkab sünteesivad koespetsiifiliste II tüüpi kollageeni ja agrekaani.

H. Tanaka et al (1984) uurisid omadusi erinevate looduslike difusiooni molekulide alginaatkihile ja leidsime, et molekulmassiga 70 kDa ei difundeeruda läbi Alginaat. Seega on alginaadi rakkude kasvatamine sobiv maatriksi biosünteesi reguleerimiseks ja ECM-i korraldamiseks. Kättesaadavust kasvatatud rakkudele alginaatkihile võimaldab toime uurimiseks peptiidi regulatiivteguritesse ja raviaineid transkriptsiooni posttranskriptsioonilist ja translatsiooni tasemel.

Kondrotsüüte kasvatatakse ka kollageenikiudude I ja II tüüpi maatriksis. S. Nehrer jt (1997) võrdlesid operatsiooni koertel kondrotsüütkoostisosadele proteoglükaani peale Kollageeniga polümeeri sisaldavat maatriksit kollageenid erinevat laadi. Nad leidsid olulisi erinevusi morfoloogia biosünteetiline funktsioone kondrotsüütidest kultiveeriti kollageenimaatriksiks sisaldas tüüpi kollageeni I ja II. II tüüpi kollageeni maatriksis olevad rakud sulatasid oma sfäärilise kuju, samas kui I tüüpi kollageenil oli neil fibroblasti sarnane morfoloogia. Pealegi, II tüüpi kollageeni maatriksis tekitasid kondrotsüüdid rohkem glükosaminoglükaane. J. Van Susante ja kaastöötajad (1995) võrdlesid omadused kondrotsüütidest kultiveeriti Alginaat ja kollageeni (I tüüpi) geeli. Autorid leidsid oluliselt suurenenud arvu rakud kollageeni geeli, kuid 6. Päeval kasvatamise, rakud kaotanud oma iseloomulikud fenotüüp, muutunud fibroblastilaadsete rakke. Alginaadi geelis täheldati rakkude arvu vähenemist, kuid kondrotsüüdid säilitasid oma normaalse fenotüübi. Kollageeni kogus geeli proteoglükaanidele raku kohta olid oluliselt suuremad kui alginaatkihile, kuid langust täheldati geelmaatriksis elementide sünteesi alates 6. Päevast kasvatamist, arvestades alginaati sünteesi jätkunud.

Tahke kolmemõõtmelise fibriinmaatriksile on looduslik aine, mis toetab selles suspendeeritud kondrotsüüdist diferentseeritult fenotüüpi. 3D-fibriini maatriksit saab kasutada ka kondrotsüütide siirdamise kandurina. Fibrini eelised on tsütotoksilisuse puudumine, ruumi täitmise võime ja liimivõime. Histoloogilise ja biokeemilised uuringud Autoren-diografii elektronmikroskoopia näitasid, et kondrotsüütide fibriini geelid säilitavad oma morfoloogia, paljunevad ja toota maatriksi isegi pärast 2-nädalast viljelemiseks. Kuid G. Homminga jt (1993) teatasid, et pärast 3-päevast kultiveerimist algab lagunemine fibriini edenedes dediferentseerimist kondrotsüütidest.

Kondrotsüütide suspendeerimine kunstlikus (sünteetilises) ECMis

Kõhre implantaadid rekonstruktiivseks või ortopeedilisteks kirurgilisteks operatsioonideks võib saada isoleeritud kondrotsüütide kasvatamise teel in vitro sünteetilise bioloogiliselt sobivas maatriksis.

Kultiveeritud polüglükoolhappe kondrotsüüdid prolifereeruvad ja säilitavad normaalse morfoloogia ja fenotüübi 8 nädala jooksul. Kondrotsüüt-polüglükoolhappesüsteem koosneb rakkudest, glükosaminoglükaanidest, kollageenidest ja sellel on välimine kollageenikapsel. Kuid sellistes implantaatides on kahte tüüpi kollageeni molekule - I ja II. Implantaadid dediferentseeritud kondrotsüütidest seeria läbipääsud on suurem summa glükoosaminoglükaanidest ja kollageeni kui implantaadid diferentseerumata esmane kondrotsüütidest.

L. Freed jt (1 993b) võrreldes käitumist kondrotsüüdikultuuride inimese ja veise kiuline polügükoolhape (EQAP) ja ebakõla polilaktilovoy happe (PPLC). Pärast HSVG või PPLC pulli kondrotsüütide kasvatamist 6-8 nädala jooksul täheldasid autorid raku proliferatsiooni ja kõhre maatriksi regeneratsiooni. HSBC-s olid kondrotsüüdid sfäärilised, asetsevad kõhremaatriksiga ümbritsetud läänides. Pärast in vitro kultuuri 8 nädala möödumist sisaldas regenereeritud kude kuni 50% kuivainest (4% rakumassist, 15% glükoosaminoglükaanist ja 31% kollageenist). PPLK rakkudes oli spindelikujuline, väike kogus glükoosaminoglükaane ja kollageeni. HSBC rakkude kasv oli 2 korda intensiivsem kui PTCA korral. In vivo tingimustes tekitas HPVC ja PPLC kasvatatud kondrotsüüdid 1 kuni 6 kuud kudede histoloogiliselt sarnase koega. Implantaadid sisaldasid glükosaminoglükaane, tüüp I ja II tüüpi kollageenid.

Loote-pull-kondrotsüüte kultiveeriti poorse suure tihedusega hüdrofoobse ja hüdrofiilsesse polüetüleeni. Pärast 7-päevast inkubatsiooni mõlemas substratis säilitasid rakud sfäärilise kuju, mis sisaldas peamiselt II tüüpi kollageeni. Pärast 21-päevast kasvatamist selgus, et hüdrofiilne maatriks sisaldab rohkem II tüüpi II tüüpi kollageeni kui hüdrofoobne maatriks.

Kõhrkoe võib saada ka Millicell-CM-i filtrite monokihist kasvatamise teel. Kondrootide kinnitamiseks on vaja kollageeniga filtreid eelnevalt katta. Kultuuri histoloogiline uurimine näitab kondrotsüütide akumulatsiooni EKG-s, mis sisaldab proteoglükaane ja II tüüpi kollageeni. Kollageeni I tüüpi sellises kultuuris ei tuvastata. Saadud kõhulahtistel kroonilistel kondrotsüütidel on sfääriline kuju, kuid koe pinnal on nad mõnevõrra lamestunud. Uue kujuga koe paksus aja jooksul suurenes ja sõltub rakkude monokihi algsest tihedusest. Optimaalsetel kultiveerimistingimustel saavutas kõhrkoe paksus 110 um, tema rakkude ja kollageeni pinna ja sügavate kihtide struktuur sarnaneks liigesekõhrele. VKM sisaldab ligikaudu 3 korda rohkem kollageeni ja proteoglükaane. Pärast 2-nädalast kasvatamist täheldati maatriksi-sa kuhjumist, mis võimaldas kudede eraldamist filtrist ja selle kasutamist siirdamiseks.

Sims jt (1996) uuris kondrotsüütide kasvatamist polüetüleenoksiidi-geeliga kapseldatud polümeermaatriksis, mis võimaldab suurel hulgal rakke süstida. Kuus nädalat pärast atüümiliste hiirte nahaalusesse koesse süstimist moodustati uus kõhr, mida morfoloogiliselt iseloomustab valge opalestsents, mis sarnaneb hüalinakõhest. Histoloogiliste ja biokeemiliste uuringute andmed näitasid aktiivselt proliferatiivseid kondrotsüüte, mis toodavad ECM-i.

Selgitus

Eksplanteerimine kõhre kasutatakse uurimiseks analoogset ja katabolismi see, säilitades gomeosta üle resorptsioonisüvendid ja heastamist. Chondrocytes kõhre eksplantaatides hoiti normaalse fenotüübi ja koostis ECM, selliseid nagu liigesekõhre in vivo. Pärast 5-päevast kasvatamist seerumi manulusel saavutatakse pidev sünteesiaste ja looduslik lagunemine. Resorptsiooni võib kiirendada koekultuuri, põhiliselt kultuuri lisandiga seerumi kasutades mitmeid aineid, nt IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivaadid Retinoolhappe või aktiivsete hapnikuradikaalide. Uurimaks remondiettevõtjatega kõhre kahjustus on indutseeritud lahustuva põletikuliste vahendajate (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) või füüsilise rebend maatriksis.

Organotüüpiliste kultuuride meetod on mudel, mis võimaldab uurida isoleeritud välistegurite in vitro mõjusid kondrotsüütidele ja ümbritsevale maatriksile. In vivo on kondrotsüüdid ECMis harva asuvad ja ei puutu üksteisega kokku. Eksplantaalse liigesekõhre kultuuri säilitab see struktuuriline struktuur, samuti kondrotsüütide ja nende ümbritseva ekstratsellulaarse keskkonna spetsiifiline koostoime. Seda mudelit kasutatakse ka mehaanilise stressi, farmakoloogiliste ainete, kasvufaktorite, tsütokiinide, hormoonide mõju uurimiseks kõhre metabolismile.

Kõhrekoe seletuse teine eelis on kondrotsüütide kahjustuse puudumine proteolüütiliste ensüümide või mehhaanilise teguriga, mis on vältimatu, kui rakud on eraldatud. Retseptorid ja muud membraanivalgud ja glükoproteiinid on kaitstud kahjulikest teguritest.

[17], [18], [19], [20], [21]

Kondrantide kultuur

Hondron - strukturaalsete, funktsionaalsete ja metaboolne liigesekõhre ratas koosneb kondrotsüütkoostisosadest peritsellulaarse maatriksi ja kompaktset hõõgniidi kapsli ning vastutab homeostaasi maatriksi. Kondrone eemaldatakse mehhaaniliselt kõhrist ja kogutakse mitme järjestikuse madala kiirusega homogeniseerimise teel. Eraldatud tsoonides erineva sügavusega hondrony kõhre võib jagada nelja kategooriasse: lihtne hondron, paaris hondrony, mitmekordne (kolm või enam) lineaarselt paigutatud hondrony (kolonn hondronov) hondronov ülekoormust.

Üksik hondrony tavaliselt leitud keskmiste kihtide peale puutumatu kõhre, paaris - piiril keskelt ja sügav kihid lineaarselt paigutatud mitu hondrony tüüpiline alumistes kihtides Puutumatu kõhre. Lõpuks hondronov klastrite koosneb juhuslikult organiseeritud grupid ühe ja kahe hondronov et säilitada koondatud riigi pärast homogeniseerimine. Hondronov klastrid võivad suured kõhre fragmendid, tavaliselt koosnevad mitmest radiaalselt hondronov ja kollageeniifbrillide, t. E. Tüüpiline korralduse, mis on iseloomulik alumistes kihtides maatriksi. Kondrid on immobiliseeritud läbipaistvas agaroosis, mis võimaldab uurida nende struktuuri, molekulaarse koostise ja metaboolset aktiivsust. Hondron süsteem - agaroos pidada mikro mudel kõhre, mis erineb traditsioonilisest süsteemist kondrotsüütkoostisosadest - agaroos, mis säilitab loodusliku mikrokeskkonna, ei ole vaja läbi viia selle sünteesi ja koost. Hondronov kultuuri - mudelina uuring vastastikmõjust rakkudes ja maatriksi liigesekõhre normaal- ja patoloogiliste seisundite.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Surematu kondrotsüütide kultuur

Et luua püsirakuliinid, kasutades rekombinantse DNA või onkogensoderzhaschie viirused, mis võivad anda rakk "surematuks". Surematud kondrotsüüdid on võimelised lõpmatuks proliferatsiooniks, säilitades stabiilse fenotüübi. F. Mallein-Gerin jt (1995) näitasid, et onkogeense on SV40T indutseeritud proliferatsiooni hiire kondrotsüüdist mis seega jätkuvalt ekspresseerivad stabiilselt kollageenid II, IX ja XI liiki, samuti liigese- ja agrekaani sideproteiiniga. Kuid see rakuliin omandab võime sünteesida I tüüpi kollageeni kultiveerides seda monokihtkultuuri või agaroosgeelil.

W. Horton ja kaasautorid (1988) kirjeldasid immortaliseeruvate rakkude rida, millel oli madala II tüüpi kollageeni mRNA ekspressioon. Need rakud saadi muundades need hiire retroviirusega, mis sisaldab I-myc- ja y-ra-onkogeene. Seda tüüpi rakud on ainulaadne mudel liigese maatriksi interaktsioonide uurimiseks II tüüpi kollageeni puudumisel ja ka II tüüpi kollageeni sünteesi reguleerimisel.

Hondropitov kultuuri muteerunud või kustutatud geeni - mugav mudel uuring nende füsioloogiline funktsioon. See mudel sobib eriti rolli uurimiseks konkreetset kõhres maatriksi organisatsioonide või tagajärgede uurimiseks erinevate reguleerivate tegurite mõju kõhre ainevahetust. Kondrotsüüdist remote geeni sünteesiti tüüpi kollageeni IX kollageeniifbrillide laiem kui tavaline, näidates, et tüüpi kollageeni IX reguleerib läbimõõt fibrillidega. Nagu Pani peatükis 1 taasleitud geenimutatsiooni COLAI kodeeriv II tüüpi kollageeni perekondades primaarselt generaliseerunud osteoartriit. Et toime uurimiseks mutant II tüüpi kollageeni liiges maatriksi R. Dharmrvaram jt (1997) läbi transfektsiooni ( "saastumise" võõras nukleiinhape) defektne COL ₂ AI (arginiin positsioonis 519 asendatakse tsüsteiin) inimloote kondrotsüüdist in vitro.

Sokultuuride süsteem. Liiges toimib kõhr koos teiste sünoviaalmembraanide, sünoviaalvedelike, sidemete, subkondraalse luu rakkudega. Kondrotsüütide metabolismi võib mõjutada nende rakkude poolt sünteesitud mitmesugused lahustuvad tegurid. Niisiis, artriidi liigesekõhre hävitab proteolüütilised ensüümid ja vabad radikaalid, mida toodavad sünoviaalrakud. Seetõttu on välja töötatud mudeleid, mis aitavad uurida keerulisi koostoimeid kõhre ja ümbritsevate kudede vahel, mida kutsutakse kookultuuriks.

S. Lacombe-Gleise jt (1995) kultiveeriti küüliku kondrotsüüdist ja osteoblastid on kaaskultuuri süsteemi (COSTAR), milles rakud eraldati Mikropoorsest membraani (0,4 mikronit) lubab vahetada kahe rakutüüpide ilma otsese kontaktita. See uuring näitas võime osteoblastid stimuleerimiseks kondrotsüütkoostisosadele kasvu lahustuva vahendajaid.

A.M. Malfait ja kaasautorid (1994) uurisid perifeerse vere monotsüütide ja kondrotsüütide vahelist suhet. See mudel on kasulik protsesside uurimisega vahendatud tsütokiinide põletikuliste artropaatiatega (reumatoidartriit, seronegatiivsel spondüliit jt.). Mudelite autorid eraldasid rakud proteiini siduvate membraanidega, mille läbimõõt oli 0,4 urn. Uuringus leiti, et lipopolüsahhariidivabas stimuleeritud monotsüüdid välja töötatud iFNO IL-1-a, mis pärsib sünteesi kondrotsüütidest agrekaani ja aidanud kaasa halvenenud niigi sünteesiti agrekaani agregaate.

K. Tada jt (1994) loonud kaaskultuuri mudelit, mille endoteelirakkude kollageeni (I tüüpi) geeli pandi sisekambri välimisest kambrist eraldatult kondrotsüüdist paigutati poori suurus 0,4 mikronit. Välisse kambris olevast täielikust isoleerimisest tingituna moodustasid inimese endoteelirakud EGF või TGF-a juuresolekul kollageeni geeliga torud. Mõlemat tüüpi TGF-rakkude samaaegse kasvatamisega pärssiti endoteelirakkude sõltuv moodustumine endoteelirakkudes. Selle protsessi kondrotsüütide inhibeerimine oli osaliselt elimineeritud anti-TGF-beeta antikehadega. Võib eeldada, et kondrotsüütide poolt toodetud TGF-beeta surub kõhre vaskulariseerumist ise.

C. Groot jt (1994) samaaegselt kultiveeritud kondrotsüüdist hüpertroofia ja proliferatiivsed tsoonide luu 16-päevase loote hiire ajukoe viiludeks. Pärast 4 päeva kultiveerimist täheldati kondrotsüütide transdiferentseerumist osteoblastideks ja osteoidide moodustumise algust. Pärast 11-päevast viljelemist asendati osa kõhr koos luukoe ja luumetriksi osaliselt kaltsifitseeriti. Mõned ajukoe poolt toodetud neuropeptiidid ja neurotransmitterid mõjutavad osteoblastide ainevahetust või neil on retseptoreid. Nende seas võib eraldada norepinefriini, vasoaktiivse soole peptiidi, kaltsitoniini geeni, aine P ja somatostatiini seostatud peptiidi. Kondrotsüütidega kultiveeritud ajukoe tükid võivad tekitada mõnda neist teguritest, mis võivad põhjustada kondrotsüütide transdiferentsatsiooni protsessi osteoblastides.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Väliste faktorite mõju kondrotsüütide kultuuris

Hapniku pinge mõju kondrotsüütide metabolismile

Enamikul juhtudel arenevad kondrotsüütide kultuurid õhurõhu hapniku pinge tingimustes. Sellest hoolimata on hästi teada, et in vivo on hüdroksiliste tingimustega kondrotsüüdid ja hapniku pinged varieeruvad erinevate patoloogiliste seisunditega. Tähistamisprotsessi käigus täheldatakse olulisi muudatusi epifüüsi verevarustuses. Kuna vaskularisatsioon varieerub kasvuplaadi erinevates piirkondades, on nende hapniku pinge ka erinev. C. Brighton ja R. Heppenstall (1971) näitasid, et küülikute sääreluu plaadis on hapniku pinge hüpertroofilises tsoonis väiksem kui ümbritsevas kõhruses. Mõne metaboolse parameetri mõõtmine on näidanud, et kondrotsüüdid on võimelised kiiresti reageerima hapniku kontsentratsiooni kohalikele muutustele. Kõigepealt, madala hapniku pinge korral, väheneb kondrotsüütide tarbimine. Hapniku pinge vähenemine 21% -lt 0,04% -ni, glükoosi kasutuse suurenemine, glükolüüsi ensüümi aktiivsus ja piimhappe sünteesi suurenemine. Isegi madala hapniku pinge korral jääb ATP, ADP ja AMP absoluutarv stabiilseks. Need andmed näitavad kondrotsüütide metabolismi suunda, et maksimeerida energiasäästu. Sellest hoolimata muutub hüpoksia tingimustes sünteetiline aktiivsus ja seega ka hüvitamise protsessid.

Samuti mõjutab kõrge hapniku pinge kondrotsüütide metabolismi, põhjustades proteoglükaanide ja DNA sünteesi vähenemist, kõhre maatriksi lagunemist. Selliste mõjudega kaasneb üldjuhul vaba hapnik radikaalide tootmine.

Keskkonna ioonide kontsentratsiooni ja osmootse rõhu mõju kondrotsüütide funktsioonile

Looduslikus kõhre iooni kontsentratsioon on oluliselt erinema teistest kudedest: naatriumi sisaldus rakuvälises keskkonnas on 250-350 mmol, ja selle osmolaarsus - 350-450 mOsm. Kui eraldades kondrotsüütidest alates VCR ja inkubeeritakse neid standardse meedia (DMEM (Dulbecco minimaalses põhisöötmes - Dulbecco minimaalne hädavajalik keskmise) osmolaarsus - 250-280,7 mOsm) muutub järsult ümbritsevat keskkonda raku. Lisaks sellele on kaltsiumi ja kaaliumisisaldus keskmiselt madalam kui looduslikes kudedes ja anioonide kontsentratsioon on palju suurem.

Sahharoosi lisamise keskmise viib suurendada selle osmolaarsus ja indutseerib mööduvat suurenemist kontsentratsioon rakusisese H ⁺ ja anioonide kaltsiumi tsütosoolis. Sellised rakusiseseid muutusi võib mõjutada kondrotsüütide diferentseerumise ja nende metaboolse aktiivsuse protsesse. J. Urban jt (1993) leidsid, et lisamist ³⁵ 8-kohal ja ³ H-proliin isoleeritud kondrotsüüdist inkubeeriti DMEM Standardi keskmise 2-4 tundi, oli ainult 10%, et loodusliku koele. Synthesis osatähtsus haripunkti kui osmolaarsuses rakuvälises keskkonnas 350-400 mOsm äsja eraldatud kondrotsüüdist ja kõhre eksplantaatides in. Peale selle suurenes kondrotsüütide maht 30-40% pärast isoleeritud rakkude paigutamist nimetatud osmolaarsuse standardse DMEM-söötmega. Samas, kui kasvatati kondrotsüüdist alusel mittefüsioloogilises osmolaarsus 12-16 tundi, rakud kohanenud uue keskkonnaga vähendades intensiivsus nihkepinge on võrdeline biosünteesi osmolaarsuses rakuvälises keskkonnas.

P. Borgetti jt (1995) uurisid toime osmolaarsuses rakuvälises keskkonnas kasvule, morfoloogia ja biosünteesis sea kondrotsüüdist. Autorid näitasid sarnast biokeemilised ja morfoloogilised tunnused kondrotsüütidest kultiveeriti meediume osmolaarsus mOsm 0,28 ja 0,38. Kui 0,48 mOsm soolekeskkonna esimestel 4-6 tunni jooksul kultiveerimisel täheldati rakkude proliferatsiooni vähenemise ja valkude sünteesi, kuid seejärel toimus taastada nende parameetrite et lõpuks jõudnud kontrollväärtustest. Kui kultiveerides kondrotsüüdist keskkonnas 0,58 mOsm osmolaarsus rakud kaotavad võime toetada füsioloogilise osatähtsus proliferatsiooniprotsessiga ja pärast 6-päevast mitmeid kondrotsüüdist väheneb märgatavalt. Keskmise osmolaarsusega, 0,58 mosmol, on täheldatud valkude sünteesi sügavat inhibeerimist. Lisaks sellele, kui kasvatati meediume osmolaarsus mOsm 0,28-0,38 kondrotsüüdist säilitavad füsioloogilise fenotüübi kõrgemal osmolaarsus (mOsm 0,48-0,58) olulised muutused raku morfoloogia, mis avaldub kaotuse iseloomuliku fenotüübi kondrotsüüdist muundamise in fibroblastilaadsete rakud ja kaotus raku võimet montaažiga maatriksi proteoglükaanidele. Selle tulemused uuringu tulemused näitavad kondrotsüütkoostisosadele reageerimisvõimet kõikumistele piiratud osmolaalsuseks rakuvälise keskkonna.

Muude ioonide kontsentratsiooni muutus võib mõjutada kondrotsüütide biosünteesi protsesse. Seega peegeldub inkorporeerimise ³⁵ S (sulfaadid) kasvas poole võrra suurenevate kaaliumi ionikonsentraatio 5 mM (kontsentratsioon standard keskkonda DM EM) kuni 10 mm (kontsentratsioon ECM in vivo). Kaltsiumi kontsentratsioon on alla 0,5 mmol edendanud kollageeni tootmist küpsete veise kondrotsüüdist, samas kontsentratsioonis 1-2 mM (vastab sisaldusele standardses keskkonnas DM EM) põhjustas olulise vähenemise kollageeni sünteesi. Biosünteesi mõõdukas suurenemine täheldati kõrgel kaltsiumisisaldusel (2-10 mmol). VKM-valkude külge kaasatakse kondrotsüütide külge mitmesugused katioonid. Seega sisaldavad magneesium- ja mangaanioonid kinnitust fibronektiini ja II tüüpi kollageeni suhtes, samas kui kaltsiumioonid ei osale kondrotsüütide külge valkude külge. Seega uuringutulemustest kirjeldatud demonstreerida muutuste mõju rakuvälise kaaliumioonide, naatriumi, kaltsiumi ja soolekeskkonna kohta kondrotsüütkoostisosadele funktsiooni biosünteetiline inkubeeriti standardkeskonnas.

Mehaanilise stressi mõju kondrotsüütide metabolismile

Liigese immobilisatsioon põhjustab kõhre pöörduva atroofia, mis näitab mehaaniliste stiimulite vajadust ECM-i normaalse metaboolse protsessi kulgemise käes. Enamikul juhtudel kasutatakse rakukultuurimudeleid tavapärastes atmosfäärirõhu tingimustes. M. Wright ja kaasautorid (1996) näitasid, et mehaaniline keskkond mõjutab kondrotsüütide ainevahetust, sõltub rakkude reaktsioon kompressioonikoormuse intensiivsusest ja sagedusest. Eksperimendid koormust puutumata eksplantaatidel liigesekõhre in vitro demonstreeritud vähenedes valkude sünteesi ja proteoglükaanidele staatilise koormuse, dünaamilise koormuse ajal stimuleerida neid protsesse. Täpsed rakendamise mehhanisme mehaanilist koormust kõhrekahjustusi keerulised ning tõenäoliselt seotud pingutamiseks rakud, hüdrostaatilise rõhu, osmootse rõhu, elektriline potentsiaal ja rakupinnaretseptorid maatriksi molekulidega. Mõlema parameetri mõju uurimiseks on vaja luua süsteem, milles üks parameeter võib olla sõltumatult erinev. Näiteks ei pruugi ekspertabi kultuurid rakkude deformatsiooni uurimiseks sobivaks, kuid seda saab kasutada rõhu üldise mõju uurimiseks kondrotsüütide metaboolsele aktiivsusele. Kompressioon kõhre tingib rakkude deformatsioone ja kaasnes ka esinemise hüdrostaatilise rõhu gradient, elektriline potentsiaal ja vedelikuvoolu muutust füüsikalis sellistest faktoritest nagu veesisalduse maatriksi tihedus elektrilaengu tase osmootne rõhk. Rakkude deformatsiooni saab uurida, kasutades eraldatud kondrotsüüte, mis on sukeldatud agaroosi või kollageeni geelis.

Mehhilise stimulatsiooni mõju uurimiseks kondrotsüütide kultuuris on välja töötatud mitu süsteemi. Mõned teadlased kasutavad sel eesmärgil süsteeme, milles rõhku rakendatakse rakukultuurile gaasilise faasi kaudu. Näiteks JP Veldhuijzen jt (1979), kasutades atmosfäärirõhust kõrgem rõhk 13 kPa Madalamatel sagedustel (0,3 Hz) 15 minuti jooksul, täheldati suurenenud cAMP sünteesi ja proteoglükaanidele ja langetamine DNA sünteesi. R. Smith jt (1996) näitasid, et katkendliku kokkupuutega algkultuuri kondrotsüütidest pulli hüdrostaatilise rõhu (10 MPa) sagedusel 1 Hz juures 4 tundi kasvu põhjustada sünteesi agrekaani ja II tüüpi kollageeni, arvestades pidevat survet ei avaldanud mingit mõju nendes protsessides. Kasutades sarnast süsteemi M. Wright jt (1996) teatasid, et tsüklilised survet rakukultuuris seostatakse hüperpolariseerumise rakumembraani kondrotsüütidest ja aktivatsiooni Ca ²⁺ sõltuvat kaaliumikanalid. Seega tsüklilise rõhu mõjud on vahendatud ioonkanalite kaudu, mis aktiveeritakse venitamise teel kondrotsüüdi membraanis. Kondrotsüütide vastus hüdrostaatilisele rõhule sõltub rakukultuuri tingimustest ja rakendatud koormuse sagedusest. Seega tsüklilised hüdrostaatilise rõhu (5 MPa) vähendab toote koostises kohal viiakse kondrotsüütkoostisosadele monokiht sagedusel 0,05, 0,25 ja 0,5 Hz, samas sagedustel üle 0,5 Hz kaasamise kohal kõhre eksplantaat suureneb.

M. Bushmann jt (1992) teatas, et agaroosgeelis olevad kondrotsüüdid muudavad biosünteesi vastuseks staatilisele ja dünaamilisele mehaanilisele stressile samamoodi nagu kultiveeritud intaktne elund. Autorid leidsid, et mehaaniline koormus tekitab hüperosmotiseeritud stiimulit, millele järgneb pH vähenemine kondrotsüüdis.

Mehaanilise venitamise mõju saab uurida geelisse sattunud rakkude kultuuris. Pingutusjõudu saab luua arvuti abil juhitava vaakumi abil. Kui süsteem on teatav vaakum, põhjast Petri tassis rakukultuuri pikeneb teadaolevat kogust, mille maksimaalne deformatsioon kant topsi põhjas ja minimaalne keskmesse. Pikendamine edastatakse ja kultiveeritakse kondrotsüütide Petri tassis. Selle meetodi puhul Holm-vall K. Jt (1995) näitasid, et kasvatati kollageeniga (II tüüpi) geeli chondrosarcoma rakkude arv suurenes mRNA ekspressioon ja ₂ -integrina. ₂ p _r integriini on võimeline seonduma II tüüpi kollageeni. Seda peetakse mehaanoretseptoriks, kuna see interakteerub aktiini siduvate valkudega, ühendades seeläbi ECM ja tsütoskeleti.

PH-d mõjutavad kondrotsüütide metaboliidid

ECM interstitsiaalse vedeliku pH on kõhrkoe kudedes happelisem kui teistes kudedes. A. Maroudas (1980) määras liigesekõhre pH tasemel 6,9. W. Diamant ja kaasautorid (1966) leidis patoloogilistes tingimustes pH 5,5. On teada, et kondrotsüüdid elavad väikeses PO2-s, mis näitab glükolüüsi (95% kogu glükoosi metabolismi) olulist rolli nende rakkude metabolismis; Glükoliidiga kaasneb suur piimhappe kogus.

Lisaks keskkonna hapestumisele glükolüüsi produktide kaudu on olulised ka maatrikskomponendid. Suur hulk fikseeritud negatiivse laenguga ekstratsellulaarsel proteoglükaanidele modifitseerib ionic koostis: esineb kõrges kontsentratsioonis vaba katioonid (nt H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) ja madalas kontsentratsioonis anioone (näiteks O2, NPHS). Lisaks toimel mehaanilist koormust esineb väljasaatmise veest ECM, mille tulemuseks on suurenenud kontsentratsioone fikseeritud negatiivsete laengute ja meelitada rohkem katioonid maatriksis. Sellega kaasneb rakuvälise keskmise pH vähenemine, mis mõjutab rakusisese pH-d, muutes seeläbi kondrotsüütide metabolismi. R. Wilkin ja A. Hall (1995) uurisid pH toime rakuvälise ja sekeskkonnas maatriksi biosünteesi eraldati veise kondrotsüüdist. Nad täheldasid maatriksi sünteesi kahekordset modifitseerimist pH-taseme langusega. Kerget langust pH (7,4 35 S0 ₄ ja ³ H-proliini kondrotsüüdist, arvestades sügavam hapestumine (pH <7,1) pärsib sünteesil 75% võrreldes kontrollida. Sama madala pH (6,65) tekitamine ammooniumioonidega põhjustas maatriksi sünteesi vähenemise vaid 20%. Saadud tulemused näitavad, et ekstratsellulaarse maatriksi sünteesi keskmise pH väärtuse muutmist ei saa seletada ainult muutustega rakusisese keskkonna pH-s. Lisaks kondrotsüüdist on võime reguleerida rakusisese pH Na ⁺, H ⁺ soojusvaheti, Ca ⁺ -sõltuva C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS ja H ⁺ / aasi.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Kultiveerimiskeskkonna koostise mõju kondrotsüütide metabolismile

Kondrotsüütide kultiveerimissööt peab vastama katsetingimustele. Viimastel aastatel on kultiveerimistingimuste optimeerimiseks kasutatud vasika seerumit. Seerumi kasutamisel tuleks siiski kaaluda mitmeid olulisi aspekte:

• rakukultuuride välimine kasv koe perifeerist elundikultuurides,
• erinevate seeriate seerumi koostise varieeruvus,
• tundmatute komponentide olemasolu neis,
• suurenenud interferentsirisk, artefaktid erinevate bioloogiliste tegurite mõju uurimiseks rakkude metaboolsele aktiivsusele.

Viimaste näideteks on uuring EGF-i mõju kohta kõhrkoondrootsüütidele rottidel. EGF stimuleeritud inkorporeerimise ³ -tümidiini ja suurendada DNA sisaldust kultuur. See toime oli suurem kui madalal seerumi kontsentratsioonil (<1%), kuid mõju suurtes kontsentratsioonides (> 7,5%) kadus.

On hästi teada, et vasikate seerumis rikastatud DMEM sünteesi ja lagunemise tasemed on võrreldes in vivo tingimustega märgatavalt tõusnud . In vivo ja in vitro metabolismi vahelised erinevused võivad olla tingitud erinevustest sünoviaalvedeliku ja keskkonna vahel, kus rakke kasvatatakse. D. Lee jt (1997) kultiveeriti kondrotsüüdist noorpulle agaroos lehe toitekeskkonnas DMEM rikastatud 20% loote seerumit ja suur hulk Allogeense normaalse sünoviaalvedelik. Sünoviaalvedeliku esinemine keskkonnas põhjustas proteoglükaanide arvu suurenemise, kuni 80% sünoviaalvedeliku koguhulgast. Need tulemused näitavad, et sünoviaalvedelik kultuuris indutseerib ainevahetuse kiirust, mis on analoogne in vivo, kellel on kõrge sünteesi glükoosaminoglükaanidest ja madal rakkude jagunemist.

G. Verbruggen jt (1995) näitasid, et sünteesi ³⁵ S-arrpeKaHa inimese kondrotsüüdist kultiveeriti agaroos DMEM ilma seerumi oli 20-30% tasemele sünteesi täheldatud DMEM, millele oli lisatud 10% vasika seerumit. Autorid ulatuse määramiseks, mille juures IGF-1, IGF-2, TGF-P või vähenenud insuliini produktsioon agrekaani söötmega seerumit. Autorid järeldasid, et 100 ng / ml insuliini, IGF-1 või IGF-2 osaliselt piiratud sünteesi agrekaani kuni 39-53% kontrollist taset. Nende tegurite kombinatsiooniga ei ole tuvastatud ühtegi sünergilist ega kumulatiivset nähtust. Samal ajal, 10 ng / ml TGF-P kohalolekul 100 ng / ml insuliini stimuleeritud sünteesi agrekaani kuni 90% või rohkem sihttase. Lõpuks ei mõjutanud seerumi transferriin üksinda ega kombinatsioonis insuliiniga agrekaani sünteesi. Kui vasikaseerum asendati veise seerumi albumiiniga, vähenes agrekaani kogus oluliselt. Insuliini kultuuri, IGF või TGF-P keskkond rikastatakse osaliselt rakkude võimet toota agrekaanagregaate. Sellisel juhul suudavad IGF-1 ja insuliin rakukultuurides säilitada homöostaasi. Pärast 40-päevast kultiveerimist söötmes, millele oli lisatud 10-20 ng / ml IGF-1, proteoglükaani sünteesi hoiti samal tasemel või isegi kõrgem võrreldes söötmes, mis sisaldas 20% vasika seerumit. Kataboolseid protsesse kulges aeglasemalt söötmes IGF-1 kui keskmises täiendatud 0,1% albumiini lahust, kuid siiski kiirem söötmes 20% seerumit. Pikaajalistes kultuurides säilib 20 ng / ml IGF-1 stabiilne rakkude seisund.

D. Lee jt (1993) võrdlesid kompositsiooni toimet söödet (DMEM, DMEM + 20% vasika seerumit, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) DNA sünteesile kultuuri eksplantaat kõhr, monokihtkultuuri ja suspensioonina agaroosisuspensiooni . Kui kultiveeriti seerumi manulusel agaroos, täheldasid autorid kalduvust kondrotsüüdidesse suurtes klastrites. Seerumi või IGF-1-ga kasvatatud rakke hoiti ümmarguse kujuga agaroosina, mis on kokku pandud väiksetele rühmadele, kuid ei moodustanud suuri agregaate. Monokihis oli DNA süntees märkimisväärselt kõrgem seerumit sisaldavas söötmes kui IGF-1-ga rikastatud söötmes; DNA-i süntees viimases oli palju kõrgem kui riknenud keskkonnas. Kui kultiveerides kondrotsüüdist suspensioonis agaroosist kontsentreerumata kandjal ja keskmise IGF-1, mingit erinevust DNA sünteesi. Samal ajal läga kultiveerides kondrotsüüdist agaroosisuspensiooni söötmes, millele oli lisatud seerum, millega kaasnes ka suurenenud inkorporeerimise radionukleotiid ³ -tümidiini võrreldes teiste keskkondades.

Vitamiin C on vajalik kollageeni fibrillide stabiilse spiraalstruktuuri moodustamiseks osalevate ensüümide aktiveerimiseks. Askorbiinhappe suhtes puudulikud kondrotsüüdid sünteesivad hüdroksüülitud mitte-spiraalset kollageeni prekursorit, mis aeglaselt sekreteeritakse. Askorbiinhappe (50 μg / ml) sisseviimine põhjustab II ja IX tüüpi kollageeni hüdroksüülimist ja nende sekretsiooni normaalsetes kogustes. C-vitamiini lisamine ei mõjutanud proteoglükaanide sünteesi taset. Järelikult reguleeritakse kollageeni sekretsiooni sõltumatult proteoglükaanide sekretsioonist.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]