Molekulaargeneetilised meetodid pärilike haiguste diagnoosimiseks

DNA tehnoloogia meetodeid kasutatakse, et määrata lokaliseerimine konkreetses kromosoomi eest vastutava geeni päritolu teatud vormide pärilike haiguste. Kuna geen on DNA segment ja geenimutatsiooni - kahjustatud primaarstruktuuris DNA (mutatsioon on mõistetav kõigile muutused DNA järjestus, sõltumata nende asukohast ja mõju üksikute elujõulisus) seejärel sondeerimine preparaadid metafaasi patsiendi kromosoomid pärilik haigus, võimalik tuvastada patoloogilise geeni lokaliseerimine. Molekulaargeneetika meetodid loovad võimalused haiguste diagnoosimiseks muutunud DNA struktuuri tasandil, võimaldavad nad tuvastada pärilike häirete lokaliseerimist. Molekulaargeneetilised meetodid suudavad tuvastada seotud mutatsioonide asendamine isegi ühe alusega.

Kõige olulisem geeni identifitseerimise etapp on selle isoleerimine. DNA võib eraldada mis tahes tüüpi koest ja rakku sisaldavatest tuumikutest. Järgmisi etappe DNA eraldamise sisaldavad kiiret rakkude lüüsi tsentrifuugimise eemaldamisega fragmendid rakulise organellid ja membraane, ensümaatiliste hävitamine valke ja nende eraldamine lahusest fenooli ja kloroformi, DNA kontsentratsioon sademetest etanoolis.

Geneetilistel laboratooriumidel eraldatakse DNA kõige sagedamini vere leukotsüütidest, mille puhul patsiendile võetakse antikoagulantlahuse (hepariin) steriilses torus 5-20 ml venoosset verd. Seejärel eraldatakse leukotsüüdid ja töödeldakse ülaltoodud etappe.

Järgmise etapi materjali ettevalmistamine uuringut - DNA "cut" fragmentideks kohtades, kus on rangelt spetsiifilise alusjärjestusega juhtmes teostatakse bakteriaalsete ensüümide - restriktsioonendonukleaa (restriktaase). Restriktaasid tunnevad ära spetsiifilised järjestused 4-6, vähemalt 8-12 nukleotiidi viiakse kaheahelaline DNA molekuli ja selle lahutada fragmendid nende järjestuste lokaliseerida saite nimetatakse restriktsioonisaite. Number toodetud restriktsioonifragmentidena DNA määrab esinemissageduse restriktsioonisaite ja fragmendid suurus - milline on jaotus nendes kohtades piki algse DNA molekuli. Mida sagedamini asuvad restriktsioonisaidid, seda lühemad on pärast piirangut DNA fragmendid. Praegu on teada rohkem kui 500 erinevat tüüpi bakteriaalse päritoluga restriktsiooniensüümi ja iga nendest ensüümidest on teada nukleotiidide spetsiifiline järjestus. Tulevikus võib restriktsioonisaite kasutada DNA geneetiliste markeritena. Saadud DNA restriktsioonifragmentidena võib järjestada pikkus elektroforeesil agaroos või polüakrüülamiidgeele ja seega võib määrata nende molekulmass. Tavaliselt avastamiseks DNA geelis kasutavad värvumist (tavaliselt etiidiumbromiidi) ja vaatamise geelist läbivas valguses ultraviolettkiirguse. DNA lokaliseerimise asukohad on punased. Kuid inimene töötlemisel mitut DNA restriktsioonendonukleaa moodustatud nii palju fragmendid erineva pikkusega, et nad ei saa lahutada elektroforeesil, siis ei ole võimalik visuaalselt kindlaks teha isiku DNA fragmentide electrophoregram (toodetud ühtlase värvusega kogu pikkuses geel). Seetõttu kasutatakse sellises geelis soovitud DNA fragmentide identifitseerimiseks märgistatud DNA sondidega hübridisatsiooni meetodit.

Iga DNA või RNA üheahelaline segment suudab siduda (hübridiseeruda) oma komplementaarse ahelaga ja guaniin on alati seotud tsütosiini, adeniini ja tümiiniga. See on kaheahelalise molekuli moodustumine. Kui kloonitud geeni üheahelaline koopia on märgistatud radioaktiivse märgistusega, saadakse sondi. Sond on võimeline leidma DNA komplementaarset segmenti, mida seejärel hõlpsalt tuvastada raadioautograafia abil. Venitatud kromosoomide ravimile lisatud radioaktiivne proovivõtt võimaldab geeni lokaliseerida teatud kromosoomis: teatud DNA-proovid võivad Southern blottis tuvastada DNA-prooviga. Hübridiseerumine tekib siis, kui DNA katseosa sisaldab normaalset geeni. Juhul, kui esineb nukleotiidide ebanormaalset järjestust, see tähendab, et vastavad kromosoomistruktuurid sisaldavad mutantset geeni, hübridiseerumist ei teki, mis võimaldab kindlaks teha patoloogilise geeni lokaliseerimist.

DNA-sondide saamiseks kasutatakse geeni kloonimismeetodit. Sisuliselt meetod seisneb selles DNA fragmendid, mis tahes geeni või piirkonna geeni sisestatud kloonimise osakestena, tavaliselt bakteriaalse plasmiidi (ringikujuline ekstrakromosomaalsed DNA esineb bakterirakud ja veavad geene antibiootikumidele) ja seejärel bakterid millel on integreeritud inimese geeniga plasmiid, korrutatakse. Tulenevalt sünteesi protsessid on võimalik saada plasmiidi miljardeid koopiaid inimgeeni või selle osa.

Veelgi enam, DNA-koopiad, mis on märgistatud radioaktiivse märgisega või fluorokroomidega, kasutatakse sondidena uuritavate DNA molekulide kogumi otsimiseks täiendavate järjestuste seas.

Praegu on geeni mutatsioonide diagnoosimiseks DNA-proovide abil palju erinevaid meetodeid.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],