Immunoloogilised uuringud uroloogias

Uroloogilisele patsiendile immunogrammi määramine tähendab, et raviarst kahtlustab immuunsüsteemi häirete esinemist. Nende häirete tunnusteks võivad olla korduvad bakteriaalsed, viirus-, seeninfektsioonid, allergilised ilmingud, süsteemsed haigused, mida iseloomustab hulk sündroome (nakkuslik, onkoloogiline, allergiline, autoimmuunne, lümfoproliferatiivne). Ühel patsiendil võib olla mitu sündroomi. Näiteks võivad kroonilised nakkushaigused (nakkuslik sündroom) põhjustada immuunpuudulikkust ja immuunpuudulikkus võib avalduda eelsoodumusena nakkus- ja onkoloogilistele haigustele (onkoloogiline sündroom). Eelsoodumus infektsioonidele võib tekkida sekundaarse immuunpuudulikkuse taustal, mis on tekkinud lümfoproliferatiivse haiguse, näiteks leukeemia, tagajärjel. Immuunsüsteemis on kolm peamist patoloogiliste muutuste rühma:

• immuunsüsteemi ühe või teise lüli kvantitatiivne või funktsionaalne defitsiit, mis viib immuunpuudulikkuse seisundi tekkeni;
• immuunsüsteemi antigeenide äratundmise häire, mis viib autoimmuunprotsesside tekkeni;
• hüperreaktiivne või "perversne" immuunvastus, mis avaldub allergiliste haiguste tekkes.

Immunodiagnostikas on olemas sõeluuringu meetodid (1. taseme testid) ja selgitavad meetodid (2. taseme testid). Esimesed on mõeldud immuunsüsteemi häirete registreerimiseks, teised aga nende rakendamise mehhanismide kindlakstegemiseks edasise immunokorrektsiooni eesmärgil.

B-rakkude immuunsus

Sõelumismeetodid

• B-lümfotsüütide suhtelise ja absoluutse arvu määramine immunofluorestsentsi või voolutsütofluoromeetria abil, kasutades B-rakkude antigeenide vastaseid monoklonaalseid antikehi (CD19, CD20, kus CD on diferentseerumisklastrid). B-lümfotsüütide normaalne sisaldus täiskasvanutel on 8–19% leukotsüütide koguarvust ehk 190–380 rakku/μl. B-lümfotsüütide sisalduse suurenemine esineb ägedate ja krooniliste bakteriaalsete ja seeninfektsioonide, krooniliste maksahaiguste, süsteemsete sidekoehaiguste, kroonilise lümfotsütaarse leukeemia ja müeloomi korral.
• Mittespetsiifiliste immunoglobuliinide (F, M, G, E) kontsentratsiooni määramine lihtsa radiaalse immunodifusiooni, nefelomeetria või turbomeetria, radioimmunoanalüüsi või ensüümimmunoanalüüsi (ELISA) abil. Täiskasvanute normid: immunoglobuliin (Ig) A 0,9–4,5 g/l. IgM 03–3,7 g/l. IgG 8,0–17 g/l. Immunoglobuliinide kontsentratsiooni suurenemine toimub samades patoloogilistes seisundites, milles suureneb B-lümfotsüütide sisaldus. Immunoglobuliinide kontsentratsiooni vähenemine toimub kaasasündinud hüpogammaglobulineemia, immuunsüsteemi kasvajate, põrna eemaldamise, valgukaotuse, neeru- või soolehaiguste, tsütostaatikumide ja immunosupressantidega ravi korral.

Selgitavad meetodid

• Veres ringlevate immuunkomplekside määramine polüetüleenglükoolis selektiivse sadestamise teel, millele järgneb spektrofotomeetriline tiheduse test (normaalne 80-20 U). Ringlevate immuunkomplekside suurenemine on tüüpiline ägedate bakteriaalsete, seen- ja viirusnakkuste, autoimmuunhaiguste, immuunkomplekshaiguste, seerumtõve ja 3. tüüpi allergiliste reaktsioonide korral.
• Spetsiifiliste immunoglobuliinide määramine veres seoses bakteriaalsete ja viiruslike antigeenidega, deoksüribonukleiinhappe (DNA) määramine autoimmuunhaiguste korral, spermavastaste antikehade (autoimmuunne viljatus) ja neeruvastaste antikehade (püelonefriit ja glomerulonefriit) tuvastamine radiaalse immunodifusiooni või ELISA meetodil.
• Spermavastaste antikehade määramine spermas [MAR-test (segatud antiglobuliinireaktsioon)], normaalne - negatiivne tulemus.
• Immunoglobuliinide kontsentratsiooni määramine uriinis püelonefriidi ja glomerulonefriidi diferentsiaaldiagnoosimiseks (proteinuuria selektiivsus).
• IgE sisalduse määramine eesnäärme mahlas allergilise prostatiidi diagnoosimiseks radiaalse immunodifusioonimeetodi või ELISA abil.
• B-lümfotsüütide blasttransformatsiooni reaktsiooni uuring B-rakkude mitogeenile (pokeweedi mitogeen B-lümfotsüütide blasttransformatsiooni reaktsiooni stimuleerimiseks T-lümfotsüütide juuresolekul), mille normatiivne väärtus on 95–100%.

T-rakkude seos immuunsusega

Sõelumismeetodid

• Küpsete CD3 T-lümfotsüütide suhtelise ja absoluutse arvu määramine immunofluorestsentsreaktsiooni või voolutsütofluoromeetria abil, kasutades monoklonaalseid anti-CD3 antikehi. Täiskasvanute norm on 58–76% ehk 1100–1700 rakku/μl. T-lümfotsüütide arvu vähenemine viitab immuunsuse rakulise sideme puudulikkusele. See on tüüpiline mõnede sekundaarsete ja primaarsete immuunpuudulikkuste korral (kroonilised bakteriaalsed ja viirusnakkused: tuberkuloos, omandatud immuunpuudulikkuse sündroom, pahaloomulised kasvajad, krooniline neerupuudulikkus, vigastused, stress, vananemine, alatoitumus, tsütostaatikumidega ravi, ioniseeriva kiirgusega kokkupuude). T-lümfotsüütide arvu suurenemine toimub immuunhüperaktiivsuse taustal või lümfoproliferatiivsete haiguste korral. Põletiku korral T-lümfotsüütide arv esmalt suureneb ja seejärel väheneb. T-lümfotsüütide arvu vähenemise puudumine viitab kroonilisele põletikulisele protsessile.
• Lümfotsüütide alampopulatsioonide hindamine.
  • T-abistajarakkude (anti-CD4 antikehade) arvu määramine. Tavaliselt 36–55% ehk 400–1100 rakku/mcl. Nende rakkude arvu suurenemine toimub autoimmuunhaiguste, Waldenströmi tõve, siirdamisvastase immuunsuse aktiveerumise korral; T-abistajarakkude arvu vähenemine toimub krooniliste bakteriaalsete, viiruslike, algloomade põhjustatud infektsioonide, tuberkuloosi, omandatud immuunpuudulikkuse sündroomi, pahaloomuliste kasvajate, põletuste, vigastuste, alatoitluse, vananemise, tsütostaatikumidega ravi ja ioniseeriva kiirgusega kokkupuute korral.
  • T-supressorite (anti-CD4 antikehade) arvu määramine. Tavaliselt 17–37% ehk 300–700 rakku/μl. T-supressorite arvu suurenemine toimub samades tingimustes, kus T-abistajarakkude arv väheneb, ja nende vähenemine toimub samades tingimustes, kus T-abistajarakkude sisaldus suureneb.
  • Immunoregulatoorne indeks CD4/CD8, tavaliselt 1,5-2,5. Hüperaktiivsus väärtustega üle 2,5 (allergilised ja autoimmuunhaigused); hüpoaktiivsus - alla 1,0 (eelsoodumus kroonilistele infektsioonidele). Põletikulise protsessi alguses immunoregulatoorne indeks suureneb ja selle vaibumisel normaliseerub.

Selgitavad meetodid

• Looduslike tapjarakkude (NK-rakkude) arvu määramine - anti-CD16 ja anti-CD56 antikehad. CD 16 lümfotsüütide norm on 6-26%, CD56 - 9-19%. NK-rakkude arvu suurenemine toimub siirdamise hülgamise ajal, vähenemine - viirusnakkuste, vähi, primaarse ja sekundaarse immuunpuudulikkuse, põletuste, vigastuste ja stressi, tsütostaatikumidega ravi ja ioniseeriva kiirgusega kokkupuute korral.
• Interleukiin-2 retseptoriga (aktivatsioonimarker) T-lümfotsüütide arvu määramine - anti-CD25 antikehad. Norm on 10-15%. Nende arvu suurenemist täheldatakse allergiliste haiguste, siiriku hülgamisreaktsiooni, harknääre-sõltuvate antigeenide vastuse korral primaarse infektsiooni ägedas perioodis, vähenemist - samade haiguste korral, mille puhul NK-rakkude arv väheneb.
• Aktivatsioonimarkeri - II klassi histosobivusmolekuli HLA-DR - ekspressiooni uuring. Suurenenud ekspressioon esineb põletikulistes protsessides, C-hepatiidi, tsöliaakia, süüfilise ja ägedate hingamisteede haigustega patsientidel.
• Lümfotsüütide apoptoosi hindamine. Ligikaudse ettekujutuse lümfotsüütide valmisolekust apoptoosiks saab anda Fas-retseptori (CD95) ekspressiooni järgi nende pinnal ja bd-2 protoonkogeeni ekspressiooni järgi mitokondrites. Lümfotsüütide apoptoosi hinnatakse, töödeldes neid kahe fluorestseeruva värvainega: propiidiumjodiidiga, mis seondub DNA fragmentidega, ja anneksiin Y-ga, mis seondub fosfatidüülseriiniga, mis ilmub rakumembraanile apoptoosi alguses. Tulemusi hinnatakse voolutsütofluoromeetri abil. Tulemused arvutatakse erinevate värvainetega värvitud rakkude suhte põhjal. Värvimata rakud on elujõulised, ainult anneksiin Y-ga seotud rakud on apoptoosi varajased ilmingud, propiidiumjodiidi ja anneksiin Y-ga seotud rakud on apoptoosi hilised ilmingud, ainult propiidiumjodiidiga värvimine näitab nekroosi.
• T-lümfotsüütide proliferatsiooni hindamine in vitro.
  • Muutused rakkude blastogeneesis - lümfotsüütide blasttransformatsioonireaktsioon. Leukotsüüte inkubeeritakse mis tahes taimse päritoluga mitogeeniga (lektiinidega). Fütohemaglutiniini kasutatakse kõige sagedamini 72 tundi, seejärel võetakse määrdproov, värvitakse see ja loendatakse blastide arv! Stimulatsiooniindeks on transformeerunud rakkude protsendi suhe katses (kultuur fütohemaglutiniiniga) transformeerunud rakkude protsendiga kontrollrühmas (kultuur ilma fütohemaglutiniinita). Lümfotsüütide blasttransformatsioonireaktsiooni saab hinnata radioaktiivse märgise (ZN-thymdinum) lisamisega kultiveeritud rakkudesse, kuna DNA süntees suureneb rakkude jagunemise ajal. Proliferatiivse vastuse häired esinevad nii primaarsete kui ka sekundaarsete immuunpuudulikkuste korral, mis on seotud infektsioonide, vähi, neerupuudulikkuse ja kirurgiliste sekkumistega.
  • Nendes uuringutes hinnatakse aktivatsioonimarkerite (CD25, transferriini retseptor - CD71) ja II klassi peamise histosobivuskompleksi HLA-DR molekuli ekspressiooni, mis puhkeolekus T-lümfotsüütidel praktiliselt puuduvad. T-lümfotsüüte stimuleeritakse fütohemaglutiniiniga, 3 päeva pärast analüüsitakse aktivatsioonimarkerite ekspressiooni otsese või kaudse immunofluorestsentsreaktsiooni meetodil, voolutsütofluoromeetria abil, kasutades isoleeritud retseptorite vastaseid monoklonaalseid antikehi.
  • Aktiveeritud T-lümfotsüütide poolt sünteesitud mediaatorite [interleukiin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferoon jne] hulga mõõtmine radioimmunoanalüüsi või ELISA abil. Eriti oluline on hinnata γ-interferooni ja IL-4 kontsentratsiooni Th1 ja Th2 markeritena aktiveeritud kultuuride supernatandis ja raku sees. Võimaluse korral on kasulik määrata vastava tsütokiini geeniekspressiooni tootjarakus oleva maatriksi ribonukleiinhappe taseme ja vastavate tsütokiinide retseptorite ekspressiooni intensiivsuse järgi.
    
• Lümfotsüütide migratsiooni pärssimise reaktsioon. Sensibiliseeritud T-lümfotsüüdid reageerivad antigeeniga ja eritavad lümfokiine, sealhulgas lümfotsüütide migratsiooni pärssivaid tegureid. Inhibeerimise fenomeni täheldatakse mitogeenide viimisel rakukultuuri. Inhibeerimise astme hindamine võimaldab meil hinnata lümfotsüütide võimet tsütokiine sekreteerida. Tavaliselt on migratsiooni sagedus, olenevalt konkreetsest mitogeenist, 20–80%.
• NK-rakkude tsütotoksilisuse hindamine. Määratakse looduslike tapjarakkude võimet tappa K-562 erütromüeloidse liini sihtrakke. Antikehadest sõltuva tsütotoksilisuse hindamiseks kasutatakse IgG antikehadega kaetud sihtrakke. Sihtrakud märgistatakse 3H-uridiiniga ja inkubeeritakse efektorrakkudega. Sihtrakkude surma hinnatakse radioaktiivse märgise lahusesse vabanemise järgi. Tsütotoksilisuse vähenemine toimub pahaloomuliste kasvajate korral. Mõnel juhul, kui on vaja ennustada interleukiinidega ravimise efektiivsust, hinnatakse NK-rakkude tsütotoksilisust teatud tsütokiinidega inkubeerimise ajal.

Fagotsüütide funktsiooni uuring

Sõelumismeetodid

Mikroobrakkude fagotsüütide poolt imendumise intensiivsuse uuring (lateksiosakeste fagotsütoos, stafülokoki, E. coli või patsiendilt eraldatud mikroorganismide testkultuur). Hepariniseeritud vere tsentrifuugimisel eraldatakse leukotsüütide suspensioon, millele lisatakse opsoniseerimiseks IV veregrupi seerum (opsoniinid on valgud, mis võimendavad fagotsütoosi). Mikroobne suspensioon lahjendatakse, segatakse leukotsüütidega ja inkubeeritakse 120 minutit, võttes analüüsiks proovid 30, 90, 120 minutit pärast inkubatsiooni algust. Kogutud leukotsüütide suspensioonist tehakse määrdumine. Määratakse järgmised fagotsütoosi näitajad:

• fagotsüütiline indeks - rakkude protsent, mis sisenesid fagotsütoosi 30 minuti ja 120 minuti jooksul pärast inkubatsiooni; fagotsüütilise indeksi (30) standardväärtus on 94%, fagotsüütiline indeks (120) on 92%;
• fagotsüütiline arv - rakusiseselt paiknevate bakterite keskmine arv; fagotsüütilise arvu (30) standardväärtus on 11%, fagotsüütiline arv (120) on 9,8%;
• fagotsüütide arvu koefitsient - fagotsüütide arvu (30) ja fagotsüütide arvu (120) suhe; tavaliselt 1,16;
• Neutrofiilide bakteritsiidne indeks - fagotsüütides hävinud mikroobide arvu ja imendunud mikroobide koguarvu suhe; tavaliselt 66%.

Selgitavad meetodid

• Fagotsüütide bakteritsiidse võime uuring nitrosinise tetrasooliumiga (NBT) testis - NBT test. Leukotsüütidele lisatakse kollast nitrosinist tetrasooliumi värvainet. Kui neutrofiil absorbeerib värvainet, toimub vabade hapnikuradikaalide mõjul redutseerimisprotsess, mille tulemuseks on sinine värvus. Reaktsioon viiakse läbi 96-süvendilises lamedapõhjalises plaadis. Kolme esimesse süvendisse lisatakse Hanksi lahus (spontaanne NBT) koos NBT ja leukotsüütide seguga ning teise süvendisse lisatakse lateksiosakesi; segu inkubeeritakse temperatuuril 37 °C 25 minutit. Tulemused loetakse lugejal lainepikkusel 540 nm ja väljendatakse suvalistes ühikutes. Stimulatsioonikoefitsient (K _st ) arvutatakse stimuleeritud süvendite optilise tiheduse ja stimuleerimata süvendite keskmise optilise tiheduse suhtena. Tervetel inimestel on NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Adhesioonimolekulide uuring. Voolutsütofluoromeetriat kasutatakse pinnaantigeenide CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18 ekspressiooni määramiseks. Adhesioonihäirega immuunpuudulikkus avaldub korduvate infektsioonide, aeglase haavade paranemise ja mäda puudumisena infektsioonikolletes.

Komplemendi süsteemi uuring

Sõelumismeetodid

Komplemendi hemolüütilise aktiivsuse määramine on komplemendi aktiveerimise klassikalise raja uuring. Haige ja terve inimese seerumi erinevad lahjendused lisatakse antikehadega kaetud erütrotsüütidele. Hemolüütilise aktiivsuse ühik on seerumi lahjenduse pöördväärtus, mille juures hävib 50% erütrotsüütidest. Hemolüüsi astet hinnatakse fotomeetriliselt hemoglobiini lahusesse vabanemise järgi. Komplemendi hemolüütilise aktiivsuse vähenemist täheldatakse neerukahjustusega süsteemse erütematoosse luupuse, ägeda glomerulonefriidi, kombineeritud immuunpuudulikkuse, müasteenia, viirushepatiidi, lümfoomide korral ning suurenemist obstruktiivse ikteruse, Hashimoto türeoidiidi, reuma, reumatoidartriidi, nodulaarse periarteriidi, dermatomüosiidi, müokardiinfarkti, haavandilise koliidi, Reiteri sündroomi ja podagra korral.

Selgitavad meetodid

• Komplemendi komponentide määramine. Kvantitatiivne määramine viiakse läbi radiaalse immunodifusiooni ja nefelomeetria abil.
  Uuring ei ole informatiivne, kui komplemendi komponentide antigeensed omadused ei muutu.
• On kindlaks tehtud, et komplemendi Clq komponent võimendab fagotsütoosi ja vahendab rakulist tsütotoksilisust. Selle vähenemine esineb immuunkomplekshaiguste, süsteemse erütematoosluupuse, mädaste infektsioonide ja kasvajate korral.
• C3 komponent osaleb klassikalise ja alternatiivse komplemendi raja aktiveerimises. Selle kontsentratsiooni langus on seotud krooniliste bakteriaalsete ja seeninfektsioonidega, ringlevate või kudede immuunkomplekside esinemisega.
• C4 komponent osaleb klassikalise raja aktiveerimises. Selle kontsentratsiooni langus on seotud komplemendi pikaajalise aktiveerimisega immuunkomplekside poolt ja C1 inhibiitori kontsentratsiooni vähenemisega, mis kontrollib klassikalise komplemendi raja aktiveerimist. C4 puudulikkus esineb süsteemse erütematoosse luupuse korral, C4 suurenemine neeruhaiguste, siirdamise äratõukereaktsiooni, ägeda põletiku ja seedetrakti haiguste korral.
• C5a on C5 molekuli väike fragment, mis eraldub sellest komplemendisüsteemi aktivatsiooni tulemusena. Selle kontsentratsioon suureneb põletiku, sepsise, atoopiliste ja allergiliste haiguste ajal.
• Cl-inhibiitor on multifunktsionaalne faktor. See kontrollib komplemendi komponendi C1 aktivatsiooni, pärsib kallikreiini, plasmiini ja aktiveeritud Hagemani faktori, Cls ja Or proteaaside aktiivsust. C1-inhibiitori puudulikkus põhjustab angioödeemi.
• Komplemendi funktsionaalsed uuringud. Testseerum lisatakse standardseerumile, milles puudub igasugune komplemendi komponent, ja määratakse komplemendi hemolüütiline aktiivsus. Kui hemolüütiline aktiivsus ei normaliseeru, loetakse selle komplemendi komponendi aktiivsus testseerumis vähenenuks.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]